一株強(qiáng)抑菌活性植物乳桿菌的分離及益生性能研究

曹海鵬，徐興娜，文小飛

（貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550001）

抗生素作為飼料添加劑曾為規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)。但由于抗生素的長期不合理使用，導(dǎo)致了一系列問題，如肉制品及排泄廢水抗生素殘留超標(biāo)，嚴(yán)重危害人類及其他動物健康；致腸道菌群失調(diào)及產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性等，使動物機(jī)體免疫力下降，易引發(fā)內(nèi)源性感染和一系列的公共安全問題?；诖耍瑲W盟已于2006年規(guī)定全面禁止在動物飼料中添加任何抗生素，日本和美國在飼用抗生素種類及使用方面也做了極嚴(yán)格的限制[1]。此外，抗生素在肉制品中的殘留，常被設(shè)為進(jìn)出口貿(mào)易中的壁壘[1]。因此，在養(yǎng)殖業(yè)中急需尋找安全、有效的抗生素替代品。

益生菌能通過腸道占位、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)及整合腸道菌群等功能來維持腸道健康、減少疾病的發(fā)生，在預(yù)防及治療細(xì)菌性疾病方面具有一定的優(yōu)勢[2]。乳酸菌是研究和應(yīng)用最多的益生菌，其是人和動物腸道的優(yōu)勢菌群，具有抑制致病菌的生長、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、促進(jìn)食物消化和營養(yǎng)吸收、刺激腸道黏膜免疫、佐劑效應(yīng)等多種生理功能[3]。LHTEINEN T等[4]研究發(fā)現(xiàn)，使用乳酸桿菌飼喂仔豬，可有效地增加仔豬的體質(zhì)量并改善仔豬的健康。屎腸球菌可增加母豬采食量，降低母豬哺乳期間的失重幅度，還可以降低仔豬因感染細(xì)菌性疾病導(dǎo)致的腹瀉率與死亡率[5-6]。然而，目前大多數(shù)研究及應(yīng)用的乳酸菌并非源自腸道，其在腸道內(nèi)的定植及存活時間有待考究。為解決這一問題，國內(nèi)一些學(xué)者試圖從豬的糞便中分離出具有益生功能的乳酸菌，發(fā)現(xiàn)豬源乳酸菌在一定水平能促進(jìn)仔豬的生長，并降低細(xì)菌性疾病的感染率和致死率[7]。然而，豬的腸道和糞便所處的生理環(huán)境不同，致其微生物菌群結(jié)構(gòu)差異。此外，乳酸菌不耐高溫，在飼料和食品添加中實(shí)際應(yīng)用受限，而乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素具有分子質(zhì)量低、耐高溫、抑菌效果顯著等特點(diǎn)。但是，細(xì)菌素通常更有利于抑制陽性菌，對大腸桿菌和沙門氏菌等腸道陰性菌的抑制效果較差[8]。因此，分離和篩選具有廣譜抑菌效果的腸道源乳酸菌，并研究其益生功能及抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性仍具有重要的研究意義。

該研究擬從健康豬腸道黏膜中分離和篩選出具有較強(qiáng)廣譜抑菌效果的乳酸菌，并研究其益生功能和抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性，旨在為微生態(tài)制劑以及抗菌素產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

新鮮采取的健康成年黔北黑豬的豬腸道黏膜內(nèi)容物：貴州省畢節(jié)市偏遠(yuǎn)山區(qū)散養(yǎng)豬。飼養(yǎng)期間從未飼喂過任何成品飼料、活菌制劑或抗生素。

1.1.2 指示菌

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC6538、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC25922和鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC14028：上海魯微科技有限公司。

1.1.3 試劑

2×脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）混合物、DNA顯色劑Gold-ViewTM：全式金生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片：杭州微生物試劑有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、過氧化氫酶：都萊生物技術(shù)公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母膏10 g，牛肉膏10 g，吐溫80 1.0 mL，葡萄糖20.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，七水硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.6，121 ℃高壓滅菌20 min。

