基于UPLC指紋圖譜、含量測(cè)定及化學(xué)計(jì)量學(xué)的乳香質(zhì)量評(píng)價(jià)

魏龍吟，毛民，沙皓淳，李欣欣，常阿倩，陳冬玲，尹貽慧，張凱，焦鳴杰，陳倩，徐文婕，李飛*（.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 0488；.北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，北京 00079）

乳香為橄欖科植物乳香樹（Boswellia carterii Birdw.）及同屬植物（Boswellia bhaw-dajianaBirdw.）樹皮滲出的樹脂，味辛、苦、溫，歸心、肝、脾經(jīng)，有活血定痛、消腫生肌之功效，臨床上主要用于胸痹心痛、胃脘疼痛、痛經(jīng)經(jīng)閉、產(chǎn)后瘀阻、癥瘕腹痛、風(fēng)濕痹痛、筋脈拘攣、跌打損傷、癰腫瘡瘍等[1]。以產(chǎn)地區(qū)分的埃塞俄比亞乳香及索馬里乳香為我國(guó)常用品。

有研究從乳香中分離得到五環(huán)三萜、四環(huán)三萜、大環(huán)二萜等萜類成分以及多種揮發(fā)油類成分，其中五環(huán)三萜類化合物最具特征性，而乳香酸為其中最具代表性的藥理活性成分[2]。其中11-羰基-β-乙酰乳香酸、11-羰基-β-乳香酸、α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙?；?β-乳香酸等乳香酸類成分具有抗炎[3]、抗?jié)僛4]、抗腫瘤[5]、改善記憶[6]、保護(hù)心腎[7-8]等藥理作用。

現(xiàn)有乳香質(zhì)量控制研究主要為乳香酸類成分含量測(cè)定及HPLC指紋圖譜。其中大部分含量測(cè)定研究?jī)H對(duì)11-羰基-β-乳香酸和11-羰基-β-乙酰乳香酸1～2種成分定量[9-10]，分析成分較少，或是采用UPLC-MS/MS法測(cè)定多種乳香酸含量[11]，儀器較為復(fù)雜，而現(xiàn)有的HPLC指紋圖譜研究[12-14]存在色譜峰分離度較低或樣品來(lái)源單一、共有峰數(shù)量少的問(wèn)題，由此可見(jiàn)現(xiàn)有研究難以較全面、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便地反映整體質(zhì)量。因此，本文嘗試建立乳香UPLC指紋圖譜以及5種乳香酸的含量測(cè)定方法，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)收集到的26批乳香飲片指紋圖譜進(jìn)行分析，為乳香質(zhì)量控制、評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters ACQUITY超高效液相色譜儀（UPLC）（美國(guó)沃特世科技有限公司，PDA檢測(cè)器，Empower色譜工作站）；ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；SB25-12DTDN型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；BT-25S型電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；高速粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司、DFT-50A）。

1.2 試藥

生品飲片來(lái)源信息見(jiàn)表1。11-羰基-β-乙酰乳香酸（批號(hào)：ST00940120）、3-乙?；?β-乳香酸（批號(hào)：ST79530120）、11-羰基-β-乳香酸（批號(hào)：ST80640105）、α-乳香酸（批號(hào)：ST16340105）、β-乳香酸（批號(hào)：ST80740105）對(duì)照品（上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，純度均≥98%）。

表1 26批乳香生品飲片來(lái)源信息Tab 1 Sample source informations of frankincense pieces

HPLC級(jí)乙腈（美國(guó)Fisher公司）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；磷酸（分析純、天津市大茂化學(xué)試劑廠）；甲醇（分析純、北京化工廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 供試品溶液 取乳香樣品，粉碎（過(guò)4號(hào)篩），精密稱定0.1 g，加入甲醇20 mL，稱重，超聲處理30 min后（功率 500 W，頻率 40 kHz），甲醇補(bǔ)重，取續(xù)濾液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液 取11-羰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸、α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙?；?β-乳香酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成質(zhì)量濃度為0.606、0.606、0.642、0.650、0.848 mg·mL－1的混合對(duì)照品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）。以0.1%磷酸水為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫：0～4 min，60%B；4～5 min，60%～70%B；5～35 min，70%B；35～60 min，70%～100%B。流 速0.3 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量5 μL。

2.3 乳香指紋圖譜建立

2.3.1 精密度試驗(yàn) 按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備乳香（S7）供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。將圖譜導(dǎo)入 “中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”進(jìn)行分析，相似度均大于0.99。以6號(hào)峰的保留時(shí)間及峰面積為參照，計(jì)算得到其他各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及峰面積RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備乳香（S7）供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。將圖譜導(dǎo)入 “中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”進(jìn)行分析，相似度均大于0.95。以6號(hào)峰為參照，計(jì)算得其他各共有峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于3%，表明樣品在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取乳香（S7）樣品粉末6份，每份0.1 g，按“2.1.1”項(xiàng)下樣品制備方法平行制備6份，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。將圖譜導(dǎo)入 “中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”進(jìn)行分析，得到相似度均大于0.95，以6號(hào)峰為參照，計(jì)算得其他各共有峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于3%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.4 乳香指紋圖譜的建立 取各批次乳香樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”進(jìn)行分析，以 S7樣品為參照?qǐng)D譜，使用平均數(shù)法結(jié)合多點(diǎn)校正進(jìn)行匹配，時(shí)間窗寬度為0.1 min，得到疊加指紋圖譜（如圖1）及對(duì)照?qǐng)D譜（如圖2A）。

