藏藥喜馬拉雅紫茉莉的分子光譜鑒別與質(zhì)量評價研究

翟小林，王丹，趙禾笛，戚苗，宮源，王艷敏，陳建波，王晶娟*（.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 02488；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 02488；.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 02488）

喜馬拉雅紫茉莉為紫茉莉科植物喜馬拉雅紫茉莉Mirabilis himalaica（Edgew.）Heim.的干燥根[1]，在藏醫(yī)中名為巴朱，具引黃水、益腎滋補、利尿排石等功效，常用于治療腰痛、關(guān)節(jié)痛、水腫、淋病、腎炎、陽痿、子宮癌等病[1-3]。喜馬拉雅紫茉莉為藏醫(yī)常用藥，用藥歷史悠久，在多種藏醫(yī)成藥中為主要藥味?，F(xiàn)代研究表明，喜馬拉雅紫茉莉中含有魚藤酮類、葫蘆巴堿、三萜、胡蘿卜苷、β-谷甾醇、揮發(fā)油、甾體、不飽和脂肪酸等成分[4-6]。

喜馬拉雅紫茉莉現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有性狀和顯微鑒別[1]，缺少客觀量化的理化指標(biāo)。根據(jù)喜馬拉雅紫茉莉“粉末灰白色、淀粉粒眾多、草酸鈣針晶眾多”等特征[1]，本研究選擇可見光譜、紅外光譜作為理化鑒別方法。藥材外觀顏色是質(zhì)量評價的重要指標(biāo)，藥材的色度往往與質(zhì)量相關(guān)[7-8]。故本試驗在傳統(tǒng)鑒別的基礎(chǔ)上，以不同產(chǎn)地藥材粉末色度值為切入點，再結(jié)合表征藥材整體成分的紅外光譜，既可探究不同產(chǎn)地喜馬拉雅紫茉莉的外在差異，又能反映顯微特征（淀粉粒、草酸鈣）及潛在的藥效物質(zhì)群信息，根據(jù)光譜圖的改變可反映中藥化學(xué)成分的變化與差別[9-10]，紅外光譜法也是現(xiàn)在應(yīng)用較多的藥材鑒別方法[11-15]。

除存在缺少客觀量化的理化指標(biāo)的問題外，喜馬拉雅紫茉莉與紫茉莉等易混淆品間的快速區(qū)分問題也亟待解決。喜馬拉雅紫茉莉與紫茉莉同為紫茉莉科植物，在本草中有將兩者混淆記載的情況[6]。且在紫茉莉的化學(xué)研究中也發(fā)現(xiàn)，其含有魚藤酮類、β-谷甾醇、葫蘆巴堿、豆甾醇、萜類等活性成分[16]，與喜馬拉雅紫茉莉的化學(xué)成分具有相似性。因此，本試驗除通過可見光譜、紅外光譜等分析手段對藏藥喜馬拉雅紫茉莉進行鑒別與質(zhì)量的初步評價外，還通過紅外特征圖譜實現(xiàn)了喜馬拉雅紫茉莉與紫茉莉的快速鑒別。

1 材料

喜馬拉雅紫茉莉樣品16批（編號：S1～S16），紫茉莉樣品12批（編號：ZML1～ZML 12），均為自采藥材，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王晶娟教授鑒定為紫茉莉科紫茉莉科植物喜馬拉雅紫茉莉Mirabilis himalaica（Edgew.）Heim.和紫茉莉Mirabilis jalapaL.的干燥根。水合氯醛（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；乙醇（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）。

KQ-500DE（數(shù)控超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司，500 W，40 kHz），DZF-6022真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），LEICA DM500正置顯微鏡（德國徠卡儀器有限公司），OLYMPUS cellSens Standard 2.1成像系統(tǒng)，CM-5型分光測色儀（日本柯尼卡美能達(dá)公司），VERTEX 70傅里葉變換紅外光譜儀（德國布魯克公司）。

2 方法

2.1 浸出物含量測定

取不同批次喜馬拉雅紫茉莉各1.0 g（過24目篩），精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，加入40 mL 61%乙醇，稱定重量，于超聲儀超聲提取65 min，放冷后再次稱定重量，用61%乙醇補足失重，精密稱取濾液30 mL置于干燥失重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，按照2020年版《中國藥典》[17]2201項下浸出物測定方法進行后續(xù)操作。

