Nocth 信號通路對糖尿病足潰瘍炎癥因子及轉(zhuǎn)化生長因子表達(dá)的影響

韓 強(qiáng)，柳國斌，黃仁燕，徐 烽，嚴(yán)仕夢，施陳燕，陳君灝

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203）

中國約有1.1 億糖尿病患者，糖尿病前期狀態(tài)者約4.9 億［1］。糖尿病足潰瘍是導(dǎo)致糖尿病患者截肢的重要原因［2］。我國糖尿病足潰瘍的治療花費(fèi)約占糖尿病治療整體總費(fèi)用的1/3［3］。糖尿病足潰瘍給患者造成了沉重的負(fù)擔(dān)，是亟待解決的醫(yī)學(xué)問題。

糖尿病足潰瘍的病因包括周圍神經(jīng)病變、下肢血管病變、感染、創(chuàng)傷［4‐6］等。同時糖尿病患者自身的創(chuàng)面細(xì)胞和生長因子活性降低，全身慢性炎癥狀態(tài)，局部血管生成減少等現(xiàn)象也導(dǎo)致糖尿病足潰瘍愈合困難［7，8］。

創(chuàng)面愈合的進(jìn)程與炎癥、細(xì)胞增殖、血管形成以及組織形成有關(guān)［9］。然而，持續(xù)的強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)會造成細(xì)胞增殖期和重塑期的進(jìn)程延遲［10］。 糖尿病足潰瘍強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)造成各類細(xì)胞、細(xì)胞因子的協(xié)調(diào)紊亂［11］。有研究表明糖尿病潰瘍會刺激促炎細(xì)胞因子白介素‐1β（IL‐1β）、白介素‐6（IL‐6）和腫瘤壞死因子‐α（TNF‐α）表達(dá)［12‐14］。糖尿病足細(xì)菌感染患者炎癥因子CRP、TNF‐ɑ、IL‐6 與疾病程度相關(guān)［15］。此外，糖尿病患者細(xì)胞增殖受損，血管生成減少，生長因子下降間接造成糖尿病足潰瘍愈合的炎癥期向增殖期過渡困難［11，14］。有研究報道創(chuàng)面愈合過程中Notch 信號與炎癥細(xì)胞因子表達(dá)與調(diào)控巨噬細(xì)胞活化有關(guān)［16，17］。

筆者在前期臨床病例研究［18，19］中發(fā)現(xiàn)紫朱軟膏能夠有效提高糖尿病足及下肢慢性皮膚潰瘍的治愈率。本研究以糖尿病足潰瘍大鼠模型為平臺，觀察Notch 信號對炎癥因子、趨化因子和生長因子的作用，以及紫朱軟膏對該過程的干預(yù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性Sprague‐Dawley（SD）大鼠（72 只），清潔級，體質(zhì)量（180±10）g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫為（23±2）℃，相對濕度為（56±10）%，12 h 無光照/12 h 人工光照，自由飲食。實(shí)驗(yàn)程序遵循上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心指導(dǎo)原則。

1.2 主要試劑及藥物

高脂飼料成分：基礎(chǔ)飼料73%（大麥15%，小麥31%，玉米15%，麩皮15%，魚粉6%，豆粕、油和鹽共18%），豬油20%，奶粉2%，膽固醇1%，蔗糖4%。以上材料由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

鏈脲佐菌素（STZ），Sigma 公司；1.5% STZ 液配制方法：檸檬酸（FW：210.14）2.1 g 加入雙蒸水100 mL 中配成A 液。檸檬酸鈉（FW：294.10）2.94 g加入雙蒸水100 mL 中配成B 液。用時將A、B 液按1∶1 比例混合，pH=4.2～4.5，注射時用檸檬酸緩沖液以1.5%的濃度溶解。

外用重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子（商品名：貝復(fù)濟(jì)，rb‐bFGF），珠海億勝生物制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字S10980077。

Notch 信號通路激動劑與抑制劑：激動劑Rat Jagged1 Fc chimera（Mouse myeloma cell line，NSO derived rat Jagged 1 protein，Sigma），使 用 方法：50 μg 溶解在33.6 mL PBS 液，每只每次圍繞創(chuàng)面周邊多點(diǎn)皮下注射0.2 mL。抑制劑LY411575（γ‐secretase inhibitors），使 用 方 法：50 mg 溶 解 在33.6 mL 溶解液，每只每次圍繞創(chuàng)面周邊多點(diǎn)皮下注射0.2 mL。溶解液配方：10% DMSO，40%PEG300，5% Tween‐80，45% saline。使用方法：50 mg。