改良MRS培養(yǎng)基：固體MRS培養(yǎng)基中加0.05%的碳酸鈣，121 ℃高壓滅菌20 min[9]。

液體LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，氯化鈉10.0 g，水1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min[9]。

人工胃液：氯化鈉0.2 g，胃蛋白酶1.0 g，用pH 2.0的100 mL鹽酸水溶液稀釋，充分溶解后，用微孔濾膜過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆肹10]。

人工腸液：磷酸二氫鉀0.68 g，蒸餾水溶解，以濃度為0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至8.0，另取胰蛋白酶1.0 g加適量水使其溶解，將兩液混合后加水定容至100 mL，用微孔過濾膜過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆肹10]。

固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加1.5%的瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

JA1003電子天平：唐山力辰科技有限公司；DH6000B電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；XMTA-7000智能恒溫干燥箱：上海景邁儀器設(shè)備有限公司；XSP-06光學(xué)顯微鏡：湖北省潛江市教學(xué)儀器廠；THZ-82A雙數(shù)顯旋轉(zhuǎn)氣浴振蕩器、TGL-16A高速離心機(jī)：金壇市城東新瑞儀器廠；SW-CJ-1G單人凈化工作臺：上海蘇凈凈化工作臺；FE20 pH計：深圳市科力易翔儀器設(shè)備有限公司；WD-9402B/D非醫(yī)用基因擴(kuò)增儀：北京六一生物科技有限公司；HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株分離

分段取被宰殺豬的腸道，用消毒過的解剖剪剪開，小心剔除腸道內(nèi)容物，并用酒精消毒過的解剖刀小心刮取腸道黏膜附屬物，收集于5 mL的無菌離心管中。取1 g黏膜附屬物樣品于9 mL滅菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，并取1 mL樣品依次稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6及10-7等。分別取10-3、10-4、10-5、10-6及10-7等梯度樣品各200 μL，均勻涂布于改良MRS平板中，并置于厭氧培養(yǎng)罐中（使用厭氧產(chǎn)氣袋除氧），37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。從稀釋度較高的兩組平板中挑取40個具有乳白色、高圓隆、邊緣整齊且溶鈣圈較大等典型乳酸菌特征的菌落，進(jìn)一步平板劃線培養(yǎng)至分離出形態(tài)特征均一的單菌落。將各單菌落菌株轉(zhuǎn)接于MRS斜面培養(yǎng)基中，編號、培養(yǎng)和鏡檢，篩選出接觸酶陽性、過氧化氫酶陰性的革蘭氏陽性菌，于4 ℃保藏備用[7，11-12]。

1.3.2 菌液制備

將上述分離的所有斜面菌株分別轉(zhuǎn)接入10 mL MRS液體種子培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。取1 mL種子液轉(zhuǎn)接于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。取50 mL發(fā)酵液，8 000 r/min離心5 min，收集上清液，并置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

取指示菌金黃色葡萄球菌ATCC6538、大腸埃希氏菌ATCC25922和鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028的甘油種子，經(jīng)固體LB平板活化后轉(zhuǎn)接入液體LB種子培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。取1 mL種子液轉(zhuǎn)接于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩過夜培養(yǎng)，菌液置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 抑菌性能篩選

取200 μL稀釋100倍的各指示菌菌液，分別均勻涂布于15 mL LB固體平板（直徑為9 cm）中。每皿等距離放入兩只6 mm內(nèi)徑的牛津杯，杯中分別加入200 μL的乳酸菌發(fā)酵液和上清液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。采用游標(biāo)卡尺測量各菌抑菌圈直徑，篩選出對三種指示菌抑菌效果最好的菌株做后續(xù)試驗(yàn)[11]。

