透析袋法測定經(jīng)皮給藥柔性脂質(zhì)體中歐前胡素的包封率*

許 源，莫鎮(zhèn)杰，張 彥，陳智聰，羅嬌艷，班俊峰

(廣東藥科大學，廣東 廣州 510006)

白芷是中藥中常用于發(fā)揮解表、祛風散寒、燥濕與止痛等功效的藥材，其藥用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1-3]?；瘜W成分表明異歐前胡素、歐前胡素等香豆素類成分是白芷中的主要成分之一，《藥典》中白芷“鑒別”項下明確以歐前胡素和異歐前胡素為對照，“含量測定”項下明確以歐前胡素為檢測指標進行含量測定。白芷在臨床上常用于治療頭面部疼痛及瘡瘍腫痛等類型的疼痛癥狀，在治療等方面，經(jīng)適當配伍更可以廣泛應用于全身各部位的疼痛病癥。雖然白芷被廣泛應用于臨床解熱鎮(zhèn)痛的方劑中，但對于其有效成分歐前胡素經(jīng)皮給藥緩解疼痛的相關(guān)研究較少[4-6]。柔性脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)與機體生物膜類似，是一種多功能的定向藥物載體。其在經(jīng)皮給藥系統(tǒng)中的應用，可使皮膚結(jié)構(gòu)中表皮和真皮內(nèi)的藥物量增多，并形成藥物儲庫。即達到了增強藥物滲透量使藥物直接到達身體特定部位起效，又起到了減少藥物進入血循環(huán)中的量避免首關(guān)效應發(fā)生的作用[7]。柔性脂質(zhì)體因其獨有的特點，在經(jīng)皮給藥系統(tǒng)中已有廣泛研究。目前柔性脂質(zhì)體仍存在有儲存期顆粒易團聚、磷脂成分氧化導致的活性成分含量降低、樣品儲存期內(nèi)粒徑分布、PDI和Zeta不穩(wěn)定等問題嚴重限制了其在經(jīng)皮給藥系統(tǒng)中的開發(fā)和應用。本研究通過建立透析袋法測定了歐前胡素柔性脂質(zhì)體中的包封率，考察了制備工藝過程中影響藥物含量的制備因素，研究可為歐前胡素經(jīng)皮遞藥系統(tǒng)的開發(fā)提供技術(shù)支持，為開發(fā)高滲透量的產(chǎn)品提供理論參考。

1 儀器與試藥

CP225D電子分析天平，德國賽多利斯科學儀器有限公司；Waters e2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；JY88-LIN超聲波細胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；L-100XPRE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；THZ-82水浴恒溫振蕩器，江蘇省金壇市宏華儀器廠。

歐前胡素對照品，中國藥品生物制品檢定所(批號：110826-201616，純度：98%)；歐前胡素原料藥，上海歷鼎生物技術(shù)有限公司(批號：160118，純度：97%)；歐前胡素柔性脂質(zhì)體，自制(批號：20190301-1、20190301-2、20190301-3)；空白歐前胡素柔性脂質(zhì)體，自制(批號：20190301)；水為蒸餾水；有機試劑均為分析純，液相用試劑均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 歐前胡素柔性脂質(zhì)體的制備

表1 歐前胡素柔性脂質(zhì)體處方組成

采用薄膜分散法制備脂質(zhì)體[8]，稱取處方量的歐前胡素(IMP)，大豆卵磷脂，膽固醇于圓底燒瓶中，加入10 mg·mL-1的吐溫-20乙醇溶液水浴加熱溶解，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，55 ℃水浴揮去乙醇，PBS溶液(pH=7.4)水化 30 min后取出，將所得溶液置于燒杯中，冰浴條件下70 Hz 細胞破碎超聲10 min，即得1 mg·mL-1的歐前胡素柔性脂質(zhì)體溶液。

2.2 歐前胡素的含量測定

2.2.1 色譜條件

YMC C18column色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長：297 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1；流動相：甲醇：水(70:30，V/V)。

2.2.2 專屬性考察

取IMP對照品溶液、供試品溶液及空白供試品溶液適量，采用HPLC法，按2.4項下色譜條件進樣分析。結(jié)果如圖1所示，表明歐前胡素柔性脂質(zhì)體中的輔料對歐前胡素的含量測定無干擾，歐前胡素的保留時間為9.6 min。

圖1 HPLC色譜圖

2.2.2.1 對照品貯備液的制備

精密稱取歐前胡素對照品10.19 mg于100 mL量瓶中，用甲醇超聲溶解定容得0.1019 mg·mL-1對照品溶液。

2.2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取自制歐前胡素柔性脂質(zhì)體0.1 mL(IMP含量為0.5 mg·mL-1)于10 mL量瓶中，甲醇超聲溶解并定容，采用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2.3 空白供試品溶液的制備