紫朱軟膏主藥與基質(zhì)輔料的比例為1∶8，其中主藥（重量計）：朱砂、紫草、龍血竭、黃芪、黃芪、冰片。各藥物比例為7∶3∶3∶6∶5∶1。藥物由武漢馬應(yīng)龍生產(chǎn)提供。

1.3 主要儀器

燙傷儀SQL‐5Q 燙傷儀，上海欣軟信息科技有限公司。ELISA 試劑盒，BD 公司。PureLink RNA Mini Kit（Thermo fisher）用于提取mRNA。Super‐Script Ⅲ第一鏈合成系統(tǒng)，Life Technologies 公司。SYBR?GreenFastMix，Takara 公司。血糖儀，羅氏公司。熒光定量PCR 儀，Applied Biosystems 公司。電泳儀，BIO‐RAD 公司。轉(zhuǎn)膜儀，BIO‐RAD 公司。微孔板掃描分光光度計MOX200R 型BioTek 公司。酶標(biāo)儀Thermo 公司。

1.4 糖尿病模型的建立

實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停簩?shí)驗(yàn)研究采用糖尿病足潰瘍大鼠模型［20］（D）作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，使用普通潰瘍大鼠模型（N）作為對照模型。方法如下：

1.4.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽?普通潰瘍組（N）用普通飼料飼養(yǎng)；糖尿病組用高脂飼料飼養(yǎng)8 周后，空腹24 h 后腹腔注射1.5%鏈脲佐菌素35 mg/kg，24 h 后尾靜脈取血測量血糖>16.7 mmol/L，制成糖尿病模型。評價標(biāo)準(zhǔn)：注射鏈脲佐菌素24 h 后，測得血糖大于16.7 mmol/L，穩(wěn)定24 h 后復(fù)測隨機(jī)血糖仍大于16.7 mmol/L。結(jié)果：糖尿病造模24 h 后測血糖大于16.7 mmol/L，可觀察到大鼠多尿，墊料潮濕，大鼠的活動力下降，隨后體重下降。

1.4.2 糖尿病足潰瘍模型制備 糖尿病大鼠造模成功2 周后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉2 mL/kg 劑量麻醉后使用燙傷儀燙傷（參數(shù)設(shè)置：接觸壓力9.8 N，探頭溫度90℃，持續(xù)時間10 s，接觸面積4 cm2），燙傷深度為深Ⅱ度。24 h 后沿著交界區(qū)清除殘留皮膚即造成潰瘍創(chuàng)面，制成糖尿病足潰瘍模型。評價標(biāo)準(zhǔn)：燙傷后可見皮膚蒼白光亮或皮膚有水皰出血。取燙傷區(qū)域皮膚組織固定于10%甲醛溶液中，H & E 結(jié)果可見皮膚組織炎癥細(xì)胞浸潤，毛囊、汗腺等附件破壞。

1.4.3 普通潰瘍模型 普通潰瘍大鼠模型（Normal ulcer，N）：普通飼料喂養(yǎng)8 周后，3%戊巴比妥鈉麻醉后使用恒溫恒壓燙傷儀器（設(shè)置90 ℃，10 s ，9.8 N）造成深Ⅱ度燙傷，完成普通潰瘍模型的制備，造模成功標(biāo)準(zhǔn)同上。

實(shí)驗(yàn)分組：72 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分為9 組。按照各模型建立方法建立各組模型，NC：普通潰瘍模型對照組；NT：普通潰瘍模型中藥組；DC：糖尿病足潰瘍模型對照組；DT：糖尿病足潰瘍模型中藥組；DW：糖尿病足潰瘍模型西藥組；DT‐A：糖尿病足潰瘍模型+激動劑+中藥組；DC‐A：糖尿病足潰瘍模型+激動劑組；DT‐I：糖尿病足潰瘍模型+抑制劑+中藥組；DC‐I：糖尿病足潰瘍模型+抑制劑組。其中，對照組采用生理鹽水換藥，西藥組貝復(fù)濟(jì)800 IU 每日換藥，中藥組紫朱軟膏每日換藥（藥物紗布制作方法：20 g 藥膏制作4 張藥物紗布，每張剪成16 片，每次一片換藥）。干預(yù)觀察7 d 后麻醉處死取材。