1.3.4 16S rDNA鑒定

以平板劃線分離的篩選菌株的單菌落為模板，細(xì)菌通用引物27F和1492R為引物，加入一定量的2×TaqPCR mix進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：98 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30次循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列分析。將所測的16S rDNA序列經(jīng)局部序列比對檢索基本工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）[13]，并采用MEGA 7.0軟件的鄰近法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析并確定菌株種類。

1.3.5 抑菌性能與培養(yǎng)時間的關(guān)系

取上述篩選出的最佳抑菌菌株液體種子，按1%比例接入200 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)。期間分別取0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h的樣品各5 mL，及剩余發(fā)酵液一并8 000 r/min離心5 min，收集上清液，檢測各時間點(diǎn)上清液pH值，將剩余樣品置于-20 ℃?zhèn)溆?。參?.3.3所述進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)束后觀察并統(tǒng)計各時間點(diǎn)發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑[11]。

1.3.6 高溫對抑菌活性的影響

將上述制備的上清液分裝5 mL至25 mL試管中，分別置于40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃、120 ℃下處理30 min，并用純凈水補(bǔ)足5 mL，各取200 μL處理液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)（參照1.3.3）。結(jié)束后觀察并統(tǒng)計各時間點(diǎn)發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑及其隨時間溫度變化關(guān)系[14]。

1.3.7 過氧化氫酶、胃蛋白酶及胰蛋白酶對抑菌活性的影響

將發(fā)酵上清液分成四組，將其中兩組pH調(diào)至7.0和8.0，分別加入1 mg/mL過氧化氫酶和胰蛋白酶；一組pH調(diào)至2.0，加入1 mg/mL胃蛋白酶，余下一組對照。四組均置于37 ℃下水浴處理60 min，再于80 ℃條件下水浴處理60 min對酶滅活。將pH 調(diào)回到原發(fā)酵液值，與對照組一同做抑菌試驗(yàn)[14]。

1.3.8 藥敏試驗(yàn)

參照1.3.2制備分離菌株菌液，取200 μL菌液涂布于MRS平板中，小心放置氨芐西林、慶大霉素、頭孢唑啉、四環(huán)素、丁胺卡那、環(huán)丙沙星、氯霉素、青霉素、復(fù)方新諾明、諾氟沙星及紅霉素11種抗生素藥敏紙片，每個紙片的間距不小于24 mm。其中，氨芐西林、慶大霉素、青霉素和諾氟沙星每片10 μg，頭孢唑啉、四環(huán)素、丁胺卡那和氯霉素每片30 μg，環(huán)丙沙星每片5 μg，復(fù)方新諾明每片23.75 μg，紅霉素15 μg。靜置培養(yǎng)24 h后以測量并統(tǒng)計抑菌圈直徑，分析其耐藥性[11]。

1.3.9 耐酸、耐膽鹽及模擬胃腸液試驗(yàn)

參照1.3.2制備分離菌株菌液，經(jīng)pH 6.8磷酸鹽緩沖液（phosphate balanced solution，PBS）清洗后重懸于等體積的PBS中，并分別取400 μL接種于8 mL pH 2.0、0.3%豬膽鹽液體MRS培養(yǎng)基及模擬人工胃腸液中，37 ℃靜置培養(yǎng)，取處理0 h、2 h、4 h、6 h的菌液稀釋涂布于改良MRS平板，并置于厭氧培養(yǎng)罐中，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h。從稀釋度較高的平板中統(tǒng)計菌落總數(shù)，計算存活率[10，15]，其計算公式如下：

式中：R為存活率，%；B為處理之前的活菌數(shù)，CFU/mL；A為處理之后的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

以上數(shù)據(jù)采用Excel 2017文檔進(jìn)行分析、處理與制圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分類結(jié)果

