卷柏總黃酮的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

李彥超，周 寧，鄭曉珂

(1.河南省食品藥品檢驗(yàn)所 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450008；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450046)

卷柏為卷柏科植物Selaginellatamariscina(Beauv.) Spring 的干燥全草，具有活血通經(jīng)之功效，主治閉經(jīng)經(jīng)痛、癥瘕痞塊、跌撲損傷；卷柏炒炭后可化瘀止血，用于吐血、崩漏、便血、脫肛[1-4]。卷柏在中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥中應(yīng)用廣泛，藥理研究[5-11]表明，其具有細(xì)胞毒、抗微生物、抗炎、降血糖和保護(hù)血管內(nèi)皮等作用，其中的黃酮類成分被認(rèn)為是卷柏的主要有效成分之一[12-14]。前期實(shí)驗(yàn)對(duì)卷柏中的總黃酮進(jìn)行提取純化研究，并制定了提取工藝。本文主要系統(tǒng)地研究卷柏總黃酮的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：首次以穗花杉雙黃酮作為對(duì)照，用UV法測(cè)定卷柏總黃酮的含量，并用HPLC法測(cè)定穗花杉雙黃酮的含量；進(jìn)一步測(cè)定重金屬及有害元素、有機(jī)氯農(nóng)殘和其他檢查項(xiàng)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 SHIMADZU UV-2700型紫外分光光度計(jì)[島津儀器(蘇州)有限公司]；1260 Infinity型高效液相色譜儀，7890A型氣相色譜儀(Agilent 公司)；Venusil XBP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(Agela Technologies公司)；AAS-ZEEnit700型原子吸收分光光度計(jì)，鉛(Pb)空心陰極燈(德國(guó)耶拿分析儀器股份公司)；AFS-9530型原子熒光光度計(jì)(北京吉天儀器有限公司)；XR205SM-DR型分析天平(瑞士Precisa公司)；AS-1型鎘(Cd)、銅(Cu)空心陰極燈以及AF-2型砷(As)、汞(Hg)空心陰極燈(北京有色金屬研究總院)；ETHOS A型微波消解儀(意大利麥爾斯通公司)；ED16型智能樣品處理器(北京萊伯泰科儀器有限公司)；Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；HK250型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；ED56干燥箱(德國(guó)Binder公司)；SXZ-4-10N型箱式電阻爐(上海一恒科技有限公司)。

1.2試藥 穗花杉雙黃酮(批號(hào)111902-201102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.2%)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品溶液：Pb(批號(hào)211035050)、Cd(批號(hào)12062612)、Cu(批號(hào)212075097)、As(批號(hào)151035-2)和Hg(批號(hào)212075009)，均購(gòu)自國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心鋼鐵研究總院；甲醇為色譜純(德國(guó)默克公司)；水為純化水(自制)；卷柏總黃酮(批號(hào)：14040101、14092101、14092102、14092103)，湖南康麓生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1性狀 根據(jù)卷柏總黃酮實(shí)驗(yàn)室小試樣品及卷柏總黃酮4批次實(shí)際觀察，暫定本品性狀為淡灰黃色至淡灰綠色的粉末；氣微，味淡。

2.2鑒別

2.2.1溶液的制備 精密稱取卷柏總黃酮0.02 g，置于100 mL量瓶中，加乙醇80 mL，超聲處理10 min，放冷，加乙醇定容至刻度，搖勻，得卷柏總黃酮供試品溶液。精密稱取穗花杉雙黃酮對(duì)照品，用甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為60 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。乙醇作為空白試劑。

2.2.2色譜條件 Venusil XBP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-1 mL·L-1磷酸(70∶30)；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：337 nm。分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下制備的卷柏總黃酮供試品溶液、穗花杉雙黃酮對(duì)照品溶液和空白試劑各10 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.3鑒別結(jié)果 4批次卷柏總黃酮供試品色譜圖中均呈現(xiàn)與穗花杉雙黃酮色譜峰保留時(shí)間相同的色譜峰。