1.5 檢測方法

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）：檢測血清炎癥因子：TNF‐α、IL‐1β、IL‐6、IL‐17A。根據(jù)制造商的說明書，使用市售的ELISA 試劑盒（R＆D Systems，Minneapolis，MN，USA）測定傷口中炎性細(xì)胞因子的濃度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白質(zhì)濃度。將這些值標(biāo)準(zhǔn)化為由Pierce BCA 測定法測定的總蛋白質(zhì)含量。

RNA 分離和real‐time PCR：檢測創(chuàng)面組織炎性細(xì) 胞 因 子（TNF‐α、TGF‐α、TGF‐β、IL‐1β、IL‐6、IL‐17）和趨化因子IP‐10、IL‐8、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP‐1）。根據(jù)制造商的說明書，使用PureLink RNA Mini Kit（Thermo fisher）從創(chuàng)面組織中分離總RNA。 使 用Life Technologies 的SuperScript ⅢIII‐Strand Synthesis System 合成第一鏈cDNA。使用SYBR Green 作為實(shí)時PCR 進(jìn)行指標(biāo)，采用ABI StepOne Plus 實(shí)時PCR 系統(tǒng)。PCR 在95℃下進(jìn)行40 個循環(huán)15 s，在60℃下進(jìn)行1 min。在反應(yīng)過程中讀取熒光，允許連續(xù)監(jiān)測PCR 產(chǎn)物的量。使用Gap‐dh mRNA 作為內(nèi)部對照標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。見表1。

表1 引物序列信息Tab 1 Primer sequence information

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one‐way ANOVA），兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA 檢測結(jié)果

2.1.1 各組血清IL‐1β ELISA 檢測結(jié)果比較

NC 組與DC 組比較，DC 組的IL‐1β 含量較高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠IL‐1β 的表達(dá)高于普通對照組模型。DC 組與DC‐I 組比較，DC‐I 組的IL‐1β 含量較高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明Notch 信號抑制劑LY‐411575 可提高IL‐1β 含量。DC 組與DC‐A 組比較，DC‐A 組的IL‐1β 含量較低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.001）。 Notch 信號激動劑Jagged1 可降低實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠IL‐1β 的表達(dá)。DC 組與DT 組比較，DT 組的IL‐1β 含量較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明紫朱軟膏能降低實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠血清IL‐1β 的 含 量。DT 組 與DT‐I 組 比 較，DT 組 的IL‐1β 含量較低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明Notch 信號抑制劑LY‐411575 對紫朱軟膏降低IL‐1β 有 影 響，明 顯 減 弱 紫 朱 軟 膏 對IL‐1β 降 低 作用。見表2。

2.1.2 各組血清IL‐6 ELISA 檢測結(jié)果比較

NC 組與DC 組比較，DC 組的IL‐6 含量較高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠IL‐6 的表達(dá)高于普通對照組模型；DC 組與DC‐I組比較，DC‐I 組的IL‐6 含量較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明Notch 信號抑制劑LY‐411575可 降 低IL‐6 含 量。DC 組 與DT 組 比 較，DT 組 的IL‐6 含量較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明紫朱軟膏能降低實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠血清IL‐6 的含量。DT 組與DT‐I 組比較，DT 組的IL‐6 含量較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明Notch 信號抑制劑LY‐411575 對紫朱軟膏降低IL‐6 有影響，明顯減弱紫朱軟膏對IL‐6 的降低作用。見表2。

2.1.3 各組血清IL‐17A ELISA 檢測結(jié)果比較

NC 組 與DC 組 比 較，DC 組 的IL‐17A 含 量 較高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠IL‐17A 的表達(dá)高于普通對照組模型；DC 組與DC‐I 組比較，DC‐I 組的IL‐17A 含量較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明Notch 信號抑制劑LY‐411575 可 大 幅 度 降 低IL‐17A 含 量。DC 組 與DT 組比較，DT 組的IL‐17A 含量較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明紫朱軟膏能明顯降低實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠血清IL‐17A 的含量。DT 組與DT‐I組比較，DT 組的IL‐17A 含量較低，差異具有統(tǒng)計學(xué) 意 義（P<0.01），說 明Notch 信 號 抑 制 劑LY‐411575 對紫朱軟膏降低IL‐17A 有影響，明顯減弱紫朱軟膏對IL‐17A 的降低作用。見表2。

