馬彥娟,牛麗丹,張建新,吳 畏,孔令宇,蔡君艷,石金河
(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診科,衛(wèi)輝 453100)
急性胰腺炎(AP)是胰腺的突發(fā)性炎癥過程,是由多種病因?qū)е乱认賰?nèi)胰酶被激活從而引發(fā)胰腺組織自身的炎癥反應(yīng)[1-2],其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,涉及多種因素,包括活化的胰酶、細(xì)胞因子和趨化因子等[3]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)過程[4]。研究顯示,AP患者及AP模型動(dòng)物的TGF-β1信號(hào)通路表達(dá)均上調(diào)[5-7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示,在AP模型大鼠血清中miRNA-216a mRNA的表達(dá)顯著升高[8-9]。
課題組前期研究結(jié)果顯示,地塞米松(DEX)對(duì)AP模型胰腺中的Notch信號(hào)通路有一定程度的影響[10],對(duì)其他信號(hào)通路,如TGF-β1/Smad/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號(hào)通路及miRNA-216a mRNA的影響還未見報(bào)道。本研究利用蛙皮素建立小鼠AP模型,進(jìn)一步探索DEX對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞保護(hù)的作用機(jī)制。
1.1儀器 全自動(dòng)生化檢測儀(日本株式會(huì)社日立制作所);LightCycler LC480 Real-Time PCR system(瑞士羅氏公司);Bio-Rad SDS-PAGE型電泳分離儀(美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司);ODYSSEY型雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國LI-COR Biosciences公司)。
1.2試藥 兔抗TGF-β1抗體(貨號(hào):ab92486),兔抗P-Smad3抗體(貨號(hào):ab40854),Smad7抗體(貨號(hào):ab216428),兔抗磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶2(P-ERK/ERK2)抗體(貨號(hào):ab17942),均購自美國Abcam公司;兔抗GAPDH抗體,美國Sigma公司;RT-qPCR試劑盒,均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。淀粉酶(AMY)與脂肪酶(LPS)檢測試劑盒,購于南京建成生物研究所;DEX(批號(hào)20140629),天津金耀藥業(yè)有限公司;蛙皮素(批號(hào)60321ES03),上海翊圣生物科技有限公司。
1.3動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性C57BL/6J小鼠60只,購于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,體質(zhì)量為25~30 g,實(shí)驗(yàn)過程經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利委員會(huì)許可,動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(豫) 2011-0001。
2.1造模 將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(10只)、AP組(25只)和DEX組(25只)。造模過程參照楊飛云等[11]實(shí)驗(yàn)方法,將蛙皮素溶于生理鹽水中制成質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1的溶液,AP組小鼠用蛙皮素腹腔注射,劑量為50 μg·kg-1,連續(xù)注射3次,每次間隔2 h;DEX組在每次注射蛙皮素后腹腔注射質(zhì)量濃度為5 μg·mL-1的DEX,1 mL·kg-1;對(duì)照組連續(xù)3次注射生理鹽水。所有小鼠均在最后1次注射后2 h處死,采集各組小鼠的血液及胰腺組織。
2.2血清中AMY和LPS的水平測定 將小鼠血液以3 000 r·min-1離心10 min,取上清液,按照試劑盒說明書操作,通過速率法對(duì)AMY和LPS的水平進(jìn)行檢測。
2.3血清促炎因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6 (IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和TGF-β1水平測定 將小鼠血液以3 000 r·min-1離心10 min,取上清液,采用Elisa法測定各組胰腺組織和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1的水平。
2.4胰腺組織中miRNA-216a mRNA表達(dá)的測定 利用RT-qPCR法檢測胰腺組織中miRNA-216a mRNA的表達(dá)。將各組小鼠的胰腺組織分別研成粉末狀后,置于1.5 mL Ep管中,加入適量的Trizol 試劑提取總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物序列由上海生工設(shè)計(jì)并合成(miRNA-216a上游引物5′-TAATCTCAGCTGGCAACTGTGA-3′,下游引物5′-TCACAGTTGCCAGCTGAGATTA-3′;內(nèi)參GAPDH上游引物5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′,下游引物5′-TGGTCCAGGGTTTCTACTCC-3′)。以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,RT-qPCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94 ℃ 30 s,變性94 ℃ 5 s、退火60 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。
2.5胰腺組織中TGF-β1、Smad7、P-Smad3和P-ERK1/ERK2的蛋白表達(dá) 利用Western Blot 法檢測各組小鼠胰腺組織中TGF-β1、Smad7、P-Smad3和P-ERK1/ERK2的蛋白表達(dá)情況。將各組小鼠胰腺組織分別研成粉末狀后移至1.5 mL Ep管中,加入適量的RIPA裂解液,離心,取上清液,利用BCA試劑盒測定蛋白濃度。利用Bio-Rad SDS-PAGE電泳分離蛋白后移至NC膜,分別加Ⅰ抗4 ℃孵育過夜,Ⅰ抗稀釋使用濃度分別為TGF-β1抗體(1∶1 000)、Smad7抗體(1∶1 000)、P-Smad3抗體(1∶500)、P-ERK1/ERK2抗體(1∶500)、GAPDH抗體(1∶10 000),加熒光Ⅱ抗室溫孵育2 h后,利用ODYSSEY雙色紅外激光成像系統(tǒng)曝光,采集圖像分析灰度值。
