基于外觀性狀及內(nèi)在成分的龍膽藥材等級劃分

吳曉燕，翁麗麗，宿瑩，劉戰(zhàn)，姜雨昕，孫金，李翟，侯曉琳（長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春 130117）

龍膽始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，為龍膽科植物龍膽（Gentiana scabraBge.）、條葉龍膽（G.manshuricaKitag.）、三花龍膽（G.triflorapall.）或滇龍膽（G.rigescensFranch.）的干燥根及根莖[1]。龍膽為傳統(tǒng)常用大宗藥材，性味苦、寒；歸肝、膽經(jīng)；主要化學(xué)成分為環(huán)烯醚萜類化合物，具有清火燥濕、瀉肝膽火、清熱健胃等作用；臨床上主要應(yīng)用于治療濕熱黃疸、帶下、濕疹瘙癢、肝火目赤、耳鳴耳聾等癥狀[2-3]。龍膽主產(chǎn)于黑龍江、吉林、遼寧等地，國內(nèi)外市場對龍膽的需求量呈逐年上升趨勢，藥用資源開發(fā)潛力巨大。

中藥材等級不僅是評價(jià)藥材質(zhì)量的重要依據(jù)，也是影響藥材價(jià)格高低的主要因素。中藥商品規(guī)格代表了人們對中藥品質(zhì)的一種認(rèn)識，且其品質(zhì)與臨床發(fā)揮的療效密切相關(guān)，是近幾年中藥研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)問題[4-6]。目前市場上流通的龍膽藥材主要來源于龍膽科龍膽的干燥根及根莖，野生龍膽資源很少，多為人工栽培龍膽，故本研究所用龍膽均為人工栽培龍膽科龍膽的干燥根及根莖。關(guān)于龍膽等級劃分，目前使用最多的是1984年頒布的《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》[7]，距今已有30多年，參考指標(biāo)較少、等級劃分不明確。當(dāng)前市面上，存在將龍膽藥材及飲片不分等級全部混合統(tǒng)裝現(xiàn)象，難以實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)。2020年版《中國藥典》一部中規(guī)定以龍膽苦苷為評價(jià)藥材質(zhì)量的指標(biāo)性成分，由于不同產(chǎn)地龍膽品質(zhì)各有差異，其他成分含量也不盡相同，以單一成分作為指標(biāo)并不能全面反映藥材質(zhì)量。因此，本研究利用現(xiàn)代分析技術(shù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，在傳統(tǒng)外觀性狀指標(biāo)基礎(chǔ)上，增加色度指標(biāo)，并加入體現(xiàn)龍膽內(nèi)在成分的指標(biāo)——水溶性浸出物、龍膽苦苷、馬錢苷酸和獐牙菜苦苷進(jìn)行等級標(biāo)準(zhǔn)研究，為初步制訂龍膽藥材等級標(biāo)準(zhǔn)提供更加全面的劃分依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Prominence-ILC-2030型高效液相色譜儀（島津企業(yè)管理中國有限公司）；NH300型電腦色差儀（深圳三恩馳科技有限公司）；FA1004B型萬分之一電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；KQ3200E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JA2603B型千分之一電子天平（上海天美天平儀器有限公司）；Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（長春弘揚(yáng)科技有限公司）。

1.2 試藥

甲醇、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Chemical），磷酸（色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），水為超純水。龍膽苦苷對照品（批號：110770-201716，純度：97.6%）、馬錢苷酸對照品（批號：111865-201704，純度：97.4%）、獐牙菜苦苷對照品（批號：110785-201404，純度：98.3%）（中國食品藥品檢定研究院）。

45批龍膽藥材由吉林省北藥藥材加工有限公司收集，分別產(chǎn)自黑龍江大興安嶺（編號L01～L21）、黑龍江小興安嶺（編號L22～L30）、吉林省撫松縣（編號L31～L40）、遼寧省清源滿族自治縣（編號L41～L45），經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)翁麗麗教授鑒定，均為龍膽科植物龍膽（Gentiana scabra）的干燥根及根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材長度、須根數(shù)、直徑、粉末色度測量

