基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討蒼附導(dǎo)痰丸治療多囊卵巢綜合征的作用機(jī)制

胡攀偉，李 嘉，劉 丹，楊 紅

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院1.婦科，2.針灸科，3.生殖醫(yī)學(xué)中心，上海201203）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種生殖內(nèi)分泌疾病，在臨床上主要表現(xiàn)為少排卵或慢性無排卵、月經(jīng)不調(diào)、高雄激素血癥（如多毛、痤瘡），高胰島素血癥和肥胖［1］。有研究表明，PCOS 流行率為8%～13%，對女性的健康和生活質(zhì)量產(chǎn)生重大影響，合并增加罹患心血管疾病的風(fēng)險，同時將子宮內(nèi)膜癌風(fēng)險提高了2.7 倍，還可能誘發(fā)妊娠并發(fā)癥和情緒困擾等問題，嚴(yán)重影響家庭和諧［2］。早期診斷和治療PCOS 具有重要意義，目前治療PCOS 西醫(yī)手段眾多，但存在一定的局限性，停藥后容易復(fù)發(fā)［3］。PCOS 在祖國醫(yī)學(xué)寶庫中并無對應(yīng)的病名，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)可以歸屬“月經(jīng)后期”、“不孕”等中醫(yī)范疇。蒼附導(dǎo)痰丸出自《葉天士女科診治秘方》，主方由半夏、陳皮、蒼術(shù)、膽南星、茯苓、甘草、生姜、香附、枳殼構(gòu)成。全方發(fā)揮調(diào)理沖仁，化痰燥濕之功，主治經(jīng)水不足，閉經(jīng)，月經(jīng)稀發(fā)等。臨床研究［4］表明，蒼附導(dǎo)痰丸能夠促進(jìn)卵泡發(fā)育，改善體內(nèi)激素水平，恢復(fù)正常月經(jīng)規(guī)律，最終改善PCOS 患者排卵率和妊娠率，在臨床治療PCOS 中發(fā)揮良好效果。但是目前研究中針對蒼附導(dǎo)痰湯治療PCOS 多以臨床試驗(yàn)為主，動物實(shí)驗(yàn)及機(jī)制分析相對較少，蒼附導(dǎo)痰湯具體的作用機(jī)制還不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近些年來新起的一門學(xué)科，將系統(tǒng)生物學(xué)、藥理學(xué)、計(jì)算機(jī)等領(lǐng)域統(tǒng)籌結(jié)合，用當(dāng)代“疾病‐藥物‐靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)對中醫(yī)學(xué)進(jìn)行科學(xué)的解釋驗(yàn)證，為中醫(yī)藥研究提供科學(xué)理論支撐，為中醫(yī)藥的深入推廣提供基奠［5］。本文使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法推測蒼附導(dǎo)痰丸治療PCOS 的潛在機(jī)制與作用靶點(diǎn)，為蒼附導(dǎo)痰丸的深入應(yīng)用與研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 蒼附導(dǎo)痰丸的主要化學(xué)成分和對應(yīng)靶點(diǎn)

檢索TCMSP 中藥分析平臺分別獲得每一味中藥的化學(xué)成分，匯總導(dǎo)入Excel 中。根據(jù)ADME 篩選參數(shù)設(shè)置口服利用度OB≥30%，類藥性DL≥0.18［6］，獲得方劑的化合物成分，并結(jié)合參考文獻(xiàn)予以校正。運(yùn)用篩選到的化合物在TCMSP 平臺中查找對應(yīng)的靶點(diǎn)，然后運(yùn)用Perl 語言數(shù)據(jù)包對靶點(diǎn)名稱在全球蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Universal Protein，Uni‐prot）進(jìn)行基因名稱轉(zhuǎn)換，并對其中未能識別的靶點(diǎn)，在Uniprot 在 線 網(wǎng) 站（https：//www.uniprot.org/）進(jìn)行補(bǔ)充校正，匯總得到蒼附導(dǎo)痰丸的藥物作用靶點(diǎn)。通過檢索數(shù)據(jù)庫GeneCards（https：//www. genecards. org/） 和OMIM （https：//www.genecards.org/），以關(guān)鍵詞“polycystic ovarian syn‐drome”檢索相關(guān)基因，并導(dǎo)出Excel 匯總，對匯總的基因進(jìn)行查重，刪除重復(fù)值，得到疾病的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2 PCOS 疾病靶點(diǎn)和蒼附導(dǎo)痰丸藥物靶點(diǎn)交集篩選

