ADRB2和NEDD4L基因多態(tài)性與高血壓晝夜節(jié)律的相關(guān)性研究

王利，張許，莊勤武，王增君，劉衛(wèi)*（.聯(lián)勤保障部隊第九六〇醫(yī)院泰安醫(yī)療區(qū)，山東 泰安 27000；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床藥學(xué)科，山東 濟(jì)寧 272000；.山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床藥學(xué)科，山東 泰安 27000）

原發(fā)性高血壓是多基因相關(guān)疾病，不僅疾病本身有遺傳傾向，血壓晝夜節(jié)律也與遺傳有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)夜間收縮壓和夜間舒張壓異常的遺傳率分別達(dá)到56%和33%[1]。自主神經(jīng)功能紊亂是導(dǎo)致血壓晝夜節(jié)律異常的主要原因[2]。腎上腺素能β1和β2受體對自主神經(jīng)功能有重要影響，一項包含492例樣本的隊列研究表明，血壓晝夜節(jié)律的改變與β2受體（ADRB2）的A/A基因型相關(guān)，但與β1受體（ADRB1）基因多態(tài)性不相關(guān)[3]。同時，體液因素在血壓晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)中的作用也很重要，例如限制鈉攝入可使血壓節(jié)律由非杓型轉(zhuǎn)為杓型[4]。已知腎素血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）[5]和結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶（eNOS）[6]的基因多態(tài)性與血壓晝夜節(jié)律改變有關(guān)，但未見鈉調(diào)節(jié)相關(guān)基因多態(tài)性對高血壓晝夜節(jié)律影響的研究報道。為此，本試驗設(shè)計了病例對照研究，考察分別對ADRB2基因和對腎鈉排泄有顯著作用的NEDD4L基因的最常見的單核苷酸（分別是rs1042713[7-8]和rs4149601[9]）多態(tài)性及其交互作用與原發(fā)性高血壓患者血壓晝夜節(jié)律異常的相關(guān)性，以期為改善血壓晝夜節(jié)律的個體化用藥提供參考。

1 方法

1.1 研究對象

納入正在治療或此前未經(jīng)治療的原發(fā)性高血壓患者，研究經(jīng)解放軍第九六〇醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)[批準(zhǔn)號：（2020）科研倫理審第（48）號]，試驗對象簽署知情同意后參與研究。入院前非同日3次測量收縮壓（SBP）≥140 mmHg和/或舒張壓（DBP）≥90 mmHg。如有院外用藥，正在使用的藥物中須不包括β受體阻滯劑或利尿劑。排除標(biāo)準(zhǔn)：繼發(fā)性高血壓患者或夜班工作者；腦卒中、有糖尿病并發(fā)癥和肝腎功能不全者；不能耐受佩戴24 h動態(tài)血壓監(jiān)測儀或24 h有效血壓記錄低于70%者。最終納入患者217例，年齡39～69歲，皆為漢族。

1.2 基本資料

記錄患者的年齡、性別、籍貫、高血壓家族史、用藥史、既往病史、高鹽高脂飲食狀況，入院前每日吸煙的為吸煙者，每周飲酒4次以上為酗酒者。

1.3 血壓晝夜節(jié)律和試驗分組

用袖帶式動態(tài)血壓監(jiān)測儀（CB-1304-C型，無錫中健科儀有限公司）測量試驗對象24 h血壓，日間（6：00～22：00）測量間隔30 min，夜間（22：00～次日6：00）測量間隔60 min。夜間血壓下降率計算公式：（日間平均血壓－夜間平均血壓）/日間平均血壓×100%，以夜間血壓下降率在10%～20%定義為杓型節(jié)律。非連續(xù)日測定2次，2次血壓晝夜節(jié)律類型一致的納入試驗。以杓型節(jié)律為正常節(jié)律對照組，以非杓型或超杓型節(jié)律為異常血壓晝夜節(jié)律試驗組。

1.4 基因多態(tài)性檢測

取2 mL靜脈血，DNA抽提取試劑盒提取DNA，按序列引物序列（見表1）用PCR儀（MJ PTC-100型，美國）擴(kuò)增ADRB2、NEDD4L基因相應(yīng)片段。PCR反應(yīng)總體積60 μL，2×Bench TopTM Tap Master Mix 30 μL，上游引物和下游引物各2.4 μL，模板DNA 3 μL，加滅菌蒸餾水至60 μL。反應(yīng)條件為94℃ 預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物送北京華大基因測序，檢測ADRB2rs1042713和NEDD4Lrs4149601的SNP多態(tài)性。

表1 ADRB2和NEDD4L的引物Tab 1 PCR primer of ADRB2 and NEDD4L gene

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0軟件?；举Y料值采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗確定試驗對象的人群代表性。非條件Logistic 回歸分析確定高血壓患者異常血壓晝夜節(jié)律的獨立危險因素，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本資料對比

納入試驗組138例，對照組79例，兩組患者高血壓家族史、高鹽飲食、吸煙、酗酒等因素差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但年齡、ADRB2rs1042713位點攜帶A等位基因、ADRB2rs1042713和NEDD4Lrs4149601都攜帶A等位基因的Both-A-allele在試驗組的分布高于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者基線資料比較Tab 2 Baseline of dipper and non-dipper hypertensive patients

