芪參還五膠囊的制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

王世信，楊美娜，崔友祥，閆國(guó)強(qiáng)，丁洪青

(1.河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥藥學(xué)部，滄州 061001；2.河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腦病三科，滄州 061001)

芪參還五膠囊是河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院院內(nèi)制劑，是由經(jīng)方“補(bǔ)陽(yáng)還五湯”與“桃紅四物湯”合用加減化裁而來(lái)[1]，在該院作為協(xié)定處方使用多年，后開發(fā)成為醫(yī)院制劑。該方由黃芪、太子參、桃仁、紅花、當(dāng)歸、赤芍、川芎、地龍、全蝎和水蛭等19味中藥制成，具有補(bǔ)氣活血、祛瘀通絡(luò)、息風(fēng)化痰和清熱養(yǎng)陰的功效[2]，主治氣虛血瘀、痰熱蘊(yùn)結(jié)所致的冠心病、腦卒中、卒中后遺癥等，均有良好的療效與安全性[3-4]。本研究對(duì)芪參還五膠囊的制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究，以保證該制劑臨床用藥的安全性及質(zhì)量可控性。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-10AVP Plus型高效液相色譜儀(日本島津公司)；Hypersil ODS2 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，大連依利特公司；AG 135型電子分析天平(Mettler Toledo公司)；HWS-28型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；BJ-3型升降式崩解時(shí)限測(cè)試儀(濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司)；硅膠 G薄層版(青島海洋化工廠)；Arium?pro應(yīng)用型超純水系統(tǒng)(德國(guó)Sartorius公司)。

1.2試藥 清半夏藥材，購(gòu)自山東百味堂藥業(yè)有限公司；其他藥材均購(gòu)自安徽友信藥業(yè)有限公司；以上藥材均經(jīng)滄州市藥檢所鑒定，符合《中國(guó)藥典》2015年版各藥材項(xiàng)下規(guī)定。黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)110781-201717)、芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)110736-201943)、阿魏酸對(duì)照品(批號(hào)110773-201915)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品(批號(hào)111920-201907)、大黃對(duì)照藥材(批號(hào)120902-201912)和水蛭對(duì)照藥材(批號(hào)121061-201806)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。3批芪參還五膠囊(批號(hào)分別為190522、190601、190615)，均由河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥藥學(xué)部自制。水為超純水(實(shí)驗(yàn)室自制)；乙腈、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純，均購(gòu)自上海科旺化學(xué)試劑有限公司。

2 芪參還五膠囊的制備工藝優(yōu)化

2.1芪參還五膠囊處方組成 黃芪120 g，太子參80 g，桃仁40 g，紅花48 g，當(dāng)歸40 g，赤芍48 g，川芎40 g，玄參48 g，石決明48 g，鉤藤48 g，麥冬40 g，牛膝40 g，大黃40 g，連翹48 g，地龍40 g，水蛭40 g，膽南星60 g，清半夏32 g，全蝎24 g。

2.2芪參還五膠囊的工藝優(yōu)化 考慮到處方中各藥味有效成分的理化性質(zhì)及生產(chǎn)制備、臨床應(yīng)用的實(shí)際情況，以最大限度保留有效成分為原則，擬對(duì)處方中的一部分藥材進(jìn)行煎煮提取，另一部分則以生粉入藥。

2.2.1藥材出粉率的考察 方中大黃有瀉下逐瘀的作用，為了充分發(fā)揮其瀉下功效，宜粉碎生用[5]；水蛭發(fā)揮破血逐瘀功效的主要成分為生物酶，不宜加熱，故將藥材單獨(dú)粉碎備用[6]；膽南星、清半夏粉性較強(qiáng)，為便于制劑，需粉碎入藥[7]；全蝎、太子參相對(duì)較貴重，為發(fā)揮最大藥用價(jià)值，留粉備用[8]。分別按照處方量稱取上述藥材，各3份，置于粉碎機(jī)中粉碎后，過(guò)100目篩，計(jì)算各藥材出粉率。結(jié)果見表1。