圖1 26批乳香樣品UPLC疊加圖譜（S1～S26）及對(duì)照?qǐng)D譜（R）Fig 1 UPLC fingerprints of 26 batches of frankincense（S1～S26）and reference fingerprints（R）

共確定出24個(gè)共有峰，通過(guò)與混合對(duì)照品色譜圖（見(jiàn)圖2B）的比對(duì)，確認(rèn)了5個(gè)乳香酸成分色譜峰，且分離度良好。

圖2 乳香對(duì)照指紋圖譜（A）和混合對(duì)照品（B）的UPLC色譜圖Fig 2 Frankincense referential fingerprint（A）and mixed reference of UPLC（B）

2.3.5 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 根據(jù)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”得出的26批乳香樣品與對(duì)照指紋圖譜相似度結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，26批乳香樣品與對(duì)照指紋圖譜（R）相比較，相似度結(jié)果在0.762～0.989，其中23批乳香指紋圖譜相似度大于0.89，占總批次的88.46%，1批乳香相似度低于0.80，占總批次的3.85%，表明大部分批次乳香樣品相似度差異較小。

表2 26批乳香樣品指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 2 UPLC fingerprints similarity of 26 batches of frankincense

2.4 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.4.1 聚類分析 以乳香樣品指紋圖譜的24個(gè)共有峰的峰面積為變量，導(dǎo)入SAS 9.2軟件，采用離均差平方和法對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。當(dāng)分類距離為8.5時(shí)，26批樣品可聚為3類，其中第一類編號(hào)為S1、S7～S12、S19的8個(gè)批次，第二類為編號(hào)S2～S5、S14～S16、S18、S22～S25的12個(gè)批次，第三類為編號(hào)S6、S13、S17、S20、S21、S26的6個(gè)批次，說(shuō)明不同批次的乳香樣品整體質(zhì)量存在一定差異性。

圖3 26批次乳香聚類分析結(jié)果Fig 3 Dendrogram of 26 batches of frankincense

2.4.2 主成分分析 將26批乳香樣品指紋圖譜的24個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA-P14.1軟件進(jìn)行因子分析，結(jié)果見(jiàn)表3，共提取到5個(gè)主成分，其中前四個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為85.21%，特征值大于1，說(shuō)明選取4個(gè)主成分即可表征乳香指紋圖譜的85%以上的信息，可用于評(píng)價(jià)乳香質(zhì)量。

表3 乳香樣品主成分分析特征值及方差貢獻(xiàn)率Tab 3 Characteristic values of principal components and variance contribution rate of frankincense

通過(guò)選取的4個(gè)主成分繪制主成分得分圖（見(jiàn)圖4A），得到聚類分析中第一類主要位于右上象限，第二類主要位于中部，第三類主要位于右下象限，說(shuō)明24批次主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果相似，其中S14、S16批次可能由于主成分未包含全部信息從而與聚類分析結(jié)果存在差異。

將得到的成分矩陣進(jìn)行正交旋轉(zhuǎn)，得到主成分因子旋轉(zhuǎn)載荷矩陣表，見(jiàn)表4。以載荷值的絕對(duì)值＞0.6記錄，得到色譜峰3、7～9、11、13、16（α-乳香酸）、18～20、23、24（3-乙?；?β-乳香酸）在主成分1上有較高載荷，色譜峰5（11-羥基-β-乳香酸）、6、10、12（11-羰基-β-乙酰乳香酸）、14、15、16（α-乳香酸）、17（β-乳香酸）、24（3-乙?；?β-乳香酸）在主成分2上有較高載荷，色譜峰1、22在主成分3上有較高載荷，表明了這些色譜峰所代表成分的含量與主成分較高的相關(guān)程度。

表4 主成分因子旋轉(zhuǎn)載荷矩陣表Tab 4 Composition matrix of principal component factors

以4個(gè)主成分 M1、M2、M3、M4作為乳香質(zhì)量信息表征載體，將24個(gè)共有峰峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并在主成分的線性表達(dá)式中進(jìn)行向量運(yùn)算，將計(jì)算結(jié)果與主成分的方差貢獻(xiàn)率加權(quán)，得到乳香質(zhì)量評(píng)價(jià)表達(dá)式：M＝47.92% M1＋35.64% M2＋11.16% M3＋5.29% M4，最終計(jì)算后得到的綜合評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表5。聚類分析第一類中的 S19、S10、S12、S11、S1的5個(gè)批次綜合評(píng)分排序前五，S7、S9、S8綜合評(píng)分排序在7、9、11位，排序均較高，表明聚類中的第一類，同時(shí)主成分分析位于右上象限的乳香整體質(zhì)量較好。