利用R 數(shù)據(jù)包對藥物靶點(diǎn)和匯總得到的PCOS疾病靶點(diǎn)取交集，繪制韋恩圖，得到關(guān)鍵作用靶點(diǎn)交集。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用R 語言下的org 數(shù)據(jù)包對關(guān)鍵靶點(diǎn)規(guī)范基因名稱得到基因ID，同時對未能識別的基因進(jìn)行PubMed 網(wǎng) 站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢補(bǔ)充，最終得到藥物作用于疾病的關(guān)鍵基因ID 列表，導(dǎo)入String 在線平臺（https：//string-db.org/），選擇物種來源人源，設(shè)置0.9 高置信度，隱藏游離的點(diǎn)，將得到的文件導(dǎo)入Cytoscape（3.7.2）軟件，最終導(dǎo)出蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并對得到的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行R 語言分析，選擇排名前14 的關(guān)鍵基因，繪制條形圖。

1.4 疾病-藥物-主要活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用得到的藥物成分及靶點(diǎn)信息關(guān)系形成網(wǎng)絡(luò)關(guān)系文件，導(dǎo)入Cytoscape（3.7.2）軟件，得到PCOS-蒼附導(dǎo)痰丸-主要活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)可視化圖形。

1.5 KEGG 通 路 和GO 富 集 分 析

利用得到的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)基因ID 列表，結(jié)合R數(shù)據(jù)包，以P<0.05 為篩選條件對基因進(jìn)行京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析和基因本體（gene on‐tology，GO）分析。

2 結(jié)果

2.1 蒼附導(dǎo)痰丸成分和靶點(diǎn)收集

在TCMSP 中逐個檢索中藥成分，得到有效成分757 個。根據(jù)獲得的主要成分列表在TCMSP 中檢索對應(yīng)的作用靶點(diǎn)，匯總得到藥物靶點(diǎn)，去除重復(fù)值，得到蒼附導(dǎo)痰丸中有效作用靶點(diǎn)167 個，生姜53 個，枳殼75 個，膽南星68 個，香附142 個，蒼術(shù)50個，甘草141 個，陳皮54 個，半夏88 個，茯苓35 個。

2.2 蒼附導(dǎo)痰丸、多囊卵巢綜合癥共同靶點(diǎn)篩選

將以上藥物使用Perl 軟件經(jīng)Uniprot 數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)進(jìn)行基因名稱轉(zhuǎn)換，對不能識別的靶點(diǎn)進(jìn)行Uniprot 補(bǔ)充查詢，得到藥物靶點(diǎn)對應(yīng)的基因名稱列表。使用GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫收集到PCOS靶點(diǎn)2 270 個、624 個，合并后刪除重復(fù)值，利用在R數(shù)據(jù)包對藥物靶點(diǎn)基因列表和多囊卵巢綜合征疾病靶點(diǎn)取交集，得到105 個核心交集基因并繪制韋恩圖，見圖1。

圖1 蒼附導(dǎo)痰丸疾病和靶點(diǎn)的韋恩圖Fig 1 Venn diagram of disease and target of Cangfu Dao?tan pill

2.3 核心靶點(diǎn)表達(dá)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)收集

將得到的105 個共同靶點(diǎn)輸入在線String 數(shù)據(jù)庫繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置基因來源人源，進(jìn)行蛋白互作分析，設(shè)置0.9 置信度，隱藏游離的點(diǎn)，導(dǎo)出含有節(jié)點(diǎn)信息的TSV 文件，在Cytoscape（3.7.2）中分析節(jié)點(diǎn)信息并繪制網(wǎng)絡(luò)圖，包含節(jié)點(diǎn)90 個，邊234 條，見圖2。通過R 語言包對節(jié)點(diǎn)TSV 文件進(jìn)行分析，篩選前14 個核心調(diào)控基因靶點(diǎn)并繪制靶點(diǎn)數(shù)目條形圖，見圖3。

圖2 蒼附導(dǎo)痰丸的核心蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Core protein interaction network of Cangfu Daotan pill