2.3檢查

2.3.1重金屬及有害元素 參照《中國(guó)藥典》2015年版四部通則Pb、Cd、As、Hg、Cu測(cè)定法，Pb、Cd用石墨爐原子吸收分光光度法，As用氫化物原子吸收分光光度法，Hg用冷蒸氣吸收原子分光光度法，Cu用火焰原子吸收分光光度法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果4批次卷柏總黃酮中的Pb、Cd、As、Hg、Cu與《中國(guó)藥典》2015年版四部通則中的限值比較均在限度范圍內(nèi)。

2.3.2有機(jī)氯農(nóng)藥殘留 參照《中國(guó)藥典》2015年版四部通則，用氣相色譜法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果4批次卷柏總黃酮均未檢出有機(jī)氯農(nóng)藥殘留。

2.3.3干燥失質(zhì)量 參照《中國(guó)藥典》2015年版四部通則，結(jié)果4批次卷柏總黃酮每克的干燥失質(zhì)量均小于40 mg，暫定本品干燥失質(zhì)量為每克小于40 mg。

2.3.4熾灼殘?jiān)?參照《中國(guó)藥典》2015年版四部通則，結(jié)果4批次卷柏總黃酮熾灼殘?jiān)з|(zhì)量每克均小于5 mg，暫定本品熾灼失質(zhì)量為每克小于5 mg。

2.4卷柏總黃酮的含量測(cè)定

2.4.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取穗花杉雙黃酮對(duì)照品，用甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為80 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.4.2供試品溶液的制備 精密量取2.2.1項(xiàng)下制備的供試品溶液，用乙醇定量稀釋20倍，混勻，即得。

2.4.3測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 分別對(duì)2.4.1項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液、2.4.2項(xiàng)下制備的供試品溶液以及空白溶劑乙醇在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果表明，穗花杉雙黃酮對(duì)照品溶液和卷柏總黃酮供試品溶液紫外吸收峰形完全一致，均在337 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，空白溶劑乙醇符合紫外分光光度法對(duì)溶劑的要求[15]，在337 nm波長(zhǎng)處無(wú)紫外吸收，即對(duì)卷柏總黃酮的含量測(cè)定無(wú)干擾，因此以337 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4.4線性關(guān)系考察 精密稱取穗花杉雙黃酮對(duì)照品適量，按照2.4.1項(xiàng)下方法制成質(zhì)量濃度為77.85 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，分別精密吸取0.2、0.4、0.6、1.0、1.5 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇分別稀釋并定容，作為系列對(duì)照品溶液，用紫外分光光度計(jì)分別在337 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、吸光度值為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y1=0.070 7x1-0.014 2(r1=1.000 0)。結(jié)果表明，卷柏總黃酮質(zhì)量濃度在1.56～11.68 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.5精密度實(shí)驗(yàn) 按照2.4.1項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度為4.67 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，連續(xù)6次測(cè)定吸光度RSD值為0.13%。表明儀器精密度良好。

2.4.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取卷柏總黃酮(批號(hào)14040101)，按照2.4.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，制備后每隔2 h測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定12 h，計(jì)算卷柏總黃酮的吸光度RSD值為0.51%，表明供試品溶液制備后12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 平行取6份卷柏總黃酮(批號(hào)14040101)，按照2.4.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定其含量RSD值為0.96%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.8回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取卷柏總黃酮(批號(hào)14040101)3組，每組3份，每份10 mg，分別置于100 mL量瓶中，按照2.4.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定吸光度值并計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.4.9樣品含量測(cè)定 按照2.4.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定吸光度值，計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果

2.5穗花杉雙黃酮的含量測(cè)定

2.5.1測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 同2.4.3項(xiàng)下。

2.5.2色譜條件 同2.2.2項(xiàng)下。

2.5.3溶液的制備 同2.2.1項(xiàng)下。

2.5.4系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白試劑乙醇各10 μL，注入液相色譜儀，按照2.2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果穗花杉雙黃酮色譜峰分離良好，空白試劑在相應(yīng)位置無(wú)干擾，見圖1。