表1 出粉率的考察

2.2.2煎煮藥材提取工藝優(yōu)化

2.2.2.1正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定影響水煎煮的3個(gè)主要因素分別為：加水倍數(shù)、提取時(shí)間和提取次數(shù)。采用L9(34)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，各因素設(shè)3個(gè)水平，見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平

2.2.2.2正交實(shí)驗(yàn) 按照處方量分別稱取黃芪、桃仁、紅花、當(dāng)歸、赤芍、川芎、玄參、石決明、鉤藤、麥冬、牛膝、連翹和地龍13味水煎煮藥材，共9份。在平行條件下，參照表2進(jìn)行提取，提取液合并后濃縮至浸膏，再放入烘箱中105 ℃干燥3 h，制得干膏。以干膏得率、芍藥苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選最佳提取工藝，3個(gè)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)分別定為0.30、0.35、0.35。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

由表3和表4可知，對(duì)水煎煮工藝的影響因素順序?yàn)椋禾崛〈螖?shù)(C)>提取時(shí)間(B)>加水倍數(shù)(A)，其中提取次數(shù)對(duì)水煎煮工藝的提取效果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而加水倍數(shù)和提取時(shí)間2個(gè)因素差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)及方差分析結(jié)果，得出最佳水煎煮的工藝條件為A2B3C3。本著降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率的原則，結(jié)合綜合評(píng)分結(jié)果，可將單次提取時(shí)間縮減為1.5 h，得出最佳水煎煮工藝條件為A2B2C3，即藥材加水煎煮3次，每次加8倍量水，煎煮1.5 h。

2.2.2.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照處方量分別稱取上述13味水煎煮藥材，共3份，按照篩選出的最佳水煎煮工藝條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5。由表5可知，3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的干膏得率、芍藥苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量結(jié)果均較穩(wěn)定，提示該水煎煮工藝穩(wěn)定、可行。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)對(duì)芪參還五膠囊的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定了其最佳制備工藝：取黃芪、桃仁、紅花、當(dāng)歸、赤芍、川芎、玄參、石決明、鉤藤、麥冬、牛膝、連翹和地龍13味藥材，加水煎煮3次，每次加8倍量水，煎煮1.5 h，合并3次水煎液，濾過(guò)，將濾液濃縮至相對(duì)密度為1.25；以水蛭、膽南星、清半夏、全蝎、太子參和大黃分別粉碎后(過(guò)100目篩)的生藥粉收清膏，置于烘箱中105 ℃烘干，將所得干膏粉碎成細(xì)粉，裝膠囊，即得。

3 芪參還五膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

3.1性狀檢查 本品為硬膠囊，內(nèi)容物為黃棕色粉末，氣微腥，味苦、澀。

3.2質(zhì)量檢查

3.2.1裝量差異 參照《中國(guó)藥典》2015年版一部[9]附錄0103膠囊劑項(xiàng)下要求，取本品10粒，分別精密稱定每粒質(zhì)量和膠囊殼質(zhì)量，求得內(nèi)容物質(zhì)量與平均裝量，計(jì)算得裝量差異在±10%范圍內(nèi)，符合規(guī)定。

3.2.2水分 參照《中國(guó)藥典》2015年版一部[9]附錄0832水分測(cè)定法要求，取本品膠囊內(nèi)容物進(jìn)行水分測(cè)定，結(jié)果均<9.0%，符合規(guī)定。

3.2.3崩解時(shí)限 參照《中國(guó)藥典》2015年版一部[9]附錄0921崩解時(shí)限檢查法要求，取本品6粒，置于崩解時(shí)限測(cè)試儀中，結(jié)果均在30 min內(nèi)全部崩解，符合規(guī)定。

3.3TLC鑒別

3.3.1黃芪 取芪參還五膠囊內(nèi)容物5 g，加正丁醇30 mL，超聲處理40 min，濾過(guò)，濾液用0.01 g·mL-1氫氧化鈉溶液洗滌2次，每次20 mL，棄去堿液，再用正丁醇飽和的水洗滌至中性，棄去水液，將正丁醇液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。去掉處方中黃芪，按照上述供試品溶液制備方法制成缺黃芪的陰性對(duì)照溶液。按照《中國(guó)藥典》2015年版一部附錄Ⅵ B 項(xiàng)下TLC法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，吸取供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各5 μL，對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液為展開劑，展開，晾干，噴以0.11 g·mL-1的硫酸乙醇，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性未見干擾斑點(diǎn)，見圖1A。