2.1.4 各組血清TNF‐α ELISA 檢測結(jié)果比較

NC 組 與DC 組 比 較，DC 組 的TNF‐α 含 量 較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠TNF‐α 的表達(dá)高于普通對照組模型；DC 組與DC‐I 組比較，DC‐I 組的TNF‐α 含量較低，差異有統(tǒng)計 學(xué) 意 義（P<0.01），說 明Notch 信 號 抑 制 劑LY‐411575 可 大 幅 度 降 低TNF‐α 含 量。DC 組 與DT 組比較，DT 組的TNF‐α 含量較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明紫朱軟膏能明顯降低實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠血 清TNF‐α 的 含量。DT 組與DT‐I 組比較，DT 組的TNF‐α 含量較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明Notch 信號抑制劑LY‐411575 對紫朱軟膏降低TNF‐α 有影響，明顯減弱紫朱軟膏對TNF‐α 的降低作用。見表2。

表2 ELISA 指標(biāo)結(jié)果總表（n=8,±s）Tab 2 Results of ELISA indicators（n=8,±s）

表2 ELISA 指標(biāo)結(jié)果總表（n=8,±s）Tab 2 Results of ELISA indicators（n=8,±s）

組別NC 組NT 組DC 組DT 組DW 組DT‐A 組DC‐A 組DT‐I 組DC‐I 組F P IL‐1β 71.95±4.20 59.27±1.18 243.28±6.36 104.54±8.43 326.18±4.20 127.32±4.43 151.26±2.24 258.18±0.41 258.95±2.22 1476.757<0.001 IL‐6 11.39±0.65 9.02±0.77 43.18±0.63 20.24±1.82 60.36±1.62 25.33±1.38 31.34±1.26 49.36±1.86 13.85±1.13 580.815<0.001 IL‐17A 34.03±0.76 29.88±0.80 172.23±6.31 44.39±5.16 159.59±4.30 63.61±1.61 75.74±2.55 121.46±3.32 41.76±1.61 767.809<0.001 TNF‐α 43.90±0.53 124.98±2.62 144.54±3.54 46.45±5.55 179.11±4.59 72.37±8.61 81.99±3.45 147.64±2.25 50.25±3.02 422.654<0.001

2.2 實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)（Real‐time PCR）檢測結(jié)果

2.2.1 腫 瘤 壞 死 因 子‐α（TNF‐α）PCR 檢 測 結(jié) 果NC 組 與DC 組 比 較，DC 組 的TNF‐α 含 量 較 高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠創(chuàng)面TNF‐α 的 表 達(dá) 高 于 普 通 對 照 組 模 型；DC 組 與DC‐I 組比較，DC‐I 組的TNF‐α 含量較低，具有統(tǒng)計學(xué) 差 異（P<0.01），說 明Notch 信 號 抑 制 劑LY‐411575 可 降低TNF‐α 含量。DC 組與DT 組比較，DT 組的TNF‐α 含量較低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明紫朱軟膏能明顯降低實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠血清TNF‐α 的含量。DT 組與DT‐A 組比較，DT‐A組的TNF‐α 含量較高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明Notch 激動劑Jagged1 對紫朱軟膏降低TNF‐α有負(fù)向影響，減弱紫朱軟膏對TNF‐α 降低作用。DT 組與DT‐I 組比較，兩組無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.146）。見表3。

2.2.2 白細(xì)胞介素‐1β（IL‐1β）PCR 檢測結(jié)果 NC組與DC 組比較，DC 組的IL‐1β 含量較高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠創(chuàng)面IL‐1β的表達(dá)高于對普通對照組模型；DC 組與DC‐I 組比較，DC‐I 組的IL‐1β 含量較低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明Notch 信號抑制劑LY‐411575 可降低IL‐1β 含量。DC 組與DT 組比較，DT 組的IL‐1β 含量較低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明紫朱軟膏能明顯降低實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠血清IL‐1β 的含量。DT 組與DT‐I 組比較，DT‐I 組的IL‐1β 含量較低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），說明Notch 信號抑制劑LY‐411575 對紫朱軟膏降低IL‐1β 有影響，增強(qiáng)紫朱軟膏對IL‐1β 的降低作用。見表3。