圖1 HPLC圖

2.5.5線性關(guān)系考察 精密稱取穗花杉雙黃酮對(duì)照品適量，按照2.2.1項(xiàng)下方法制成質(zhì)量濃度為0.320 0 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，分別精密量取上述對(duì)照品溶液1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為6.401、16.00、32.00、64.01、160.01、320.03 μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液；分別精密吸取上述系列對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，于337 nm波長(zhǎng)處測(cè)定峰面積，以穗花杉雙黃酮對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積值為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y2=24.712 3x2-8.952 1(r2=1.000 0)。結(jié)果表明，穗花杉雙黃酮質(zhì)量濃度在6.40～320.03 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5.6精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.5.5項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液(64.01 μg·mL-1)10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定穗花杉雙黃酮的峰面積RSD值為0.33%，表明儀器精密度良好。

2.5.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取卷柏總黃酮(批號(hào)14040101)，按照2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，制備后每隔2 h吸取10 μL進(jìn)樣，連續(xù)測(cè)定20 h，測(cè)定穗花杉雙黃酮峰面積RSD值為0.42%，表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取卷柏總黃酮(批號(hào)14040101)6份，按照2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算穗花杉雙黃酮的平均含量為367.8 mg·g-1(RSD=1.54%)，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.9回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取卷柏總黃酮(批號(hào)14040101)3組，每組3份，每份0.01 g，分別置于100 mL量瓶中。按照2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.5.10樣品含量測(cè)定 取4批樣品，按照2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定峰面積，計(jì)算得最低含量為367.8 mg·g-1，最高含量為390.5 mg·g-1，平均含量為382.3 mg·g-1，RSD=2.69%(n=4)，故暫定卷柏總黃酮中穗花杉雙黃酮的含量不低于350 mg·g-1。

3 討論

3.1紫外標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的選擇 卷柏總黃酮目前已在藥品、保健食品以及日用化學(xué)品等諸多方面廣泛應(yīng)用，也廣泛研究了卷柏總黃酮的提取工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等，且大多以槲皮苷和蘆丁為指標(biāo)測(cè)定總黃酮[16-19]。雖然卷柏總黃酮中也含有槲皮苷和蘆丁，但主要由雙黃酮組成，而穗花杉雙黃酮又是卷柏總黃酮中的代表性成分，具有很強(qiáng)的生物活性[20-22]，可作為卷柏總黃酮的質(zhì)量判定指標(biāo)之一；卷柏總黃酮中穗花杉雙黃酮占40%以上，二者在紫外光譜圖上極其相似，測(cè)定方法簡(jiǎn)便易行，因此以其作為測(cè)定指標(biāo)較合理。

3.2提取方法的選擇 本實(shí)驗(yàn)考察供試品溶液的制備方法，用甲醇超聲提取5、10、15、20 min與回流提取30 min比較，結(jié)果回流提取30 min與超聲提取10 min以上測(cè)得的卷柏總黃酮和穗花杉雙黃酮含量基本一致，估計(jì)是樣品本身為提取物，且為提取后干燥品，較好溶解，故采用本實(shí)驗(yàn)的制備方法。

3.3色譜條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)分別從色譜柱和流動(dòng)相對(duì)色譜條件進(jìn)行了考察，對(duì)以下4根色譜柱分別進(jìn)行了考察：CAPCELL PAK C18(SHISEIDO公司)，phenomenex C18(phenomenex公司)，CHROM-MATRIX C18(CHROM-MATRIX公司)，Venusil XBP C18(Agela Technologies公司)，結(jié)果分離度、峰形較好且基線較平穩(wěn)的為Venusil XBP C18色譜柱。對(duì)水、磷酸、冰醋酸和甲酸進(jìn)行流動(dòng)相篩選，結(jié)果磷酸分離效果較好，在此基礎(chǔ)上對(duì)不同濃度(0.5、1、2 mL·L-1)磷酸進(jìn)行比較，結(jié)果以1 mL·L-1磷酸為流動(dòng)相時(shí)峰形較好、基線較平穩(wěn)、對(duì)稱性好，因此本實(shí)驗(yàn)采用上述條件作為最佳色譜條件。