HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定舞陽(yáng)貝母中9種核苷類成分的含量

李 珊，王曉燕，黃 霞，張紅偉*，劉 菊，趙一擎，茹慶國(guó)

(1.河南省食品藥品檢驗(yàn)所，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450018；2.鄭州市中醫(yī)院，鄭州 450007)

貝母為百合科貝母屬多種植物的鱗莖，是常用中藥之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“味辛，平。主傷寒煩熱；淋瀝邪氣；疝瘕；喉痹；乳難；金創(chuàng)風(fēng)痙?！盵1]。百合科(Liliaceae)貝母屬(FritillariaL.)植物的多數(shù)種類可供藥用，廣泛分布于北歐、北美洲及亞洲溫帶地域。我國(guó)貝母屬植物資源豐富，約有50個(gè)種類、19個(gè)變種，主要分布于浙江、四川、新疆、甘肅、湖北和安徽等省[2]?！吨袊?guó)藥典》2015年版一部中收載了川貝母、浙貝母、平貝母、湖北貝母和伊貝母等藥用貝母，全國(guó)各地用作貝母的原植物種類繁多，川貝母野生資源日漸枯竭，各地均有替代品[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，貝母具有抑菌[4]、鎮(zhèn)咳[5-8]、平喘[9-12]和抗腫瘤[13-17]等作用。

舞陽(yáng)貝母為百合科植物舞陽(yáng)貝母FritillariawuyangensisZ.Y.Gao的干燥鱗莖或鱗葉，于1983年在河南省野生經(jīng)濟(jì)植物資源考察中被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已收入《河南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》，中藥材名為“貝母”。舞陽(yáng)貝母主要分布在河南省舞鋼市、駐馬店市、南陽(yáng)市和信陽(yáng)市等地，為河南省特有的藥材資源，生于海拔230～700 m的山坡草叢或疏林草地，舞鋼市為其分布中心，現(xiàn)已人工栽培，療效確切，有較長(zhǎng)的栽培和使用歷史[18]。但是，舞陽(yáng)貝母的基礎(chǔ)研究相對(duì)薄弱，特別是對(duì)其化學(xué)成分的研究較少。貝母的水溶性活性成分主要為核苷類，現(xiàn)有研究多針對(duì)其核苷類成分進(jìn)行含量測(cè)定[19-29]。核苷類物質(zhì)是生物機(jī)體細(xì)胞維持生命活動(dòng)的基本組成成分，具有多種生物活性[30]，可作為舞陽(yáng)貝母的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。本文建立能同時(shí)測(cè)定舞陽(yáng)貝母中9種核苷類成分的高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-DAD)法，為舞陽(yáng)貝母的進(jìn)一步開發(fā)利用和質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 Agilent1260型高效液相色譜儀，Agilent DEAA311731型(二極管陣列檢測(cè)器)，XPE205型萬(wàn)分之一電子天平(瑞士梅特勒托利多公司)；KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Mili-Q Advantage A 10型超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

1.2試藥 甲醇為色譜純(德國(guó)默克股份兩合公司)；超純水，自制。舞陽(yáng)貝母樣品經(jīng)河南省食品藥品檢驗(yàn)所雷留成主任藥師鑒定為百合科植物舞陽(yáng)貝母FritillariawuyangensisZ.Y.Gao的干燥鱗莖或鱗葉。尿嘧啶(批號(hào)100469-201302，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.6%)，次黃嘌呤(批號(hào)140661-200402，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%)，尿苷(批號(hào)887-200202，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100.0%)，腺嘌呤(批號(hào)110886-200001，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100.0%)，鳥苷(批號(hào)111977-201501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.6%)，腺苷對(duì)照品(批號(hào)110879-200202，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100.0%)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。胞苷(批號(hào)TI180107-17，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%)，胸苷 (批號(hào)ML190825-06，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%)，2′-脫氧腺苷對(duì)照品(批號(hào)AL181124-13，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%)，均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。9批舞陽(yáng)貝母樣品信息見(jiàn)表1。

表1 舞陽(yáng)貝母的樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為YMC-Triart C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫(0～10 min，1%A～5%A；10～15 min，5%A～15%A；15～20 min，15%A～20%A；20～40 min，20%A～60%A)。柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液 精密稱取9種成分對(duì)照品各適量，加水溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為118.325、101.528、103.356、101.520、102.400、91.653、109.760、111.520、119.717 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，于4 ℃冰箱內(nèi)保存，備用。

2.2.2供試品溶液 精密稱取樣品粉末1.5 g，過(guò)3號(hào)篩，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加水10 mL，搖勻，稱定質(zhì)量，室溫下超聲提取60 min(功率300 W，頻率50 kHz)，取出放冷至室溫，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，倒入離心管中，以8 000 r·min-1離心5 min，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，供試品中各相鄰色譜峰之間分離度除8號(hào)峰為1.4外，其余色譜峰分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于10 000，分離度良好，色譜圖見(jiàn)圖 1。

圖1 HPLC圖

2.4線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液0.1、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、20.0 mL，分別置于7個(gè)20 mL量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，搖勻，制成系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄其色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行線性回歸，建立回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 9種核苷類成分的線性方程和線性范圍