分離菌株的菌落形態(tài)見圖1。由圖1可知，所有分離的40株菌的菌落特征均為乳白色、高隆起、邊緣整齊，產(chǎn)酸能力強(qiáng)且有乳香味，革蘭氏鏡檢結(jié)果為紫色陽性桿菌，且理化檢測結(jié)果顯示其均為接觸酶陽性、過氧化氫酶陰性菌（為乳酸菌典型理化特征）。結(jié)合以上特征可以初步判斷分離菌株為乳酸菌。

圖1 分離菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of isolated strains

2.2 具有抑菌性菌株的篩選結(jié)果

以培養(yǎng)24 h的乳酸菌發(fā)酵液和其離心上清液為研究對象，以金黃色葡萄球菌ATCC6538、大腸埃希氏菌ATCC25922和鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028為指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，篩選出1株對3種指示菌均有最佳抑菌效果的乳酸菌，并將其編號為R-21，抑菌效果見圖2。由圖2可知，菌株R-21發(fā)酵液對3種指示菌的抑菌直徑分別約為45.2 mm、23.1 mm和36.5 mm，其上清液對3種指示菌的抑菌直徑分別約為44.7 mm、23.1 mm和31.8 mm。

圖2 菌株R-21的抑菌效果Fig.2 Bacteriostatic effect of strain R-21

2.3 16S rDNA鑒定結(jié)果

將菌株R-21的PCR產(chǎn)物測序序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/），結(jié)果顯示菌株R-21的16S rDNA序列與數(shù)據(jù)庫中的Lactobacillus plantarumLPL24的同源率大于99%。選取同源性較高乳酸菌的16S rDNA序列，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株R-21與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）聚于一支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合菌株的菌落特征，鑒定該菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

圖3 菌株R-21基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain R-21 based on 16S rDNA sequences

2.4 抑菌性能與培養(yǎng)時間的關(guān)系

取植物乳桿菌R-21的液體種子，按照1%接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中，分別取0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h的樣品，離心后檢測發(fā)酵上清液pH及抑菌活性，其pH及對金黃色葡萄球菌ATCC6538、大腸埃希氏菌ATCC25922和鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028等指示菌的抑菌圈直徑隨培養(yǎng)時間變化關(guān)系見圖4。

圖4 植物乳桿菌R-21抑菌效果與發(fā)酵液pH隨時間變化Fig.4 Change of bacteriostatic effect and pH during culture process of Lactobacillus plantarum R-21

由圖4可知，植物乳桿菌R-21經(jīng)過150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，其發(fā)酵液的初始pH由5.4降至3.2（種子培養(yǎng)液的加入導(dǎo)致0 h培養(yǎng)基pH由6.4降至5.4），并有繼續(xù)下降的趨勢，說明其有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力；植物乳桿菌R-21培養(yǎng)至12～20 h時，其上清液對金黃色葡萄球菌ATCC6538抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑在43 mm以上，在16 h時抑菌圈直徑最大，之后呈下降趨勢，說明其抑菌能力強(qiáng)弱不完全取決于產(chǎn)酸性能，與酸性物質(zhì)之外其他產(chǎn)物有關(guān)；對大腸埃希氏菌ATCC25922和鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028的抑菌圈直徑均隨培養(yǎng)時間延長而增加，24 h時的最大值抑菌圈直徑分別達(dá)22.7 mm和32.1 mm，之后仍有上升趨勢，與pH變化對應(yīng)，表明菌株R-21對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌能力可能主要取決于發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸性物質(zhì)。

2.5 高溫對抑菌活性的影響

將上述制備的培養(yǎng)24 h的植物乳桿菌R-21發(fā)酵上清液5 mL分別置于40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃及120 ℃下處理30 min，冷卻后用純凈水補(bǔ)至原體積，各取200 μL處理液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，其對上述三種指示菌的抑菌圈直徑影響見圖5。

圖5 不同溫度處理下植物乳桿菌R-21發(fā)酵上清液抑菌活性變化Fig.5 Change of bacteriostatic activity of supernatant fermented by Lactobacillus plantarum R-21 after treatment under different temperature