2.2 性狀和顯微鑒別

① 性狀鑒別：對喜馬拉雅紫茉莉及紫茉莉的形狀、表面特征、質(zhì)地、斷面、氣味等方面進行觀察和描述，采用電子數(shù)顯卡尺測量其直徑和厚度。

② 顯微鑒別：取喜馬拉雅紫茉莉及紫茉莉粉末制成水合氯醛臨時裝片，于顯微鏡40倍目鏡下通過顯微成像系統(tǒng)觀察其顯微特征。

2.3 可見光譜法

將不同批次的喜馬拉雅紫茉莉藥材表面的泥沙、灰塵等清理干凈，打粉過24目篩，測試時將粉末放在圓形玻璃測色皿中，使測色皿中平鋪藥材粉末，以粉末充分覆蓋皿底部不透光為宜。為避免誤差，每次測樣時應(yīng)放入重量相近的粉末。將標(biāo)準(zhǔn)白板放入測量儀器中的樣品槽和參比槽進行基線校正，待校正通過后，將樣品放入測色皿中測定，并記錄樣品顏色各項指標(biāo)值（L*、a*、b*值），每個樣品平行測定3次。

2.4 紅外光譜法

取喜馬拉雅紫茉莉和紫茉莉粉末樣品，過65目篩；喜馬拉雅紫茉莉浸出物樣品為浸出物的干燥粉末，不過篩。光譜測量范圍4000～400 cm－1，光譜分辨率4 cm－1，每張光譜累計掃描32次，扣除水蒸氣與CO2的背景干擾。

3 結(jié)果

3.1 性狀和顯微鑒別

根據(jù)“2.2”項下操作方法進行性狀及顯微鑒別，喜馬拉雅紫茉莉的性狀及顯微特征與《部頒標(biāo)準(zhǔn)》[1]項下喜馬拉雅紫茉莉的相關(guān)描述一致。從性狀特征方面來說，兩者在形狀、外觀顏色、斷面顏色、質(zhì)地等方面均有一定的區(qū)別，具體結(jié)果見表1～2。

表1 喜馬拉雅紫茉莉與紫茉莉性狀特征Tab 1 Character characteristics of Mirabilis himalaica and Mirabilis jalapa

表2 喜馬拉雅紫茉莉與紫茉莉顯微特征Tab 2 Microscopic characteristics of Mirabilis himalaica and Mirabilis jalapa

在顯微特征方面，兩者均具有草酸鈣針晶束、網(wǎng)紋導(dǎo)管、薄壁細(xì)胞等特征，區(qū)別不明顯，但與喜馬拉雅紫茉莉相較，紫茉莉中淀粉粒常糊化，且不具有棕色的木栓細(xì)胞，具體結(jié)果見圖1～2。

圖1 喜馬拉雅紫茉莉粉末Fig 1 Powder characteristics of Mirabilis himalaica

圖2 紫茉莉根粉末Fig 2 Powder characteristics of Mirabilis jalapa

3.2 喜馬拉雅紫茉莉粉末色度值研究

在喜馬拉雅紫茉莉表面及斷面顏色觀察結(jié)果的基礎(chǔ)上，對16批樣品粉末進行色度值分析，色度指標(biāo)L*、a*、b*值分別代表粉末顏色的明暗度，紅綠色和黃藍(lán)色，具體結(jié)果見表3。

由表3可知，樣品表面顏色較深（棕褐色）時，粉末色度指標(biāo)b*值較小，斷面顏色偏淺色（類白色）時，粉末色度指標(biāo)L*值較高，粉末色度指標(biāo)a*值較低。色度指標(biāo)L*值的范圍為60.47～78.40，a*值的范圍為2.75～5.03，b*值的范圍為13.60～17.08。主觀描述與色度值測量兩種方法的結(jié)果具有較好一致性。

表3 不同批次喜馬拉雅紫茉莉L＊、a＊、b＊值及表面和斷面顏色(n＝3)Tab 3 L＊，a＊，b＊ value and surface and transect color of different batches of Mirabilis himalaica (n＝3)

3.3 紅外光譜檢測結(jié)果

3.3.1 喜馬拉雅紫茉莉藥材紅外指紋圖譜的建立

取16批喜馬拉雅紫茉莉藥材，按“2.4”項下方法制樣，測定，獲得紅外指紋圖譜，重疊圖譜見圖3。用平均值法獲得16批（S1～16）喜馬拉雅紫茉莉藥材共有模式圖譜作為對照圖譜[18]，見圖3。

圖3 不同批次喜馬拉雅紫茉莉紅外光譜（B）及其紅外平均光譜（A）Fig 3 Infrared spectrum（B）and average infrared spectrum（A）of Mirabilis himalaica of different batches

從圖3可看出，16批喜馬拉雅紫茉莉藥材原始紅外光譜圖其峰形、峰位基本相同，表明主要化學(xué)成分類似。喜馬拉雅紫茉莉不同樣品的紅外光譜相似度在0.975～0.996，表明其一致性好，可以作為指紋圖譜。3487 cm－1、3421 cm－1、3340 cm－1、3063 cm－1、1607 cm－1、1318 cm－1、1007 cm－1、782 cm－1、521 cm－1為喜馬拉雅紫茉莉藥材的主要特征指紋峰。