2.2.3 白細(xì)胞介素‐6（IL‐6）PCR 檢測結(jié)果 NC 組與DC 組比較，DC 組的IL‐6 含量較高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠創(chuàng)面IL‐6 的表達(dá)高于普通對照組模型；DC 組與DC‐I 組比較，DC‐I 組 的IL‐6 含 量 較 低，具 有 統(tǒng) 計 學(xué) 差 異（P<0.01），說 明Notch 信 號 抑 制 劑LY‐411575 可 降 低IL‐6 含量。DC 組與DT 組比較，DT 組的IL‐6 含量較低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明紫朱軟膏能明顯降低實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠血清IL‐6 的含量。DT 組與DT‐I 組比較，DT‐I 組的IL‐6 含量較低，具有統(tǒng)計學(xué) 差 異（P<0.01），說 明Notch 信 號 抑 制 劑LY‐411575 對紫朱軟膏降低IL‐6 有影響，明顯增強(qiáng)紫朱軟膏對IL‐6 的降低作用。見表3。

2.2.4 白細(xì)胞介素‐17（IL‐17）PCR 檢測結(jié)果 NC組與DC 組比較，DC 組的IL‐17 含量較高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠創(chuàng)面IL‐17的表達(dá)高于普通對照組模型；DC 組與DC‐I 組比較，DC‐I 組 的IL‐17 含 量 較 低，具 有 統(tǒng) 計 學(xué) 差 異（P<0.01），說 明Notch 信 號 抑 制 劑LY‐411575 可 降 低IL‐17 含量。DC 組與DT 組比較，DT 組的IL‐17 含量較低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明紫朱軟膏能明顯降低實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠血清IL‐17 的含量。DT 組與DT‐I 組比較，DT‐I 組的IL‐17 含量較低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明Notch 信號抑制劑LY‐411575 對紫朱軟膏降低IL‐17 有影響，明顯增強(qiáng)紫朱軟膏對IL‐17 的降低作用。見表3。

2.2.5 趨化因子IP‐10（IP‐10）PCR 檢測結(jié)果 NC組與DC 組比較，DC 組的IP‐10 含較高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠創(chuàng)面IP‐10 的表達(dá)高于普通對照組模型；DC 組與DC‐I 組比較，DC‐I 組 的IP‐10 含 量 較 低，具 有 統(tǒng) 計 學(xué) 差 異（P<0.01），說明Notch 信號抑制劑LY‐411575 可降低實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠IP‐10 含量。DC 組與DT 組比較，DT組的IP‐10 含量較低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明紫朱軟膏能降低實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠血清IP‐10 的含量。 DT 組與DT‐I 組比較，DT 組的IP‐10 含量明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.037），說明Notch信號抑制劑LY‐411575 對紫朱軟膏降低IP‐10 有正向影響，增強(qiáng)了紫朱軟膏對IP‐10 的降低作用。見表3。

2.2.6 白細(xì)胞介素‐8（IL‐8）PCR 檢測結(jié)果 NC 組與DC 組比較，DC 組的IL‐8 含量較高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠創(chuàng)面IL‐8 的表達(dá)高于普通對照組模型。DC 組與DC‐I 組比較，DC‐I 組 的IL‐8 含 量 較 低，具 有 統(tǒng) 計 學(xué) 差 異（P<0.01），說 明Notch 信 號 抑 制 劑LY‐411575 可 降 低IL‐8 含量。DC 組與DT 組比較，DT 組的IL‐8 含量較低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明紫朱軟膏能明顯降低實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠血清IL‐8 的含量。DT 組與DT‐I 組比較，DT‐I 組的IL‐8 含量較低，具有統(tǒng)計學(xué) 差 異（P<0.05），說 明Notch 信 號 抑 制 劑LY‐411575 對紫朱軟膏降低IL‐8 有正向影響，明顯增強(qiáng)紫朱軟膏對IL‐8 的降低作用。見表3。

2.2.7 單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP‐1）PCR 檢測結(jié)果 NC 組與DC 組比較，DC 組的MCP‐1 含較高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠創(chuàng)面MCP‐1 的表達(dá)高于于對照組模型；DC 組與DC‐I組比較，DC‐I 組的MCP‐1 含量較低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明Notch 信號抑制劑LY‐411575 可降低實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠MCP‐1 含量。DC 組與DT 組比較，DT 組的MCP‐1 含量較低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明紫朱軟膏能降低實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠血清MCP‐1 的含量。DT 組與DT‐I 組比較，兩組無有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.058），說明Notch 信號抑制劑LY‐411575 對紫朱軟膏降低MCP‐1 有無明顯影響。見表3。