表5 26批次乳香主成分得分、綜合得分及排名Tab 5 Principal component score，comprehensive score，ranking of 26 batches of frankincense

2.4.3 偏最小二乘判別分析 將主成分分析得分圖進(jìn)行監(jiān)督模式識(shí)別方法偏最小二乘判別建模分析，得到相應(yīng)得分圖（見(jiàn)圖4B），并采用變量重要投影（VIP）法篩選出影響乳香批次間差異的主要成分，結(jié)果見(jiàn)圖5。以VIP值＞1.0為標(biāo)準(zhǔn)，可篩選出對(duì)乳香質(zhì)量有關(guān)鍵性影響的10個(gè)成分，按影響大小排序分別為5（11-羰基-β-乳香酸）、2、8、12（11-羰基-β-乙酰乳香酸）、15、6、10、4、24、17（β-乳香酸）號(hào)色譜峰對(duì)應(yīng)成分。

圖4 26批乳香樣品主成分分析（A）及偏最小二乘判別分析（B）得分圖Fig 4 PCA（A）and PLS-DA（B）score diagrams of 26 batches of frankincense

圖5 偏最小二乘判別分析VIP值圖Fig 5 VIP of PLS-DA

2.5 5種乳香酸類成分含量測(cè)定

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，稀釋成系列線性溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 5種乳香酸類成分線性關(guān)系Tab 6 Linear relationships of 5 kinds of boswellic acids

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取乳香（S7）供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄11-羰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸、α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙?；?β-乳香酸的峰面積，計(jì)算RSD分別為0.34%、0.54%、0.26%、0.28%、0.57%，均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取乳香（S7）樣品粉末6份，每份0.1 g，按“2.1.1”項(xiàng)下樣品制備方法平行制備6次，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果11-羰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸、α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙?；?β-乳香酸的峰面積，計(jì)算RSD分別為2.5%、1.6%、0.95%、2.0%、0.78%，均小于3%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取乳香（S7）供試品溶液按“2.2”項(xiàng)下色譜條件于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果11-羰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸、α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙?；?β-乳香酸的RSD值分別為0.42%、0.17%、1.3%、1.9%、0.28%，RSD值均小于3%，說(shuō)明樣品在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量乳香（S7）樣品粉末6份，每份0.05 g，分別精密加入適量對(duì)照品，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算11-羰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸、α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙?；?β-乳香酸的平均加樣回收率依次為96.37%、97.86%、98.99%、100.57%、99.51%，RSD值分別為1.2%、2.7%、2.0%、2.1%、2.8%，表明該方法回收率良好。

2.5.6 含量測(cè)定結(jié)果 取各批次乳香樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，在“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄對(duì)應(yīng)色譜峰的峰面積，計(jì)算5種乳香酸含量，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 26批次乳香中5種乳香酸類成分含量測(cè)定結(jié)果(%，n＝3)Tab 7 Results of content determination of 5 kinds of boswellic acids in 26 batches of frankincense (%，n＝3)

3 討論

試驗(yàn)前期對(duì)色譜條件進(jìn)行了考察，考察了4種不同流動(dòng)相系統(tǒng)（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸水、乙腈-磷酸水），結(jié)果顯示乙腈-磷酸水系統(tǒng)效果最優(yōu)，進(jìn)一步對(duì)磷酸水酸度（0.05%磷酸、0.2%磷酸、0.5%磷酸）、不同的柱溫（35、40℃）、不同進(jìn)樣量（2、4、6、8 μL）、不同檢測(cè)波長(zhǎng)（254、270、280 nm）進(jìn)行考察，最終確定了本試驗(yàn)的色譜條件，所得到的色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰信息較多。

26批乳香樣品的相似度為0.762～0.989，聚類分為3類，顯示出乳香樣品存在的質(zhì)量差異性，表明對(duì)乳香質(zhì)量進(jìn)行控制的必要性；而同來(lái)源、同產(chǎn)地的13批北京同仁堂乳香樣品的相似度在0.904～0.989，批次間差異小，質(zhì)量穩(wěn)定，提示選擇同來(lái)源、同產(chǎn)地的乳香對(duì)用藥過(guò)程穩(wěn)定性、臨床療效有一定幫助。

在明確質(zhì)量差異貢獻(xiàn)較大的指標(biāo)性成分時(shí)，確定了對(duì)乳香質(zhì)量有較大影響的10個(gè)色譜峰成分，通過(guò)對(duì)照品的指認(rèn)，僅可確定其中3種成分，后續(xù)可結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對(duì)未知的7個(gè)色譜峰成分進(jìn)行定性定量研究，以更準(zhǔn)確、全面地控制乳香的質(zhì)量。

本研究建立了乳香中5種乳香酸類成分的含量測(cè)定方法及乳香的UPLC指紋圖譜，結(jié)合HCA、PCA及PLS-DA，形成了乳香品質(zhì)評(píng)價(jià)的化學(xué)識(shí)別模型，并可篩選出影響質(zhì)量的關(guān)鍵性成分。該方法可更簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、全面地評(píng)價(jià)乳香質(zhì)量，為完善乳香質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供一定參考。