3.3.2大黃 取芪參還五膠囊內(nèi)容物5 g，加甲醇20 mL，浸漬1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)?.5 mol·L-1鹽酸20 mL使溶解，水浴加熱30 min，冷卻，用乙醚振搖提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取大黃對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。將處方中大黃去掉，按照上述供試品溶液制備方法制成缺大黃的陰性對(duì)照溶液。按照TLC法實(shí)驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，展開，晾干，置于紫外光燈365 nm處檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性未見干擾斑點(diǎn)。見圖1B。

3.3.3赤芍 取芪參還五膠囊內(nèi)容物5 g，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用水飽和的正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，加氨試液25 mL洗滌，再用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次25 mL，正丁醇液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對(duì)照品，加乙醇制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。將處方中赤芍去掉，按照上述供試品溶液項(xiàng)下方法制成缺赤芍的陰性對(duì)照溶液。吸取供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各5 μL，對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開劑，展開，晾干，噴以0.053 g·mL-1香草醛硫酸，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果可見，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性未見干擾斑點(diǎn)，見圖1C。

3.3.4水蛭 取芪參還五膠囊內(nèi)容物5 g，加乙醇20 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取水蛭對(duì)照藥材l g，同法制成對(duì)照藥材溶液。將處方中水蛭去掉，按照上述供試品溶液制備方法制成缺水蛭的陰性對(duì)照溶液。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.11 g·mL-1硫酸乙醇，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果可見，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的紫紅色主斑點(diǎn)，而陰性未見干擾斑點(diǎn)，見圖1D。

圖1 TLC圖

3.4含量測(cè)定

3.4.1色譜條件 采用Hypersil ODS2 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相：乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸(B)，梯度洗脫[10-12]，順序?yàn)椋?～12 min，10%A～15%A，90%B～85%B；12～15 min，15%A～18%A，85%B～82%B；15～20 min，18%A～22%A，82%B～78%B。3種成分檢測(cè)波長(zhǎng)分別為230、260、320 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。

3.4.2混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取3種成分對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為140.2、5.0、9.8 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

3.4.3供試品溶液的制備 精密稱取芪參還五膠囊內(nèi)容物5 g，置于具塞量瓶中，加入甲醇40 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min(功率500 W，頻率40 kHz)，放冷至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，蒸干，殘?jiān)铀?30 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用0.01 g·mL-1氫氧化鈉洗滌3 次，每次20 mL，棄去堿液，再用正丁醇飽和的水洗滌3次，每次25 mL，棄去水液，取正丁醇液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，移至100 mL具塞量瓶中，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.4.4陰性對(duì)照溶液的制備 分別去掉處方中黃芪、赤芍、當(dāng)歸和川芎藥材，分別制成缺黃芪、赤芍、當(dāng)歸和川芎的陰性膠囊樣品，按照3.4.3項(xiàng)下方法分別制得黃芪陰性對(duì)照溶液、赤芍陰性對(duì)照溶液以及當(dāng)歸、川芎雙陰性對(duì)照溶液。

3.4.5專屬性考察 精密吸取3.4.3項(xiàng)下制備的供試品溶液、3.4.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液及3.4.4項(xiàng)下制備的各陰性對(duì)照溶液各10 μL，按照3.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，見圖2。由圖2可知，3種成分對(duì)照品色譜峰與周圍其他組分色譜峰均可分離，且峰形良好，陰性對(duì)照色譜在對(duì)照品色譜峰相同保留時(shí)間位置未見干擾峰。

圖2 HPLC圖

3.4.6線性關(guān)系考察 精密吸取3.4.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液1、2、3、4 mL，分別置于5 mL具塞量瓶中，以甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，按照3.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為10 μL。以稀釋后的各混合對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)計(jì)算回歸方程,得到芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和阿魏酸的回歸方程分別為：y1=6 161.8x1+178.62(R12=0.999 7)，y2=5 993.7x2+102.48(R22=0.999 5)，y3=6 162.6x3+16.095(R32=0.999 7)，質(zhì)量濃度分別在 28.04～140.20、1.0～5.0、1.96～9.80 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