2.2.8 轉(zhuǎn) 化 生 長 因 子α（TGF‐α）PCR 檢 測 結(jié) 果NC 組與DC 組比較，兩組無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.410）。DC 組與DC‐A 組比較，DC 組的TGF‐α 含量較高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明Notch 信號激動劑Jagged1 可降低實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠TGF‐α 的表達(dá)；DC 組與DC‐I 組比較，DC 組的TGF‐α 含量較低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明Notch 信號抑制劑LY‐411575 可增高實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠TGF‐α 含量。 DC 組 與DT 組 比 較，DT 組 的TGF‐α 含 量 較高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明紫朱軟膏能明顯增高實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠血清TGF‐α 的含量。 DT組與DT‐A 組比較，DT 組的TGF‐α 含量較高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明Notch 激動劑Jagged1能減弱紫朱軟膏對TGF‐α 的升高作用。DT 組與DT‐I 組比較，DT 組的TGF‐α 含量較低，具有統(tǒng)計學(xué) 差 異（P=0.006），說 明Notch 信 號 抑 制 劑LY‐411575 對紫朱軟膏升高TGF‐α 有正向影響，增強(qiáng)了紫朱軟膏對TGF‐α 的升高作用。見表3。

2.2.9 轉(zhuǎn) 化 生 長 因 子‐β（TGF‐β）PCR 檢 測 結(jié) 果NC 組與DC 組比較，DC 組的TGF‐β 含 量 低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠創(chuàng)面TGF‐β 的表達(dá)低于普通對照組模型；DC 組與DC‐A組比較，DC 組的TGF‐β 含量較高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.035），說明Notch 信號激動劑Jagged1 可降低實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠TGF‐β 的表達(dá)；DC 組與DC‐I 組比較，DC 組的TGF‐β 含量較低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.049），說 明Notch 信 號 抑 制 劑LY‐411575 可 增 高實(shí) 驗(yàn) 模 型 組 大 鼠TGF‐β 含 量。DC 組 與DT 組 比較，DT 組的TGF‐β 含量較高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.001），說明紫朱軟膏能增高實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠血清TGF‐β 的含量。DT 組與DT‐A 組比較，DT 組的TGF‐β 含量較高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.024），說明Notch 激動劑Jagged1 減弱了紫朱軟膏升高TGF‐β 的 作 用。DT 組 與DT‐I 組 比 較，DT 組 的TGF‐β 含量較低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.015），說明Notch 信號抑制劑LY‐411575 對紫朱軟膏升高TGF‐β 有正向影響，增強(qiáng)了紫朱軟膏對TGF‐β 的升高作用。見表3。

表3 各組炎癥及趨化因子Real?time PCR 結(jié)果總表（n=8,±s）Tab 3 Real?time PCR results of inflammatory factors and chemokines in each group（n=8,±s）

表3 各組炎癥及趨化因子Real?time PCR 結(jié)果總表（n=8,±s）Tab 3 Real?time PCR results of inflammatory factors and chemokines in each group（n=8,±s）

組別NC 組NT 組DC 組DT 組DW 組DT‐A 組DC‐A 組DT‐I 組DC‐I 組FP TNF‐α 0.10±0.01 1.13±0.26 3.18±0.41 1.82±0.14 1.33±0.12 2.73±0.13 4.47±0.58 1.47±0.12 2.12±0.26 48.681<0.001 IL‐1β 1.06±0.01 0.95±0.08 2.55±0.29 1.66±0.08 1.07±0.16 2.36±0.17 4.18±0.24 1.29±0.07 2.09±0.23 100.248<0.001 IL‐6 1.04±0.08 0.94±0.06 2.32±0.11 1.65±0.10 0.98±0.15 2.08±0.17 3.43±0.15 1.18±0.11 1.51±0.06 146.349<0.001 IL‐17 0.90±0.11 0.98±0.06 2.22±0.25 1.62±0.17 1.04±0.12 2.01±0.21 3.57±0.14 1.15±0.10 1.63±0.16 90.198<0.001 IP‐10 1.09±0.08 1.06±0.12 3.93±0.27 2.33±0.26 1.38±0.10 3.25±0.15 5.27±0.34 1.96±0.13 2.26±0.08 161.624<0.001 IL‐8 0.99±0.09 0.91±0.11 2.12±0.09 1.42±0.07 0.92±0.19 1.93±0.10 3.38±0.18 1.12±0.17 1.63±0.11 116.560<0.001 MCP‐1 1.44±0.06 1.22±0.22 4.20±0.32 2.46±0.17 1.83±0.19 4.23±0.15 6.52±0.39 2.08±0.25 3.13±0.17 165.940<0.001 TGF‐α 0.99±0.10 1.00±0.02 0.28±0.04 0.51±0.06 0.19±0.02 0.33±0.04 0.25±0.01 0.65±0.06 0.48±0.04 106.532<0.001 TGF‐β 1.06±0.06 1.12±0.11 0.37±0.05 0.59±0.07 0.26±0.02 0.46±0.06 0.24±0.06 0.74±0.06 0.48±0.09 68.802<0.001