3.3.2 喜馬拉雅紫茉莉藥材與紫茉莉紅外圖譜比較 采用平均值法獲得12批紫茉莉藥材（ZML 1～ZML12）的共有模式圖譜，對比觀察喜馬拉雅紫茉莉和紫茉莉共有模式圖譜（見圖4）可以發(fā)現(xiàn)，在3670～2160 cm－1內(nèi)喜馬拉雅紫茉莉和紫茉莉的紅外光譜峰形相似，但后者吸收強度較高。在1600～1000 cm－1波長內(nèi)，兩者的峰形和吸收強度均有差異。對照草酸鈣與淀粉圖譜可知，喜馬拉雅紫茉莉和紫茉莉的紅外色譜圖中，草酸鈣和淀粉的信號吸收強度較高，其中紫茉莉的淀粉吸收強度高于喜馬拉雅紫茉莉，而草酸鈣信號強度基本一致。

圖4 喜馬拉雅紫茉莉及紫茉莉的平均紅外光譜及淀粉、草酸鈣的紅外光譜Fig 4 Average infrared spectra of Mirabilis himalaica and Mirabilis jalapa，infrared spectrum of starch and calcium oxalate

3.3.3 喜馬拉雅紫茉莉藥材與紫茉莉紅外圖譜相似度分析 使用紅外軟件spectrum，以喜馬拉雅紫茉莉1600～1000 cm－1內(nèi)的共有模式圖譜為對照圖譜，對喜馬拉雅紫茉莉和紫茉莉進行相似度計算（見表4及5）。相似度1.0表示兩個光譜之間完全匹配，即兩個光譜的數(shù)據(jù)集相同。零相似度表示兩個光譜完全不相關(guān)。相關(guān)系數(shù)通過以下表達(dá)式計算：相似度＝∑ωiAiBi/[（∑ωiAiBi）1/2×（∑ωiAiBi）1/2]。

表4 喜馬拉雅紫茉莉相似度評價結(jié)果Tab 4 Similarity evaluation of Mirabilis himalaica

其中Ai和Bi表示光譜A和B在頻率i下的吸光度值，ωi表示取決于所選過濾器的加權(quán)。在使用多個過濾器時，總加權(quán)等于各過濾器加權(quán)的乘積。

結(jié)果顯示，不同批次喜馬拉雅紫茉莉相似度均在0.990以上，平均值為0.997；紫茉莉相似度均不高于0.982，平均值為0.959。此結(jié)果說明了喜馬拉雅紫茉莉不同批次間的一致性比較好，且與紫茉莉有一定的差異。

3.3.4 喜馬拉雅紫茉莉與紫茉莉紅外光譜數(shù)據(jù)的聚類分析 利用統(tǒng)計軟件SAS對喜馬拉雅紫茉莉和紫茉莉共28批藥材的相似度大小進行R聚類分析（見圖5）。結(jié)果顯示S1～S16被聚為一類，ZML1～ZML12（圖中顯示為Z1～Z12）為另一類，表明喜馬拉雅紫茉莉與紫茉莉的紅外光譜之間存在較明顯差異。

表5 紫茉莉相似度評價結(jié)果Tab 5 Similarity evaluation of Mirabilis jalapa

圖5 喜馬拉雅紫茉莉與紫茉莉紅外圖譜聚類分析Fig 5 Clustering analysis of the infrared spectrum of Mirabilis himalaica and Mirabilis jalapa

3.4 喜馬拉雅紫茉莉浸出物含量測定及紅外檢測結(jié)果

3.4.1 浸出物含量測定結(jié)果 對不同批次喜馬拉雅紫茉莉的浸出物含量進行測定，具體結(jié)果見表6。由表6可知，喜馬拉雅紫茉莉的浸出物含量分布在15.44%～26.47%，以最低含量下調(diào)30%[19]來計算，可將浸出物含量不低于10.81%作為喜馬拉雅紫茉莉浸出物含量指標(biāo)。

表6 不同批次喜馬拉雅紫茉莉浸出物含量Tab 6 Content of extracts from different batches of Mirabilis himalaica

3.4.2 浸出物含量與色度指標(biāo)（L*、a*）相關(guān)性分析 將喜馬拉雅紫茉莉浸出物含量與L*值、a*值進行相關(guān)性分析（見圖6），發(fā)現(xiàn)浸出物含量隨色度指標(biāo)L*值的增大而增加，成正相關(guān)；隨a*值的增加而降低，成負(fù)相關(guān)。說明色度指標(biāo)不僅可以用于藥材鑒別，還有可能作為其浸出物含量高低的初步評價指標(biāo)。