45批龍膽藥材樣品，每批隨機(jī)選取5根完整的藥材，采用游標(biāo)卡尺測量根莖至根末端的長度，取平均值；數(shù)須根數(shù)，取平均值；采用游標(biāo)卡尺測量根上（根莖）、中（簇生根中部）、下（簇生根尾部）3部分直徑，取平均值。粉末色度測定條件為：可選光源為D65，8度視場，4 mm測定孔徑，LED 藍(lán)光激發(fā)，儀器誤差：△E*ab≤0.4。取龍膽樣品（過四號篩），按照以上色度測定條件進(jìn)行樣品顏色測定，對儀器進(jìn)行黑白板校正以后，測定L*，a*，b*值，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次，計(jì)算每份樣品的平均總色差值，總色差值（E*ab）＝（L*2＋a*2＋b*2）1/2。藥材外觀性狀具體測量結(jié)果見表1。

表1 龍膽藥材外觀性狀測定結(jié)果Tab 1 Determination of appearance characteristics of Gentiana

2.2 水溶性浸出物

照2020年版《中國藥典》四部通則2201項(xiàng)下的熱浸法測定45批龍膽藥材水溶性浸出物，結(jié)果見表2。

2.3 龍膽苦苷含量測定

照2020年版《中國藥典》一部龍膽含量測定項(xiàng)下規(guī)定的龍膽苦苷的含量測定方法，對45批龍膽藥材用高效液相色譜儀測定，高效液相色譜圖見圖1，測定結(jié)果見表2。

2.4 馬錢苷酸、獐牙菜苦苷含量測定

2.4.1 色譜條件 依利特Hypersil ODS2 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測波長：240 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：10 μL；流速：1.0 mL·min－1；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脫（0～33 min，5%→7%A；33～40 min，7%→8%A；40～50 min，8%→95%A；50～60 min，95%→5%A）。

2.4.2 混合對照品溶液的制備 取馬錢苷酸、獐牙菜苦苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含馬錢苷酸0.10 mg、獐牙菜苦苷0.05 mg的混合對照品溶液，搖勻，即得。

2.4.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過四號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 線性關(guān)系考察 按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備不同質(zhì)量濃度的系列混合對照品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，mg·mL－1）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。馬錢苷酸的回歸方程為y＝3.62×105x＋3.75×104，r＝0.9998；獐牙菜苦苷回歸方程為y＝1.04×105x－1.94×103，r＝0.9999，兩成分在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積積分值，結(jié)果馬錢苷酸對照品峰面積積分值RSD值為0.80%，獐牙菜苦苷對照品RSD值為0.83%。表明方法精密度良好。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品共6份，按“2.4.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測定。結(jié)果馬錢苷酸峰面積積分值RSD值為1.6%，獐牙菜苦苷峰面積積分值RSD值為1.5%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取供試品，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h，進(jìn)樣測定，記錄峰面積積分值。結(jié)果馬錢苷酸峰面積積分值RSD值為0.70%，獐牙菜苦苷對照品峰面積積分值RSD值為0.61%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.8 加樣回收試驗(yàn) 稱取已知含量的樣品共6份，分別精密加入對照品適量，依法測定，計(jì)算回收率。結(jié)果馬錢苷酸平均回收率為100.3%，RSD值為0.40%；獐牙菜苦苷平均回收率為100.1%，RSD值為0.78%。表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.4.9 樣品含量測定 取45批龍膽藥材，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，記錄馬錢苷酸、獐牙菜苦苷的峰面積，計(jì)算樣品中馬錢苷酸、獐牙菜苦苷的含量，高效液相色譜圖見圖2，測定結(jié)果見表2。

表2 龍膽浸出物、龍膽苦苷、馬錢苷酸和獐牙菜苦苷測定結(jié)果Tab 2 Determination of extract，gentiopicrin，marcinoside and swertiamain

圖2 對照品（A）及供試品（B）色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of control（A）and sample（B）