3 討論

糖尿病足潰瘍的發(fā)展轉(zhuǎn)歸在炎癥期最為關(guān)鍵。糖尿病足潰瘍的發(fā)生發(fā)展與炎癥異常密切相關(guān)。促炎和抗炎調(diào)節(jié)異常會導(dǎo)致愈合延遲，糖尿病足潰瘍炎癥失調(diào)可破壞組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致創(chuàng)面組織的穩(wěn)態(tài)失衡和愈合延期，有研究顯示甚至在糖尿病足潰瘍發(fā)生前炎癥水平已經(jīng)上調(diào)［2］。Weigelt等［21］報道了糖尿病足潰瘍患者血清CRP、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白‐1β、纖維蛋白原、IL‐6、干擾素‐γ、誘導(dǎo)蛋白‐10 等炎癥標(biāo)志物的水平升高的機(jī)制。Tuttolo‐mondo 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病足潰瘍患者較糖尿病無足潰瘍患者其血漿IL‐6 水平和抵抗素水平較高。炎癥標(biāo)志物可評估糖尿病患者足部并發(fā)癥（如潰瘍發(fā)生率）的風(fēng)險和指示糖尿病足潰瘍嚴(yán)重程度的指標(biāo)［2］。近年來，越來越多的研究提示炎癥反應(yīng)及各類細(xì)胞因子的調(diào)控失衡在糖尿病足潰瘍的愈合中具有重要的作用。創(chuàng)面愈合包括炎癥期、增殖期和修復(fù)期三個階段［23］。創(chuàng)面炎癥反應(yīng)異常［24］、血管生成減少［25］和成纖維細(xì)胞增殖不足［26］都可導(dǎo)致創(chuàng)面愈合受阻。促炎介質(zhì)的充分表達(dá)可刺激產(chǎn)生細(xì)胞因子以募集中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞清除創(chuàng)面細(xì)菌和其他污染物［27］。然而，炎癥因子的持續(xù)表達(dá)又可導(dǎo)致愈合進(jìn)程的延遲，導(dǎo)致潰瘍轉(zhuǎn)為慢性［28］。炎癥因子的最佳釋放才能促進(jìn)傷口愈合。

糖尿病足潰瘍發(fā)病涉及多種復(fù)雜機(jī)制。Notch信號是一種參與細(xì)胞間通訊與免疫炎癥反應(yīng)的重要信號通路。Notch 信號通路在組織愈合過程中炎癥反應(yīng)、血管增殖、上皮化生、瘢痕調(diào)控起重要作用。李博文等［29］研究發(fā)現(xiàn)，抑制糖尿病足潰瘍大鼠Notch 信號表達(dá)可下調(diào)IL‐2、IL‐6、TNF‐α 表達(dá)，從而降低創(chuàng)面炎癥反應(yīng)，中藥藥膏能夠通過該途徑改善潰瘍愈合。有研究［16］報道Notch 信號基因敲除與DAPT 抑制可降低炎癥細(xì)胞因子（TNF‐α 和IL‐1β）的產(chǎn)生。阻斷巨噬細(xì)胞Notch 信號通路發(fā)現(xiàn)可抑制炎癥反應(yīng)和膠原沉積，有效減輕瘢痕形成，促進(jìn)創(chuàng)面愈合［17］。此外，Notch 信號通路還能刺激血管細(xì)胞增殖，加快缺血區(qū)的血管新生、組織成熟［30］，參與血管重構(gòu)的進(jìn)程［31］，促進(jìn)角膜緣干細(xì)胞分化和增殖［32］。