精密稱取空白歐前胡素柔性脂質(zhì)體0.1 mL于10 mL量瓶中，按2.2.2.2項下 “供試品溶液制備”方法制備。

2.2.3 線性考察

精密量取2.2.2.1項下對照品貯備液適量，用甲醇溶解稀釋并定容，配制成質(zhì)量濃度為0.1019、0.5095、1.019、5.095、10.19、20.38 μg·mL-1的系列溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣分析，以藥物峰面積A(mAU)對藥物濃度C(μg·mL-1)進行線性回歸，得回歸方程為A=49121C-267.97(R2=0.9999)。結(jié)果表明IMP濃度在0.1019～20.38 μg·mL-1范圍內(nèi)與其峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.4 精密度實驗

分別各取2.2.2.1項下歐前胡素對照品和2.2.2.2項下供試品溶液6份，按2.2.1項下色譜條件進樣分析，連續(xù)重復進樣6次，記錄峰面積。表2結(jié)果顯示，歐前胡素對照品峰面積的RSD值為0.35%(n=6)，表明儀器精密度良好；歐前胡素供試品峰面積的RSD值為0.47%(n=6)，表明本方法重復性良好。

表2 回收率試驗結(jié)果

2.2.5 加樣回收率實驗

取已知含量的歐前胡素柔性脂質(zhì)體9份，分別加入一定量的IMP對照品溶液，加甲醇稀釋并定容，進樣分析并記錄峰面積。結(jié)果表明，三種濃度的加樣回收率在97.34%～101.03%之間，三個濃度梯度的平均回收率分別為97.34%、101.03%、99.18%(n=3)，RSD值分別為0.57%、0.09%、0.06%(n=9)，表明該方法的準確度良好，詳見表2。

2.3 包封率的測定

2.3.1 透析袋的前處理

將透析袋(分子截留量3000)置于1 mmol·L-1的EDTA 與2% NaHCO3溶液中煮沸20 min，冷卻至室溫后，用蒸餾水將透析袋里外沖洗干凈，再用蒸餾水加以煮沸10 min，冷卻至室溫后將透析袋浸泡于70%的乙醇溶液中進行保存，使用前需用蒸餾水將透析袋里外加以清洗。

2.3.2 透析平衡時間

取歐前胡素柔性脂質(zhì)體0.5 mL于透析袋中，首尾密封扎緊，置于50 mL離心管中，以0.5%吐溫-80為釋放介質(zhì)，取20 mL加入至離心管中，在37 ℃，100 rpm·min-1狀態(tài)中水浴振蕩，保證歐前胡素脂質(zhì)體處于“漏槽條件”下，于2，4，6，8，10，12 h時各取2 mL釋放介質(zhì)，每次取出后補回2 mL同溫度的釋放介質(zhì)。取出的樣品采用0.22 μm濾膜過濾，按2.2.1項下色譜條件進樣分析，計算藥物濃度C，以藥物濃度C為縱坐標，取樣時間t為橫坐標作透析平衡時間曲線，以確定透析平衡時間，結(jié)果如圖2所示。

圖2 歐前胡素柔性脂質(zhì)體透析平衡時間曲線

由平衡時間曲線可知，8 h后，歐前胡素柔性脂質(zhì)體處于平衡狀態(tài)，藥物濃度在8～12 h內(nèi)變化不大，穩(wěn)定性良好，為保證柔性脂質(zhì)體透析平衡完全，選擇以10 h為藥物的透析平衡時間。

2.3.3 包封率的測定

精密移取透析平衡時間為10 h時的樣品1 mL置于10 mL量瓶中，適量甲醇超聲溶解并定容，采用0.22 μm濾膜過濾，按2.2.1項下色譜條件進樣分析，計算歐前胡素總的藥物含量，并按公式(1)計算歐前胡素柔性脂質(zhì)體的包封率EE。

(1)

經(jīng)計算，10 h時藥物含量為0.1%的歐前胡素柔性脂質(zhì)體的包封率為58.39%±3.64%。

3 結(jié) 論

本研究以大豆卵磷脂為脂質(zhì)材料，采用薄膜分散法制備歐前胡素柔性脂質(zhì)體，所制備的脂質(zhì)體為淡黃色、均一穩(wěn)定的溶液制劑。采用的檢測方法為高效液相色譜法，經(jīng)過驗證該方法適用于歐前胡素柔性脂質(zhì)體的方法學測定，所建立的分析精密度高，變異系數(shù)小，可快捷、準確地測定歐前胡素柔性脂質(zhì)體的含量和包封率，且專屬性強，可用于質(zhì)量控制。

脂質(zhì)體測定包封率的方法常用葡聚糖凝膠柱色譜法、透析袋法和超速離心法等，本實驗采用透析袋法作為歐前胡素柔性脂質(zhì)體的包封率測定方法，與葡聚糖凝膠柱色譜法和超速離心法相比，缺點為過程緩慢，時間較長，其優(yōu)點為脂質(zhì)體膜不易滲漏或被破壞，適合用于分離小分子藥物，該方法穩(wěn)定可靠且利于取樣分析。