由圖5可知，菌株R-21發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)對高溫有較強(qiáng)的抵抗力，120 ℃處理30 min，上清液對大腸埃希氏菌ATCC25922和鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028的抑菌圈直徑基本無變化（P＞0.05），只對金黃色葡萄球菌ATCC6538的抑菌直徑有所降低（由42.1 mm降至39.1 mm）。表明植物乳桿菌R-21發(fā)酵液物質(zhì)具有極強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，與路春波等[14]的研究結(jié)果一致，其發(fā)酵液抑菌物質(zhì)適用于需高溫處理的食品及飼料添加劑[16-17]，具有較高的研究和應(yīng)用潛力。

2.6 過氧化氫酶、胃蛋白酶及胰蛋白酶對抑菌活性的影響

乳酸菌發(fā)酵液的主要抑菌成分是有機(jī)酸、活性肽和過氧化氫，其中過氧化氫在一定條件下可以被過氧化氫酶分解，活性肽可被胃蛋白酶或胰蛋白酶分解而失去活性。為驗(yàn)證抑菌物質(zhì)的成分屬性，本研使用過氧化氫酶、胃蛋白酶及胰蛋白酶對發(fā)酵上清液處理1 h后，將其pH調(diào)回原發(fā)酵液值并將酶蛋白滅活后到進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見圖6。

圖6 不同酶處理下植物乳桿菌R-21發(fā)酵上清液抑菌活性變化Fig.6 Change of bacteriostatic activity of supernatant fermented by Lactobacillus plantarum R-21 under different enzyme treatment

由圖6可知，植物乳桿菌R-21發(fā)酵上清液中抑菌活性物質(zhì)受過氧化氫酶和胃蛋白酶影響較小（P＞0.05），主要受胰蛋白酶影響。經(jīng)1 mg/L胰蛋白酶處理后，對金黃色葡萄球菌ATCC6538的抑菌效果影響最大，抑菌直徑由42.4 mm降至28.2 mm；對大腸埃希氏菌ATCC25922和鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028的抑菌效果也有一定影響，抑菌直徑分別由21.8 mm和30.0 mm降至17.6 mm和25.7 mm。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，抑菌物質(zhì)主要成分是多肽類和有機(jī)酸，而非過氧化氫，其中活性肽可被胰蛋白酶分解而失去活性，進(jìn)而降低上清液的抑菌效果[14，17-18]。而活性肽在防治多重抗生素耐藥性細(xì)菌性疾病方面具有一定研究意義[19-20]。

2.7 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

使用氨芐西林、慶大霉素、頭孢唑啉、四環(huán)素、丁胺卡那、環(huán)丙沙星、氯霉素、青霉素、復(fù)方新諾明、諾氟沙星及紅霉素11種抗生素藥敏紙片對植物乳桿菌R-21做抑菌試驗(yàn)，結(jié)果見圖7。由圖7可知，菌株R-21對頭孢唑啉、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明和諾氟沙星四種抗生素耐藥，對氨芐西林、氯霉素和紅霉素等最為敏感（藥敏直徑均＞23 mm）。乳酸菌多重耐藥機(jī)制普遍存在，從生物安全角度來說，這類菌存在耐藥基因轉(zhuǎn)移等風(fēng)險，但耐藥基因的存在也為研究乳酸菌在體內(nèi)存在部位、數(shù)量、時間及定植等提供了便利[21-22]。

圖7 植物乳桿菌R-21的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Susceptibility of Lactobacillus plantarum R-21 to antibiotics