2.5精密度實(shí)驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄9種成分的峰面積，計(jì)算得到其RSD值分別為1.23%、1.05%、0.85%、0.34%、0.67%、0.29%、0.34%、0.48%、0.98%，表明儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取樣品(批號(hào)2019050802)粉末6份，每份1.5 g，按照2.2.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定9種核苷類成分的含量，結(jié)果9種成分的RSD值分別為1.57%、1.86%、2.11%、0.98%、1.84%、1.49%、1.95%、1.36%、1.77%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下制備的供試品溶液(批號(hào)2019050802)，分別于0、2、4、8、12、24、36 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果9種成分峰面積RSD值分別為0.91%、0.68%、0.87%、0.77%、0.94%、0.67%、0.75%、0.96%、0.72%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取9種對(duì)照品各適量，分別加水溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為49.10、10.82、9.18、541.83、29.18、420.36、200.12、301.17、130.18 μg·mL-1的單一對(duì)照品溶液，備用。精密稱取含量已知的樣品(批號(hào)2019050802)共6份，每份0.75 g，分別精密加入上述單一對(duì)照品溶液各1 mL，加水至10 mL，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定含量，并計(jì)算回收率及RSD值，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.9樣品含量測(cè)定 按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

3 討論

3.1提取條件的選擇 核苷類物質(zhì)極性較大，在有機(jī)溶劑中溶解性差，在供試品制備時(shí)考察了以下因素：不同提取溶劑(純水以及體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%的甲醇)，不同溶劑用量(10、20、30 mL)，不同提取方法(超聲和回流)，不同提取時(shí)間(30、60、90 min)，發(fā)現(xiàn)10 mL純水超聲處理60 min的結(jié)果與加熱回流結(jié)果基本一致，提取率最高，且操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，故選擇加水10 mL超聲處理60 min的方法制備供試品溶液。

3.2色譜條件的優(yōu)化 本文比較了5種不同色譜柱：YMC-Triart C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Waters-Symmetrm C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agela-Venusil XBP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、JADE-PAKRS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，分別用甲醇和乙腈作為流動(dòng)相，在不同的梯度洗脫條件下進(jìn)樣，也比較了不同進(jìn)樣量(5、10、15 μL)，不同流速(0.5、0.8、1.0 mL·min-1)，不同柱溫(25、30、35 ℃)，最終根據(jù)色譜圖基線、出峰數(shù)量、理論塔板數(shù)及分離度確定了2.1項(xiàng)下的色譜條件。

3.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 采用DAD檢測(cè)器在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)對(duì)照品及樣品進(jìn)行掃描，綜合考慮不同波長(zhǎng)下色譜峰的數(shù)量、紫外吸收、分離度和峰面積大小，最終選用260 nm作為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4測(cè)定結(jié)果分析 由表4測(cè)定結(jié)果可知，不同批次的舞陽(yáng)貝母樣品中9種核苷類成分含量差異較大，其中各批次中次黃嘌呤的含量普遍較低，鳥苷含量普遍較高。另外，本文采用的9批舞陽(yáng)貝母樣品是由3種不同產(chǎn)地加工方法加工而成，分別是硫磺熏蒸、傳統(tǒng)炕制和烘箱烘干，由測(cè)定結(jié)果中9種核苷類成分的總含量可知，烘箱烘干的樣品含量最高(1 876.33～2 257.12 μg·g-1)，其次是傳統(tǒng)炕制(1 390.18～1 578.36 μg·g-1)，硫磺熏蒸的樣品含量最低(1 007.22 μg·g-1)，可見(jiàn)不同產(chǎn)地加工方法對(duì)9種核苷類成分總含量影響較大，烘箱烘干損失較小，而硫磺熏蒸損失較大。舞陽(yáng)貝母樣品(批號(hào)2019080704)產(chǎn)地加工方法為硫磺熏蒸，9種核苷類成分總含量最低，且次黃嘌呤未檢出，有文獻(xiàn)報(bào)道顯示，硫磺熏蒸不僅可使中藥材及飲片殘留大量的二氧化硫，還伴有復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致多種有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和含量發(fā)生改變[31-32]，由此推測(cè)，硫磺熏蒸處理可能導(dǎo)致舞陽(yáng)貝母樣品中次黃嘌呤含量普遍較低，樣品(批號(hào)2019080704)各成分含量普遍下降、9種核苷類成分總含量下降且次黃嘌呤未檢出。硫磺熏蒸對(duì)中藥核苷類成分的影響及其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

目前，對(duì)舞陽(yáng)貝母化學(xué)成分的基礎(chǔ)研究仍然很少，作為河南特色藥材，其在民間傳統(tǒng)用法是水煎劑，探討舞陽(yáng)貝母的水溶性核苷類成分，對(duì)考察其質(zhì)量，保證其臨床用藥的穩(wěn)定性和有效性具有重要意義。本文首次建立了舞陽(yáng)貝母藥材中9種核苷類水溶性成分的含量測(cè)定方法，使其水提取物中9種核苷類成分得到很好的分離，且精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均較好，為舞陽(yáng)貝母的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。