3.1血清中AMY與LPS水平變化 見表1。由表1可知,與對(duì)照組比較,AP組血清中AMY與LPS水平均顯著升高(P<0.01);與AP組比較,DEX組血清中二者的水平均顯著降低(P<0.05)。
表1 3組小鼠血清中AMY和LPS水平的比較
3.2小鼠胰腺組織及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β1水平 結(jié)果見表2和表3。由表2和表3可知,與對(duì)照組比較,AP組小鼠胰腺組織與血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β1水平均顯著升高(P<0.01);與AP組比較,DEX組小鼠胰腺組織與血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β1水平均顯著降低(P<0.05)。
表2 3組小鼠胰腺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β1水平比較
表3 3組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β1水平比較
3.3小鼠胰腺組織中miRNA-216a mRNA的表達(dá)結(jié)果 與對(duì)照組比較,AP組小鼠胰腺組織中miRNA-216a mRNA的表達(dá)顯著升高(2.787±0.422),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);與AP組比較,DEX組小鼠胰腺組織中miRNA-216a mRNA的表達(dá)顯著降低(2.315±0.239),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
3.4各組小鼠胰腺組織中TGF-β1、P-Smad3、Smad7和P-ERK1/ERK2的蛋白表達(dá)結(jié)果 見圖1和表4。
表4 TGF-β1、P-Smad3、Smad7和P-ERK1/ERK2蛋白在小鼠胰腺組織中的表達(dá)
由圖1和表4可知,與對(duì)照組比較,AP組小鼠胰腺組織中TGF-β1、P-Smad3和P-ERK1/ERK2的蛋白表達(dá)顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而Smad7的蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.001);與AP組比較,DEX組小鼠胰腺組織中TGF-β1、P-Smad3和P-ERK1/ERK2的蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),而Smad7的蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。
圖1 TGF-β1、P-Smad3、Smad7和P-ERK1/ERK2蛋白在胰腺組織中的表達(dá)
AP的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程,涉及眾多因素,包括活化的胰酶、細(xì)胞因子和趨化因子等[3]。轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)信號(hào)通路參與多種生理病理過程,在組織細(xì)胞的生長、發(fā)育、增殖和分化中起關(guān)鍵作用,對(duì)免疫功能、炎癥反應(yīng)等具有重要的調(diào)節(jié)作用。TGF-β有3種亞型,即TGF-β1、轉(zhuǎn)化生長因子β2(TGF-β2)和轉(zhuǎn)化生長因子β3(TGF-β3)。研究顯示,在AP模型中,TGF-β1的表達(dá)升高,其參與AP的病理過程,抑制其可減輕AP的嚴(yán)重程度[6,12-14]。激活的TGF-β1,可被下游的Smad2和Smad3蛋白識(shí)別,將信號(hào)傳遞給細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad4,最終上調(diào)Smad7的轉(zhuǎn)錄活性[15]。李永濤等[16]研究顯示,AP患者胰腺組織中TGF-β1、TNF-α和IL-6等水平均顯著升高,參與AP的病理過程。
miRNA作為一種非編碼的RNA,在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)過程中,其可通過調(diào)控靶基因的表達(dá)而發(fā)揮重要的作用[17]。在AP模型大鼠血漿中miRNA-216a mRNA的表達(dá)顯著升高,參與AP的病理過程,可作為AP診斷的潛在生物標(biāo)志[9,18-19]。
DEX是一種皮質(zhì)類固醇,具有抗炎和改善微循環(huán)的作用,臨床上應(yīng)用其治療AP[20-21]。前期研究結(jié)果顯示,DEX對(duì)AP模型動(dòng)物胰腺中的Notch信號(hào)通路及NK-κB信號(hào)通路均有一定程度的影響[10-11],它對(duì)其他信號(hào)通路,如TGF-β1/Smad/ERK信號(hào)通路及miRNA-216a mRNA表達(dá)的影響尚未見報(bào)道。
本研究結(jié)果顯示,AP組大鼠胰腺組織中miRNA-216a mRNA的表達(dá)顯著高于對(duì)照組,這與以往研究結(jié)果一致,與AP組比較,使用DEX治療后,動(dòng)物胰腺組織中miRNA-216a mRNA的表達(dá)顯著降低,說明DEX可降低AP動(dòng)物胰腺組織中miRNA-216a mRNA的表達(dá)。
本文研究了AP中DEX對(duì)TGF-β信號(hào)通路的影響,初步闡明了DEX治療AP的作用機(jī)制。使用DEX治療后,TGF-β信號(hào)通路中TGF-β1、P-Smad3及P-ERK1/ERK2的蛋白表達(dá)顯著降低,而Smad7的蛋白表達(dá)顯著升高。同時(shí),使用DEX治療后,動(dòng)物胰腺組織與血清中的TNF-α、IL-6及IL-1β、TGF-β1的水平均顯著降低,結(jié)果提示,AP發(fā)生時(shí),DEX可通過抑制TGF-β1的水平,抑制Smad3蛋白的磷酸化,進(jìn)而抑制ERK1/ERK2蛋白的磷酸化,同時(shí)促進(jìn)Smad7的表達(dá),從而抑制TGF-β1/Smad/ERK信號(hào)通路的激活;AP過程中,參與炎癥反應(yīng)的炎癥細(xì)胞因子主要有IL-1β、TNF-α、IL-6與TGF-β1等,本研究中DEX通過抑制TGF-β1/Smad/ERK信號(hào)通路的激活,減少炎癥因子的合成與釋放,減輕對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞的損傷。
Zhang J等[6]研究表明,TGF-β可調(diào)節(jié)miRNA-216a,抑制TGF-β后可抑制miRNA-216a mRNA的表達(dá),DEX是否可通過抑制TGF-β信號(hào)通路而抑制miRNA-216a,有待進(jìn)一步研究,下一步將通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究DEX的作用機(jī)制,為臨床治療AP提供參考。