2.2 ADRB2、NEDD4L基因型

經(jīng)基因測序分析，ADRB2rs1042713和NEDD4Lrs4149601在試驗對象中均存在野生型（G/G型）、雜合型（G/A型）和突變型（A/A型）（見圖1）。

圖1 ADRB2（rs1042713）、NEDD4L（rs4149601）基因測序圖譜Fig 1 DNA sequencing of ADRB2（rs1042713）and NEDD4L（rs4149601）

對各基因型在試驗對象中的分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗（見表3），結(jié)果表明ADRB2、NEDD4L基因多態(tài)性分布符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），說明樣本有群體代表性。

表3 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗Tab 3 Hardy-Weinberg genetic equilibrium test of ADRB2 and NEDD4L

2.3 影響高血壓晝夜節(jié)律的因素

用非條件單因素Logistic回歸分析基因型與血壓晝夜節(jié)律的相關(guān)性（見表4）。結(jié)果表明，ADRB2rs1042713位點攜帶A等位基因、ADRB2rs1042713和NEDD4Lrs4149601都攜帶A等位基因的Both-A-allele可能是異常血壓晝夜節(jié)律的危險因素。排除混雜因素，將篩選出的這些危險因素進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，篩選出異常血壓晝夜節(jié)律的獨立危險因素，結(jié)果見表5。Both-A-allele以及高齡是異常血壓晝夜節(jié)律的獨立危險因素。

表4 影響血壓晝夜節(jié)律單因素Logistic回歸分析Tab 4 Univariate Logistic regression analysis of blood pressure circadian rhythm in hypertensive patients

表5 影響血壓晝夜節(jié)律多因素Logistic 回歸分析Tab 5 Logistic regression analysis of blood pressure circadian rhythm in hypertensive patients

3 討論

目前對血壓晝夜節(jié)律的定義以夜間血壓下降率為標(biāo)準(zhǔn)，夜間血壓下降率在10%～20%為杓型，＜10%為非杓型，＞20%為超杓型[10-11]，其中非杓型和超杓型都屬于異常血壓晝夜節(jié)律。異常血壓晝夜節(jié)律不僅是高血壓的易感因素，也是高血壓導(dǎo)致靶器官損傷的獨立危險因素[12]，夜間血壓下降率每降低5%，心血管死亡風(fēng)險就會降低18%[13]。高齡是異常高血壓晝夜節(jié)律的獨立危險因素（OR＝1.976，95%CI1.368～2.854，P＝0.008），表明高血壓晝夜節(jié)律異常隨著年齡增加逐漸發(fā)生，與文獻(xiàn)報道[14]的結(jié)果一致。

自主神經(jīng)功能異常是血壓晝夜節(jié)律異常的主要原因之一。交感神經(jīng)分別作用于心臟和血管的腎上腺素能β1和β2受體調(diào)節(jié)血壓。ADRB1基因多態(tài)性是β受體阻滯劑作用差異的原因之一[15]，ADRB2基因多態(tài)性的研究則更多地集中于血壓調(diào)節(jié)和對高血壓易感因素的影響[16]，所以本試驗不納入正在使用β受體阻滯劑的高血壓患者。一項隊列研究發(fā)現(xiàn)ADRB2（rs17778257和rs2400707）攜帶A等位基因與夜間血壓杓型節(jié)律改變有關(guān)[3]，但本試驗沒有發(fā)現(xiàn)ADRB2rs1042713基因多態(tài)性（攜帶A等位基因OR＝2.333，95%CI0.879～6.191，P＝0.089）導(dǎo)致的血壓晝夜節(jié)律異常。

血壓晝夜節(jié)律還與體液因素相關(guān)。上皮鈉通道是鈉離子重吸收的限速通道，對血壓調(diào)節(jié)有關(guān)鍵作用。泛素連接酶NEDD4L的WW結(jié)構(gòu)域與上皮鈉通道的β亞基和γ亞基產(chǎn)生泛素化作用，加速腎鈉重吸收而導(dǎo)致血壓升高[17]。NEDD4L基因多態(tài)性是體位性低血壓的易感因素[18]，表明NEDD4L基因變異可致血壓調(diào)節(jié)異常。鈉排泄的特點是白天高夜間低[19]，限鈉不僅可以降低血壓，還可以使血壓晝夜節(jié)律由非杓型轉(zhuǎn)變?yōu)殍夹蚚4]，由此推斷NEDD4L基因多態(tài)性可能與血壓晝夜節(jié)律相關(guān)。本試驗沒有發(fā)現(xiàn)單獨的NEDD4Lrs4149601多態(tài)性對高血壓晝夜節(jié)律有顯著影響，但與ADRB2rs1042713多態(tài)性交互作用后，在兩個基因都攜帶A等位基因的情況下，高血壓患者的異常血壓晝夜節(jié)律比例顯著增加（OR＝12.293，95%CI2.712～55.710，P＝0.001），說明在神經(jīng)因素和體液因素的共同作用下，異常高血壓晝夜節(jié)律更加顯著。