圖3 蒼附導(dǎo)痰丸的核心靶點(diǎn)圖Fig 3 Diagram of core targets of Cangfu Daotan pill

2.4 疾病-藥物-主要活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析

將核心交集靶點(diǎn)基因?qū)?yīng)的藥物有效成分逐個對應(yīng)，按照靶點(diǎn)數(shù)目從大到小排列，發(fā)現(xiàn)其中有8種成分是成分間共有成分，給這些成分分別按照簡稱命名（A-F），然后運(yùn)用Cytoscape 構(gòu)建疾病-藥物-主要活性成分-靶點(diǎn)視化圖形，得到網(wǎng)絡(luò)有254 節(jié)點(diǎn)，2 219 邊，254 個節(jié)點(diǎn)中包含9 種中藥，140 種有效活性成分，105 個作用靶點(diǎn)，邊表示中藥分子化合物和靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。其中靶點(diǎn)排名前十的關(guān)鍵活性成分為槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、羅通定、卡維丁、7-羥基-2-甲基-3-苯基苯并吡喃-4-酮、美迪紫檀素、異鼠李素、植物甾醇，對應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)目分別為65、38、33、32、32、29、29、28、27、26，可以推測這10 種成分為蒼附導(dǎo)痰丸治療PCOS 的關(guān)鍵活性成分，見圖4。

圖4 疾病-藥物-主要活性成分-靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)Fig 4 Disease-drugs-main active ingredients-target visualization network

2.5 GO 功能富集分析和KEGG 信號通路分析

將得到的105 個靶點(diǎn)通過R 語言下的數(shù)據(jù)包進(jìn)行GO 下的生物過程（biological process，BP）分析和KEGG 信號通路分析，共有1 900 條生物功能顯著富集（P<0.05），1 692 個富集在BP 中。選擇BP條目中排名前20 繪制條形圖，主要涉及營養(yǎng)代謝，對藥物反應(yīng)，脂多糖反應(yīng)，細(xì)菌來源反應(yīng)，活性氧物種反應(yīng)，對類固醇激素反應(yīng)等，見圖5。富集到KEGG 通 路143 條，選 前20 條 繪 制 氣 泡 圖，主 要 包括流體剪切應(yīng)力和動脈硬化，晚期糖基化終產(chǎn)物通路，雌激素信號通路，白介素通路，內(nèi)分泌阻力通路，多巴胺能突觸，GnRH 信號通路，血管內(nèi)皮生長因子通路等，見圖6。

圖5 BP 條形圖Fig 5 Biological process（BP）bar chart

圖6 KEGG 氣泡圖Fig 6 KEGG bubble chart

3 討論

多囊卵巢綜合征臨床表現(xiàn)多為月經(jīng)后期閉經(jīng)、月經(jīng)稀發(fā)等。痰淤互結(jié)是多囊卵巢綜合征的發(fā)病重要因素，痰濕和瘀血是致病后的病理產(chǎn)物，不斷累積，得見多囊患者肥胖、多毛、倦怠乏力等表現(xiàn)，形肥痰閉則經(jīng)閉［7］。蒼附導(dǎo)痰丸是祛痰濕的經(jīng)典名方，以膽南星、半夏、蒼術(shù)為君藥化痰清熱燥濕，香附疏肝解郁，茯苓健脾利濕，枳殼理氣化痰，甘草調(diào)和諸藥，生姜溫中化痰，全方共奏健脾利濕，疏肝解郁，化痰散結(jié)之功。西藥在治療PCOS 上多采用避孕藥，雌孕激素等激素療法，容易產(chǎn)生副作用，而祖國醫(yī)學(xué)在治療PCOS 上有獨(dú)特的優(yōu)勢，副作用相對較少，接受度高。目前臨床上治療PCOS 多采用蒼附導(dǎo)痰丸為基礎(chǔ)方，清瘀散結(jié)，力求恢復(fù)患者自身的排卵節(jié)律，恢復(fù)月經(jīng)周期。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討蒼附導(dǎo)痰丸治療PCOS 的可能機(jī)制，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)藥物疾病靶點(diǎn)圖，系統(tǒng)預(yù)測潛在的作用靶點(diǎn)和有效活性成分。

經(jīng)過篩選，本研究得到了蒼附導(dǎo)痰丸治療PCOS 主要成分140 個，其中排名前十的關(guān)鍵活性成分為，槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、羅通定、卡維丁、7-羥基-2-甲基-3-苯基苯并吡喃-4-酮、美迪紫檀素、異鼠李素、植物甾醇。