本研究結(jié)果表明，糖尿病足潰瘍大鼠模型的血清炎癥因子IL‐1β、IL‐6、TNF‐α、IL‐17 水平明顯高于普通潰瘍模型，表明大鼠血清炎癥處于高水平狀態(tài)；Notch 信 號 抑 制 劑LY‐411575 能 降 低IL‐6、TNF‐α、IL‐17A 含量，說明抑制Notch 信號能夠明顯降低部分炎癥因子的表達(dá)。紫朱軟膏能夠降低實(shí)驗(yàn)組糖尿病足潰瘍大鼠血清IL‐1β、IL‐6、TNF‐α、IL‐17 水 平；抑 制 劑LY‐411575 與 紫 朱 軟 膏 在 降 低IL‐6、TNF‐α、IL‐17A 方 面 存 在 互 相 拮 抗 的 現(xiàn) 象。糖尿病足潰瘍大鼠模型創(chuàng)面組織的炎癥因子IL‐1β、IL‐6、TNF‐α、IL‐17 和趨化因子IP‐10、IL‐8、MCP‐1水平明顯高于普通潰瘍模型，而生長因子TGF‐β 水平低于普通潰瘍模型。 Notch 信號抑制劑LY‐411575 明顯降低糖尿病足潰瘍大鼠炎癥因子IL‐1β、IL‐6、TNF‐α、IL‐17 和趨化因子IP‐10、IL‐8、MCP‐1 含量，增加生長因子TGF‐α、TGF‐β 表達(dá)，而激動劑Jagged1 則降低TGF‐α、TGF‐β 表達(dá)。這表明了抑制Notch 信號通路能夠降低炎癥因子IL‐6、TNF‐α、IL‐17A、IL‐8 和增加生長因子TGF‐α、TGF‐β 表達(dá)，激活Notch 則降低生長因子TGF‐α、TGF‐β 的表達(dá)，說明Notch 信號通路對糖尿病足潰瘍具有促炎表達(dá)和促部分細(xì)胞增殖雙重作用。中藥組能夠降低實(shí)驗(yàn)糖尿病足潰瘍大鼠創(chuàng)面IL‐1β、IL‐6、TNF‐α、IL‐17 和趨化因子IP‐10、IL‐8、MCP‐1水平，提高生長因子TGF‐α、TGF‐β 表達(dá)，說明紫朱軟膏能夠降低糖尿病足潰瘍大鼠炎癥因子和炎癥趨化水平，提高生長因子表達(dá)，減輕創(chuàng)面炎癥反應(yīng)強(qiáng)度，其作用途徑可能與抑制Nocth 信號通路表達(dá)有關(guān)。

中藥具有包括促進(jìn)創(chuàng)面愈合［33］，調(diào)節(jié)免疫力［34］，以及抗炎［35］的作用，中藥復(fù)方制劑能夠顯著促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合［36‐38］。紫朱軟膏是柳國斌教授臨床總結(jié)治療糖尿病足潰瘍的經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)過上海市科委的藥物現(xiàn)代化項(xiàng)目完成了藥學(xué)研究工作。本方由紫草、朱砂、阿膠、龍血竭、冰片、黃芪6 味中藥組成。其中，紫草涼血活血，朱砂解毒祛腐，兩君藥得清熱解毒祛腐之效；黃芪味甘性微溫，補(bǔ)氣生肌，阿膠、血竭同為甘平之品，有補(bǔ)血生肌斂瘡功效，其中阿膠補(bǔ)血滋陰，血竭為治療潰瘍不斂要藥，共為臣藥；冰片為佐藥，味辛，通透肌腠鎮(zhèn)靜止痛可助藥效?？v觀全方具有清熱解毒、祛腐生肌、補(bǔ)氣益血的功效。藥物單獨(dú)使用都具有促進(jìn)傷口愈合的作用［39‐41］。 本研究中紫朱軟膏能夠降低實(shí)驗(yàn)組糖尿病足 潰 瘍 大 鼠 血 清IL‐1β、IL‐6、TNF‐α、IL‐17 水 平。抑制劑LY‐411575 與紫朱軟膏在降低IL‐6、TNF‐α、IL‐17A 方面存在互相拮抗的現(xiàn)象。說明紫朱軟膏能降低糖尿病足潰瘍模型的炎癥因子水平，從而降低炎癥反應(yīng)強(qiáng)度，提高生長因子表達(dá)促進(jìn)創(chuàng)面愈合，其作用途徑可能與抑制Nocth 信號通路表達(dá)有關(guān)。