2.8 耐酸、耐膽鹽及模擬胃腸液試驗(yàn)結(jié)果

人和哺乳動物的胃消化道環(huán)境是酸性的，在空腹時胃消化液pH一般低于2.0，且含有多種消化酶，對細(xì)菌有一定殺滅和抑制作用；腸道內(nèi)含有0.03%～0.3%膽鹽和胰蛋白酶等，同樣對經(jīng)過的細(xì)菌具有抑制作用。乳酸菌作為腸道益生菌需要對低pH、膽鹽及各種消化酶具有一定的抵抗力，以確保其能順利通過酸性胃消化道，并進(jìn)入腸道，在腸道內(nèi)定植及發(fā)揮發(fā)揮益生功能[23]。本研究在對植物乳桿菌R-21進(jìn)行耐酸性、耐膽鹽試驗(yàn)之前曾做過預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其能在pH 3.0以上或0.2%豬膽鹽濃度以下的培養(yǎng)基中增殖。因此，此處選擇pH 2.0、0.3%豬膽鹽濃度的MRS液體培養(yǎng)基，及相應(yīng)的模擬胃、腸液進(jìn)行處理，檢測其在0、2 h、4 h及6 h時的殘留活菌數(shù)，活菌數(shù)對數(shù)值如圖8。

圖8 植物乳桿菌R-21的耐酸、耐膽鹽及模擬胃腸液試驗(yàn)結(jié)果Fig.8 Resistance results to acid,bile salt,and simulated gastrointestinal fluid of Lactobacillus plantarum R-21

由圖8可知，植物乳桿菌R-21在pH 2.0下處理時的活菌數(shù)隨時間逐漸下降，但在6 h時其對數(shù)值仍高達(dá)5.60，存活率為0.06%；經(jīng)0.3%豬膽鹽處理時，前4 h菌株活菌數(shù)對數(shù)值變化較小，4～6 h迅速下降，6 h時較初始值降低2.2（存活率為0.61%）；經(jīng)模擬胃液、腸液處理6 h時，菌株活菌數(shù)對數(shù)值變化較小，分別相較初始對數(shù)值僅減少0.40和0.59，存活率分別為40.80%和25.65%。表明菌株R-21對低pH強(qiáng)酸、豬膽鹽的耐受性好，基本不受胃、腸消化酶的影響，具有較強(qiáng)的益生特性，為其經(jīng)過胃腸消化道并在腸道定植、發(fā)揮益生活性提供了必要條件。

3 結(jié)論

本研究以未施用過抗生素的健康成年黔北黑豬的腸道黏膜內(nèi)容物為原料，以金黃色葡萄球菌ATCC6538、大腸埃希氏菌ATCC25922和鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028為指示菌，從中篩選出1株具有極強(qiáng)抑菌效果的乳酸菌，并對其進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果顯示該分離菌株屬于植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），并將其命名為植物乳桿菌R-21。其所產(chǎn)抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性強(qiáng)，在酸性條件下120 ℃處理30 min后抑菌活性基本無變化，表明其適用于需高溫處理的食品與飼料添加。酶蛋白處理時，過氧化氫酶與胃蛋白酶處理的發(fā)酵上清液抑菌活性基本無變化，而胰蛋白酶處理的活性明顯減弱，說明主要抑菌物質(zhì)不含過氧化氫，而含對胰蛋白酶敏感的活性多肽。耐受性試驗(yàn)中，植物乳桿菌R-21展示出對低pH、0.3%膽鹽及模擬胃腸液有極強(qiáng)的抵抗力，連續(xù)處理6 h仍保持較高的存活率，有助于其順利通過胃、腸消化道，利于菌株在腸道內(nèi)存活、定植或增殖，進(jìn)而發(fā)揮抑菌活性。該研究篩選出一株具有較強(qiáng)抑菌活性的植物乳桿菌R-21，其強(qiáng)酸、膽鹽等具有良好的耐受性，在微生態(tài)制劑研究和應(yīng)用方面具有較高的價值；其所產(chǎn)抑菌物具備耐高溫性能，適用于需高溫處理的食品及飼料加工等；抑菌物質(zhì)對胰蛋白酶敏感，說明其含有活性肽成分。