HPLC法同時測定渴樂寧膠囊中7種成分及聚類分析

張 凱，韋 杏

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)管理部，沈陽 110032；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530001)

糖尿病在中醫(yī)學(xué)上屬于“消渴病”范疇，是因胰島素分泌或利用缺陷引起的代謝性疾病，可引起多系統(tǒng)損害，導(dǎo)致眼、腎、神經(jīng)、心臟、血管等組織器官出現(xiàn)慢性進(jìn)行性病變、功能減退及衰竭，嚴(yán)重危害患者的身心健康。采用中藥及其制劑的中醫(yī)治療方法能夠有效避免胰島素等化學(xué)藥物治療所引起的毒性和不良反應(yīng)，安全性好?？蕵穼幠z囊由黃芪、酒炙黃精、太子參、地黃和天花粉5味藥材組方而成，以達(dá)益氣養(yǎng)陰、生津止渴之效，對口渴多飲、五心煩熱、乏力多汗和心慌氣短等證候?qū)贇怅巸商撍碌南什』?型糖尿病臨床療效確切[1]?，F(xiàn)代研究表明，渴樂寧膠囊可降低正常小鼠和四氧嘧啶糖尿病大鼠的血糖水平，具有較強(qiáng)的耐糖作用，能夠?qū)雇庠葱云咸烟且鸬难巧?，延長甲亢陰虛型小鼠常壓缺氧存活時間[2]；可有效調(diào)節(jié)氣陰兩虛型糖尿病患者的血糖，改善患者的糖化血紅蛋白和空腹血糖水平，增強(qiáng)患者的血糖控制效果，降低發(fā)生高胰島素血癥的風(fēng)險[3]；其聯(lián)合二甲雙胍、格列齊特和甘舒霖30R可有效控制患者的血糖水平，降低機(jī)體炎癥反應(yīng)，改善機(jī)體瘦素、皮質(zhì)醇和脂聯(lián)素水平，對2型糖尿病治療效果顯著[4-6]?？蕵穼幠z囊現(xiàn)收載于《中國藥典》2020年版一部[1]，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)[7]僅對黃芪甲苷進(jìn)行了定量研究，中藥復(fù)方制劑具有成分復(fù)雜繁多性、療效協(xié)同整體性等特點，多成分質(zhì)量控制模式已成為中成藥復(fù)方制劑的發(fā)展趨勢，為更加全面科學(xué)地評價渴樂寧膠囊整體質(zhì)量，本實驗采用HPLC法對渴樂寧膠囊君藥黃芪[8-9]中的主要成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素，臣藥太子參[10-12]代表性成分太子參環(huán)肽B，佐藥地黃[13-15]主要藥效成分梓醇、地黃苷D和益母草苷的含量進(jìn)行同時測定，并采用聚類分析法對檢測結(jié)果進(jìn)行綜合評價，以期為全面評價渴樂寧膠囊的整體質(zhì)量提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；AUW-220D型電子天平(美國Shimadzu公司)；KQ-250DV型超聲波清洗器(昆山市舒美超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 對照品：毛蕊異黃酮葡萄糖苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.8%，批號111920-201907)，中國食品藥品檢定研究院；太子參環(huán)肽B(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%，批號PRF16012101)，梓醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%，批號PRF8052221)，地黃苷D(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.6%，批號PRF10012243)，益母草苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.4%，批號PRF9103142)，芒柄花苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.6%，批號PRF8081121)和芒柄花素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%，批號PRF8091225)，均購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司。渴樂寧膠囊(規(guī)格：0.45 g·粒-1，批號：190803、190807、190816、190902、191101、191103、200216、200219、200302、200305，編號依次為S1～S10)，購自威海華洋藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1混合對照品溶液 精密稱取7種成分對照品各適量，用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.114、0.958、0.332、0.494、0.416、0.238、0.852 mg·mL-1的混合對照品儲備液。精密吸取上述混合對照品儲備液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，用甲醇定容至20 mL，制成系列混合對照品溶液Ⅰ～Ⅵ；取混合對照品溶液Ⅲ作為混合對照品溶液(7種成分質(zhì)量濃度分別為5.7、47.9、16.6、24.7、20.8、11.9、42.6 μg·mL-1)。

2.1.2供試品溶液 精密稱取渴樂寧膠囊內(nèi)容物細(xì)粉1.0 g，置于25 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲45 min，放冷后用甲醇定容，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3陰性樣品溶液 按照渴樂寧膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項下處方比例及制法制備缺太子參、地黃和黃芪的陰性樣品各適量，按照2.1.2項下方法制成陰性樣品溶液。

2.2色譜條件及專屬性實驗 以乙腈(A)-2 mL·L-1磷酸(B)為流動相，梯度洗脫(0～13.0 min，15.0%A；13.0～19.0 min，15.0%A～25.0%A；19.0～35.0 min，25.0%A～42.0%A；35.0～52.0 min，42.0%A～67.0%A；52.0～60.0 min，67.0%A～15.0%A)。流速：0.9 mL·min-1；采用Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：210 nm 0～35.0 min檢測太子參環(huán)肽B、梓醇、地黃苷D和益母草苷[16-20]，254 nm 35.0～60.0 min檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素)[21]。精密吸取2.1.1項下制備的混合對照品溶液、2.1.2項下制備的供試品溶液和2.1.3項下制備的陰性樣品溶液各10 μL，進(jìn)樣檢測并記錄色譜圖，見圖1。