其中羅通定為中樞性鎮(zhèn)痛藥物，有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜的作用［8］。脫氫卡維丁為季銨堿類化合物，有護(hù)肝、抗菌、止痛鎮(zhèn)靜作用［9］。美迪紫檀素為紫檀類化合物，有抗腫瘤、抗菌、抗氧化等藥理作用［10］。β-谷甾醇、植物甾醇均為甾醇成分。研究表明甾醇能夠抑制膽固醇吸收與合成，干擾甘油三酯吸收，改善體內(nèi)血脂水平［11］。其余的關(guān)鍵活性成分為藥用價值很高的黃酮類化合物，在自然界中廣泛存在。黃酮類化合物有抗炎，改善血管通透性、降低血脂、改善凝血功能，有類雌激素作用，能發(fā)揮抗炎、抗氧化功能［12］。槲皮素能夠改善PCOS 胰島素抵抗大鼠胰島素水平，抑制TLR/NF-κB 通路，改善PCOS 炎癥微環(huán)境，逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗［13］。研究表明山奈酚能夠激活A(yù)MPK/Nrf2/HO-1 信號通路，減少細(xì)胞凋亡，降低炎性反應(yīng)，改善氧化應(yīng)激［14］。木犀草素為天然黃銅化合物，有抗炎、抗凋亡、類雌激素、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用［15］。異鼠李素可以調(diào)控一氧化氮合酶活性發(fā)揮抗炎作用，還可抑制血小板聚集減少血栓形成，能清除自由基發(fā)揮抗氧化功能［16］。血糖、高胰島素、血脂升高是PCOS 血管內(nèi)皮損傷中重要致病因素［17］。PCOS 發(fā)病與炎性因子水平密不可分，炎性因子又可以增加血脂水平，加重PCOS 患者體內(nèi)炎性狀態(tài)［18］。通過對蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的核心基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)蒼附導(dǎo)痰丸主要通過JUN、MAPK3、HSP90AA1、MAPK1、ESR1、NR3C1、APP、MAPK14、MAPK8、VEGFA、EGFR、RB1、AR、IL6、NCOA1、RXRA 這16 個主要靶點(diǎn)發(fā)揮調(diào)控作用。MAPK3、MAPK1、MAPK14、MAPK8 屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶（mitogen-activated protein ki‐nases，MAPK）家族，調(diào)控炎癥、凋亡、生長因子等諸多生理活動。MAPK 通路能負(fù)反饋調(diào)節(jié)PI3K 通路，導(dǎo)致PCOS 胰島素抵抗的形成，而胰島素抵抗是PCOS 重要發(fā)病機(jī)制［19］。JUN 基因?qū)儆赯IP 家族核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子成員之一，與眾多基因啟動子結(jié)合發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。HSP90AA1 屬于熱休克家族成員，能夠編碼可誘導(dǎo)的分子伴侶，幫助特定的靶蛋白進(jìn)行空間折疊。研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）基因編碼的HSP90 主要存在于卵巢顆粒細(xì)胞，在優(yōu)勢卵泡中HSP90 含量明顯高于非優(yōu)勢卵泡，HSP90 能夠促進(jìn)調(diào)節(jié)卵泡成熟［20］。ESR1 能夠編碼一種雌激素受體，通過結(jié)合雌激素配體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，在卵泡發(fā)育和成熟中發(fā)揮重要作用［21］。NR3C1 能夠編碼兩種糖皮質(zhì)激素受體蛋白，通過與配體結(jié)合影響蛋白質(zhì)、脂肪代謝，調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，介導(dǎo)炎癥、免疫等多種生理病理過程［22］。VEGF基因編碼的血管內(nèi)皮生長因子在組織血管形成和許多疾病中起到關(guān)鍵作用，高表達(dá)的VEGF 與PCOS 密 切 相 關(guān)，且VEGF 是 控 制 卵 巢 血管生成的關(guān)鍵因素［23］。AR 為編碼雄激素受體的基因，高雄激素水平與PCOS 的進(jìn)展密切相關(guān)，高雄激素水平可導(dǎo)致PCOS 患者出現(xiàn)多毛、痤瘡等臨床癥狀。對26 例PCOS 卵巢組織與15 例正常組織的病理分析發(fā)現(xiàn)，雄激素受體可以間接降低PCOS 患者的生育能力，抑制卵泡發(fā)育，減少成熟卵形成［24］。IL6基因主要編碼一種細(xì)胞因子，廣泛參與免疫炎癥反應(yīng)，臨床研究［25］表明高水平的IL-6 是發(fā)生PCOS 胰島素抵抗的獨(dú)立危險因素，可加重PCOS病情發(fā)展。