2.5 藥材外觀性狀與內(nèi)在成分的相關(guān)性分析

采用SPSS 21.0軟件對45批龍膽藥材長度、須根數(shù)、直徑、色度、浸出物、龍膽苦苷、馬錢苷酸及獐牙菜苦苷含量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果見表3。龍膽的內(nèi)在成分水溶性浸出物、龍膽苦苷、馬錢苷酸及獐牙菜苦苷含量與外觀性狀藥材長度、須根數(shù)、直徑及總色差值成顯著正相關(guān)，龍膽藥材長度越長、須根數(shù)越多、直徑越粗、顏色越淺，龍膽的內(nèi)在成分（包括浸出物、龍膽苦苷、馬錢苷酸和獐牙菜苦苷）的含量越高。

表3 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果Tab 3 Pearson correlation analysis

2.6 藥材質(zhì)量等級劃分

根據(jù)外觀性狀及內(nèi)在成分含量多個(gè)指標(biāo)的相關(guān)性，采用SPSS 21.0軟件，以藥材長度、須根數(shù)、直徑、總色差值、浸出物、龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷的含量作為分級指標(biāo)變量進(jìn)行K-均值聚類分析，最終聚類中心值見表4，45批藥材樣品可劃分為兩個(gè)等級，結(jié)果見圖3，L01～L14、L16、L22～L34、L41為一等；L15、L17～L23、L35～L40、L42～L45為二等，以最終聚類中心值作參考，制訂龍膽藥材等級劃分標(biāo)準(zhǔn)，見表5。

表4 K-均值聚類分析的最終聚類中心值Tab 4 Final cluster center value of K-mean cluster analysis

表5 龍膽藥材質(zhì)量等級劃分Tab 5 Quality classification of Gentiana

圖3 K-均值聚類分析樹狀圖Fig 3 Tree diagram of K-means cluster analysis

3 討論

中藥的性狀判定是傳統(tǒng)質(zhì)量評價(jià)主要形式，但傳統(tǒng)性狀評價(jià)具有很大的主觀性。近年來，色差儀在中藥材顏色的量化檢測中受到廣泛應(yīng)用[7-10]。本研究采用色差儀測量龍膽藥材粉末色度，比肉眼觀察顏色深淺更為精準(zhǔn)。吳翠[11]研究發(fā)現(xiàn)，5-羥甲基糠醛普遍存在于中藥中，其含量與藥材的色澤、年份存在相關(guān)性，一些藥材貯存時(shí)間越久，貯存或加工溫度越高，5-羥甲基糠醛的含量越高，藥材顏色也越深，有效成分也就越低。本研究表明，龍膽藥材顏色越深，其龍膽苦苷等有效成分含量越低，由此猜測，這可能與其采收加工或貯存時(shí)間、貯存時(shí)的溫度有關(guān)，后續(xù)研究可以考慮增加5-羥甲基糠醛的測定驗(yàn)證這一猜想。

根及根莖類藥材在植物藥中所占比例大，在中藥中占有舉足輕重的地位。該類藥材傳統(tǒng)上主要按照基原、產(chǎn)地、部位、采收加工方法等劃分規(guī)格，并主要以可以方便掌握的性狀作為劃分依據(jù)[12-14]。中藥成分的復(fù)雜多樣決定了單一成分的含量不能全面反映藥材質(zhì)量，必須采用多成分、多指標(biāo)進(jìn)行綜合質(zhì)量分析[15]。本研究在對龍膽質(zhì)量進(jìn)行傳統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，增加了內(nèi)外指標(biāo)的聯(lián)系，通過K-均值聚類分析初步劃定了較明確的等級范圍，制訂的標(biāo)準(zhǔn)從外在品質(zhì)到內(nèi)在品質(zhì)均更加全面、具體，對龍膽藥材等級劃分及規(guī)范性貯存等具有積極意義，也為其他根及根莖類中藥的等級劃分提供了很好的思路。后期可以增大樣品量及樣品產(chǎn)地來源，以期利用現(xiàn)代先進(jìn)科技手段，盡最大可能地保障和控制龍膽的質(zhì)量，從而篩選優(yōu)良龍膽藥材資源，更好地實(shí)現(xiàn)藥材的優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)。