圖6 喜馬拉雅紫茉莉浸出物含量與色度指標(biāo)（L*、a*）關(guān)聯(lián)性分析Fig 6 Correlation between the content of extracts and color index（L*，a*）of Mirabilis himalaica

3.4.3 浸出物紅外指紋圖譜的建立 取16批喜馬拉雅紫茉莉浸出物粉末，按“2.1”項下方法制樣，測定，獲得紅外指紋圖譜，用平均值法獲得16批喜馬拉雅紫茉莉浸出物共有模式圖譜[18]，見圖7。由圖7可知，波長3284 cm－1、2927 cm－1、2855 cm－1、1728 cm－1、1600 cm－1、1390 cm－1、1323 cm－1、1280 cm－1、1202 cm－1、1102 cm－1、1045 cm－1、990 cm－1、924 cm－1、854 cm－1、667 cm－1為喜馬拉雅紫茉莉紫茉莉浸出物的主要特征指紋峰。

圖7 喜馬拉雅紫茉莉紫茉莉浸出物紅外圖譜Fig 7 Infrared spectrum of extracts Mirabilis himalaica

將不同批次喜馬拉雅紫茉莉紫茉莉浸出物的主要特征峰的吸光度值（X）分別與浸出物含量（Y）進行線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)1600 cm－1、1390 cm－1、1323 cm－1、1280 cm－1、924 cm－1波長處R2均在0.700以上，在1323 cm－1波長處Y＝－65.705X＋55.969（R2＝0.8159）。因此，可在紅外吸光度值分析基礎(chǔ)上，結(jié)合“2.1”項下浸出物含量指標(biāo)進行喜馬拉雅紫茉莉初步質(zhì)量評價。

淀粉在波長1152 cm－1處有紅外吸收，草酸鈣在1318 cm－1和782 cm－1波長處有明顯吸收（見圖4），而喜馬拉雅紫茉莉浸出物紅外光譜在相應(yīng)波長處則無明顯吸收峰（見圖7），因此喜馬拉雅紫茉莉浸出物紅外圖譜可更好地作為包含潛在藥效物質(zhì)信息的指紋圖譜。

4 討論

指紋圖譜是以系統(tǒng)的化學(xué)成分研究為依托，以較強的系統(tǒng)性和選擇性來特征性地區(qū)分中藥的真?zhèn)?、?yōu)劣，將待測樣品指紋圖譜與已建立的對照圖譜進行相似性比較，從而對藥品質(zhì)量進行控制和評價[11，20-21]。紅外光譜作為中藥鑒別的輔助手段，近年來發(fā)展較快，有成本低、操作便捷等特點，已成為鑒定和分析不同產(chǎn)地藥材及內(nèi)在質(zhì)量的重要手段[13，22]。

紅外光譜具有不破壞試樣、試樣用量少、操作簡便、測定快速和多組分同時測定等優(yōu)點，可綜合反映藥材所含的整體化學(xué)成分，在一定程度上可整體反映藥材內(nèi)在質(zhì)量的均一性。本研究采用紅外光譜技術(shù)建立了喜馬拉雅紫茉莉藥材紅外光譜指紋圖譜，由于喜馬拉雅紫茉莉藥材粉末的紅外光譜中淀粉和草酸鈣信號占主導(dǎo)，因此本研究增加了浸出物紅外光譜作為喜馬拉雅紫茉莉質(zhì)量評價指標(biāo)，相較于藥材的紅外光譜，浸出物紅外光譜中可除去淀粉與草酸鈣的紅外吸收，因此可更好地反映喜馬拉雅紫茉莉的藥效成分的信號吸收，且浸出物紅外光譜整體有更強的吸收強度，檢測更加靈敏。

喜馬拉雅紫茉莉外觀及斷面顏色與可見光譜色度指標(biāo)值具有相關(guān)性，浸出物含量與色度指標(biāo)也具有較好一致性，表明可見光譜客觀量化值可以作為質(zhì)量評價的參考指標(biāo)反映喜馬拉雅紫茉莉的內(nèi)在質(zhì)量。可見光譜法可以客觀量化描述顏色特征，減少不同研究者對藥材顏色判斷的主觀性誤差。本研究選擇可見光譜、紅外光譜對喜馬拉雅紫茉莉進行鑒別與質(zhì)量的初步評價，并建立了喜馬拉雅紫茉莉與紫茉莉的快速評價方法，以期為喜馬拉雅紫茉莉的質(zhì)量評價提供量化指標(biāo)和參考依據(jù)。