GO 功能富集分析結(jié)果涉及營養(yǎng)代謝，對藥物反應(yīng)，脂多糖反應(yīng)，細(xì)菌來源反應(yīng)，活性氧物種反應(yīng)，對類固醇激素反應(yīng)等生物過程。脂多糖是參與炎癥代謝的關(guān)鍵分子，能夠刺激多種炎癥產(chǎn)生，同時還能促進(jìn)胰島素信號通路胰島素受體底物1 磷酸化，加劇胰島素抵抗［26］。PCOS 是一種慢性炎癥表現(xiàn)，而腸道細(xì)菌分子反應(yīng)與慢性炎癥有一定的聯(lián)系，細(xì)菌的異位可以讓更多的脂多糖入血，導(dǎo)致內(nèi)毒素上升，促進(jìn)卵巢環(huán)境炎性改變［27］?；钚匝跏菣C(jī)體有氧代謝的重要產(chǎn)物，在卵泡微環(huán)境中存在著動態(tài)氧化與抗氧化平衡，過量的活性氧能對機(jī)體產(chǎn)生損傷，PCOS 患者的抗氧化能力水平明顯低于正常對照組，提示PCOS 患者抗氧化能力降低，活性氧代謝失衡可能是PCOS 中的重要發(fā)病機(jī)制［28］。類固醇激素包括性激素、腎上腺皮質(zhì)激素，腎上腺皮質(zhì)激素在糖代謝、脂質(zhì)代謝、胰島素抵抗、慢性炎癥等多途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，雌孕激素配合發(fā)揮募集、選擇、優(yōu)勢化功能，促進(jìn)正常排卵，雄激素介導(dǎo)脂質(zhì)代謝、胰島素抵抗等，多途徑調(diào)節(jié)PCOS 患者體內(nèi)微環(huán)境。

通過篩選得到KEGG 前20 條信號通路，主要包括流體剪切應(yīng)力和動脈硬化通路，糖尿病并發(fā)癥年齡通路，雌激素信號通路，白介素通路，內(nèi)分泌阻力通路，多巴胺能突觸，GnRH 信號通路，血管內(nèi)皮生長因子通路等。PCOS 患者常伴胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝異常，進(jìn)一步增加了PCOS 患者罹患心血管疾病風(fēng)險，PCOS 的心血管結(jié)局多為代謝綜合征，心血管疾病和Ⅱ型糖尿病是PCOS 遠(yuǎn)期潛在的后遺癥［29］。目前臨床治療PCOS 多以改善胰島素抵抗、降低雄激素、激素治療為主，對脂質(zhì)代謝異常及伴隨的動脈硬化、遠(yuǎn)期心血管風(fēng)險并未予以深入研究。蒼附導(dǎo)痰丸通過調(diào)控流體剪切應(yīng)力和動脈硬化信號通路，能改善脂質(zhì)代謝及動脈硬化，降低PCOS 患者遠(yuǎn)期心血管不良事件。糖尿病并發(fā)癥年齡通路與糖尿病血管并發(fā)癥關(guān)系密切，產(chǎn)生大量糖基化產(chǎn)物，造成血管彈性降低，嚴(yán)重影響血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)［30］。相對正常人群，PCOS 患者血液系統(tǒng)處于高凝和低纖溶狀態(tài)［31］。雌激素信號通路、內(nèi)分泌阻力通路通過參與調(diào)控卵泡的生長排出，介導(dǎo)PCOS 患者的小卵泡形成。通過KEGG 分析可以獲知，蒼附導(dǎo)痰丸主要通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、改善胰島素抵抗、減少炎性反應(yīng)、降低動脈硬化及血管阻力等多途徑來達(dá)到治療PCOS 的目的。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對蒼附導(dǎo)痰丸治療PCOS進(jìn)行了系統(tǒng)的多成分、靶點(diǎn)、功能分析、信號通路分析，論證了蒼附導(dǎo)痰丸通過參與調(diào)控脂質(zhì)代謝、胰島素抵抗、炎性微環(huán)境、動脈硬化血管進(jìn)程、雄激素水平等發(fā)揮治療作用。本文初步闡釋了蒼附導(dǎo)痰丸治療PCOS 的可能作用機(jī)制，為后續(xù)深入研究及反向論證提供依據(jù)，期待未來有進(jìn)一步的制劑開發(fā)應(yīng)用，使更多的PCOS 患者獲益。