3.4.7精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取3.4.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液10 μL，按照3.4.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)算得3種成分的RSD值分別為0.64%、1.02%、0.88%，結(jié)果表明該儀器精密度良好。

3.4.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批芪參還五膠囊(批號(hào)190522)6份，按照3.4.3項(xiàng)下方法制得6份供試品溶液，各精密吸取10 μL進(jìn)樣分析，以峰面積計(jì)算得3種成分的RSD值分別為0.76%、1.14%、0.92%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.4.9穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取芪參還五膠囊(批號(hào)190522)，按照3.4.3項(xiàng)下方法新制備供試品溶液，分別在室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h，依次吸取10 μL進(jìn)樣分析，以峰面積計(jì)算3種成分含量的RSD值分別為0.81%、1.23%、1.07%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4.10回收率實(shí)驗(yàn) 取同一批芪參還五膠囊(批號(hào)190522)6份，各精密稱取1.0 g，置于具塞量瓶中，依次加入芍藥苷對(duì)照品(5.440 mg·mL-1)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品 (0.180 mg·mL-1) 和阿魏酸對(duì)照品(0.345 mg·mL-1)各0.5 mL，按照3.4.3項(xiàng)下方法制得6份供試品溶液，各精密吸取10 μL進(jìn)樣分析，以峰面積計(jì)算3種成分的平均回收率，結(jié)果表明該方法回收率良好，見表6。

表6 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

3.4.11含量測(cè)定結(jié)果 取3批芪參還五膠囊，按照3.4.3項(xiàng)下方法分別制得3份供試品溶液，各精密吸取10 μL進(jìn)樣分析，以峰面積計(jì)算得3種成分的平均含量分別為2.724、0.090、0.172 mg·g-1。見表7。

表7 樣品含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

本研究對(duì)芪參還五膠囊的制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分別進(jìn)行了研究，由于方中藥味較多，對(duì)質(zhì)量控制無(wú)法一一鑒別，方中用黃芪為君藥，其主要成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷具有舒張血管、保護(hù)局部缺血器官損傷、減輕血管緊張素引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷等作用[13-16]；芍藥苷是赤芍中活血化瘀的主要成分[17]，當(dāng)歸、川芎的主要成分阿魏酸具有抗血小板聚集、緩解血管痙攣等作用[18-20]，這些成分均可被認(rèn)為是芪參還五膠囊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)成分，因其在藥材中含量較高且相對(duì)穩(wěn)定，易于進(jìn)行定量檢測(cè)，用以把控制劑的質(zhì)量。本研究參考《中國(guó)藥典》2015年版和文獻(xiàn)中方法，分別考察了甲醇-0.4 mL·L-1磷酸、乙腈-0.4 mL·L-1磷酸和乙腈-1 mL·L-1磷酸3種流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)用乙腈-1 mL·L-1磷酸進(jìn)行洗脫時(shí)各成分的分離效果最好，峰形美觀，故選擇其作為3種成分的流動(dòng)相系統(tǒng)。研究又參考文獻(xiàn)和《中國(guó)藥典》2015年版中各成分的最大吸收波長(zhǎng)，設(shè)定在不同時(shí)間段切換不同波長(zhǎng)，以保證各成分特征吸收峰的順利檢出。

本研究通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)法篩選出了芪參還五膠囊的最佳提取工藝，對(duì)于提高制劑的生產(chǎn)效率和降低生產(chǎn)成本具有積極的意義。方中黃芪、大黃、赤芍和水蛭4味藥材的TLC圖均顯示斑點(diǎn)清晰，分離效果好，陰性對(duì)照無(wú)干擾。HPLC圖顯示，3種成分對(duì)照品色譜峰均可達(dá)基線分離，且陰性對(duì)照未見干擾色譜峰。綜上所述，本研究篩選出的芪參還五膠囊的最佳制備工藝穩(wěn)定、可行，建立的質(zhì)量控制方法準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可作為芪參還五膠囊的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，保證制劑質(zhì)量的穩(wěn)定可控。