圖1 HPLC圖

結(jié)果顯示，渴樂寧膠囊中7種成分與相鄰色譜峰均能有效分離(分離度>1.5)；陰性樣品對渴樂寧膠囊中7種成分的同時測定無干擾；理論塔板數(shù)按各成分色譜峰計算均≥3 500。

2.3線性關(guān)系實驗 精密吸取2.1.1項下制備的系列混合對照品溶液Ⅰ～Ⅵ各10 μL，按照2.2項下色譜條件進(jìn)樣測定渴樂寧膠囊中7種成分的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、7種成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 7種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.4精密度實驗 取2.1.1項下制備的混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得7種成分峰面積的RSD值分別為1.08%、0.52%、0.97%、0.65%、0.78%、0.84%、0.61%，表明儀器精密度良好。

2.5重復(fù)性實驗 取同一批渴樂寧膠囊，按照2.1.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按照2.2項下色譜條件進(jìn)樣檢測7種成分的峰面積，計算含量及RSD值，結(jié)果7種成分含量的RSD值分別為1.87%、0.85%、1.33%、1.29%、1.71%、1.66%、1.42%，結(jié)果表明實驗重復(fù)性良好。

2.6穩(wěn)定性實驗 按照2.1.2項下方法臨用新配供試品溶液，于0、2、6、12、18、24 h進(jìn)樣，統(tǒng)計7種成分的峰面積并計算RSD值。結(jié)果7種成分峰面積的RSD值分別為1.10%、0.57%、1.02%、0.69%、0.82%、0.91%、0.59%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7回收率實驗 精密稱取含量已知的渴樂寧膠囊內(nèi)容物細(xì)粉9份，每份0.5 g，分別精密加入混合對照品溶液(7種成分質(zhì)量濃度分別為0.031、0.342、0.119、0.178、0.161、0.085、0.294 mg·mL-1)1.0、2.0、3.0 mL各3份，再按照2.1.2項下方法處理，按照2.2項下色譜條件進(jìn)樣檢測7種成分峰面積并計算含量，得7種成分的平均回收率及RSD值，見表2。

表2 渴樂寧膠囊中7種成分的回收率實驗結(jié)果 (n=9)

2.8樣品含量測定 取10批渴樂寧膠囊，每批平行3份，按照2.1.2項下方法制備供試品溶液，按照2.2項下色譜條件進(jìn)樣檢測7種成分的峰面積，計算含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果

2.9聚類分析 采用SPSS 26.0軟件對10批渴樂寧膠囊進(jìn)行聚類分析，見圖2。由圖2可知，10批樣品聚為3類，樣品S7、S10、S9和S8聚為第Ⅰ類，樣品S1、S4、S2和S3聚為第Ⅱ類，樣品S5和S6聚為第Ⅲ類?？蕵穼幠z囊中7種成分含量存在一定的批間差異，原藥材的產(chǎn)地來源、采收時節(jié)等可能為引起含量差異的主要因素。

圖2 10批渴樂寧膠囊聚類分析樹狀圖

3 討論

3.1流動相的選擇 本實驗在選擇流動相時，考慮到目標(biāo)成分太子參環(huán)肽B、梓醇、地黃苷D和益母草苷有紫外末端吸收，而甲醇在低波長的檢測條件下存在紫外吸收，故有機(jī)相選用乙腈，參考相關(guān)文獻(xiàn)對比考察了乙腈-水[16-19，21-22]和乙腈-2 mL·L-1磷酸[20]流動相體系。結(jié)果顯示，以乙腈-水為流動相時，基線漂移嚴(yán)重，影響檢測；以乙腈-2 mL·L-1磷酸為流動相時，基線相對平穩(wěn)，7種成分色譜峰分離度均符合要求，通過進(jìn)一步對有機(jī)相與水相的比例進(jìn)行優(yōu)化，最終采用2.2項下的洗脫比例進(jìn)行梯度洗脫對渴樂寧膠囊中7種成分的含量進(jìn)行同時檢測。

3.2提取條件的選擇 在供試品溶液制備方法的選擇時，分別選取甲醇[16-18，20]、體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇[19]、體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇[21-22]和體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇[23]對比考察不同提取溶劑對渴樂寧膠囊中7種成分的綜合提取率的影響，結(jié)果以甲醇為提取溶劑時，7種成分的綜合提取率最佳，雜質(zhì)成分干擾較小。同時結(jié)合渴樂寧膠囊生產(chǎn)工藝和相關(guān)文獻(xiàn)，對超聲[8-12]提取時間(30、45、60 min)進(jìn)行優(yōu)化，最終采用甲醇超聲45 min對供試品進(jìn)行處理。

本實驗采用HPLC法對渴樂寧膠囊中7種成分的含量進(jìn)行了同時測定，首次建立了渴樂寧膠囊多指標(biāo)成分質(zhì)量評價模式，同時采用聚類分析法對定量測定結(jié)果進(jìn)行分析評價。所建立的方法操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好。由表3可知，7種成分含量存在批間差異，尤其地黃苷D、太子參環(huán)肽B和益母草苷較為明顯，表明建立多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式對全面控制該制劑的整體質(zhì)量尤為重要。聚類分析結(jié)果提示，藥品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)關(guān)注原藥材質(zhì)量控制、完善原藥材內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、降低制劑批間質(zhì)量差異、確保產(chǎn)品質(zhì)量和臨床療效的一致性。