基于正交試驗(yàn)和主成分分析法考察壁虎的最佳烘制工藝

宋肖樺，張荳，胡慧華（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488）

壁虎為壁虎科動物無蹼壁虎（Gekkos swinhonisGuenther）、多疣壁虎（G.japonicusDumerilet Biron）或蹼趾壁虎（G.subpalmatusGuenther）的干燥全體，性寒，味咸，有小毒[1]，主治中風(fēng)癱瘓、手足不舉、歷節(jié)風(fēng)痛、風(fēng)痙驚癇、小兒疳痢、疬風(fēng)瘰疬、血積成痞、療蝎螯等[2]?，F(xiàn)代臨床研究發(fā)現(xiàn)，壁虎具有祛風(fēng)定驚、散結(jié)解毒、止咳平喘的作用[3]。藥理研究發(fā)現(xiàn)，壁虎治療惡性腫瘤、骨髓炎等疾病作用顯著，引起了醫(yī)藥界的關(guān)注[4]。中藥壁虎未載入2020年版《中國藥典》，也沒有統(tǒng)一規(guī)范壁虎的炮制工藝。為保證臨床用藥的準(zhǔn)確性，本文通過正交試驗(yàn)法對壁虎的烘制溫度、鋪藥厚度、烘制時間進(jìn)行考察，并且采用主成分分析法對壁虎的外觀性狀（硬度、黏附性、咀嚼性、顏色）、常規(guī)檢查項(xiàng)目（水分、水溶性浸出物）和物質(zhì)基礎(chǔ)（蛋白質(zhì)、多糖、粗脂）數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到壁虎烘制的最優(yōu)工藝，以期為壁虎的炮制研究提供可靠的理論參考和數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-P7型紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；FA1104B型電子分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；SB25-12DTD型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；HC-300T型固體粉碎機(jī)（永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司）；CM-5型分光測色儀（日本柯尼卡美能達(dá)公司）；TMS-Pro型質(zhì)構(gòu)儀（美國FTC公司）。

1.2 試藥

石油醚（批號：20190819，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。壁虎生品產(chǎn)自安徽，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)胡慧華副教授鑒定為壁虎科動物無蹼壁虎（Gekkos swinhonisGuenther）的干燥全體。

2 方法

2.1 壁虎烘制工藝的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

壁虎的具體炮制參數(shù)，如烘制溫度、鋪藥厚度、烘制時間等，藥典中并未作規(guī)定，現(xiàn)行的各省市中藥飲片炮制規(guī)范對壁虎的規(guī)定亦不統(tǒng)一。本課題組前期就壁虎的具體炮制工藝參數(shù)進(jìn)行了單因素考察，最終選擇烘制溫度、鋪藥厚度、烘制時間這三個因素來考察壁虎的烘制工藝。采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，各因素水平見表1，試驗(yàn)條件見表2。

表1 壁虎烘制工藝因素水平Tab 1 Factor and level of gecko baking process

表2 壁虎烘制工藝試驗(yàn)條件Tab 2 Test conditions of gecko baking process

2.2 壁虎不同烘制品的制備

取大小均勻的生壁虎適量，置白色搪瓷盤（30 cm×20 cm）內(nèi)，按照正交試驗(yàn)條件烘箱烘制一定時間，取出，放涼備用。

2.3 水分測定

按照2020年版《中國藥典》第四部通則0831干燥失重測定法測定水分[5]。精密量取供試品粉末2.5 g，平鋪于干燥至恒重的扁型稱量瓶中，厚度不超過5 mm，精密稱定，在105℃干燥5 h，移置干燥器中，放冷，精密稱定，于105℃干燥1 h，放冷，稱重，至連續(xù)兩次稱重的差異不超過5 mg為止。根據(jù)失重計(jì)算供試品中含水量（%），平行測定3次。

2.4 水溶性浸出物

按照2020年版《中國藥典》第四部通則2201浸出物測定法進(jìn)行浸出物測定[5]。精密稱定供試品4 g，置錐形瓶中，精密加水100 mL，稱重，靜置1 h，加熱回流至沸騰，保持微沸1 h，放冷，稱重，用水補(bǔ)足失重，過濾，精密移取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中蒸干，于105℃干燥3 h，放冷，迅速精密稱重，以干燥品計(jì)算供試品中水溶性浸出物的含量（%），平行測定3次。

2.5 色度測定

測定條件：D65光源，10度視角，8 mm測定口徑，SpectraMagicNx軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，獲得L*值、a*值及b*值（L*代表亮度，值越大，亮度越大；a*代表紅綠相，正值表示紅色，負(fù)值表示綠色；b*代表黃藍(lán)相，正值表示黃色，負(fù)值表示藍(lán)色）[6]。取供試品，粉碎過四號篩，混勻，裝入測色皿中適量，平行測定3次。

2.6 粗脂測定

取供試品，粉碎過四號篩，混勻，精密稱定，干燥12 h，索氏提取10 h。待藥渣揮干后精密稱定，根據(jù)減重計(jì)算供試品中的粗脂含量（%），平行測定3次。

2.7 質(zhì)地測定

質(zhì)構(gòu)儀測定最大測量量程：1000 N，形變量：50%，測試速度：60 mm·min－1，最小感應(yīng)力：15 N，間隔：2 s。測定壁虎樣品的硬度（N）、黏附性（N.sec）和咀嚼性（N），平行測定3次。

2.8 蛋白質(zhì)測定

取供試品，粉碎過四號篩，干燥12 h，索氏提取10 h?；厥账幵Q取適量干燥粉末，按照課題組前期篩選得到的水溶性蛋白最佳提取工藝[7]，以去離子水（pH為6.8）為提取溶劑，料液比為1∶70，提取時間為84 min，pH為14，采用超聲提取法測定生壁虎中蛋白質(zhì)的含量，平行測定3次。

2.9 多糖測定

取供試品，粉碎過四號篩，干燥12 h，索氏提取10 h?；厥账幵Q取適量干燥粉末，按照課題組前期篩選得到的多糖最佳提取工藝[8]，以去離子水為提取溶劑，超聲提取時間為80 min，料液比為1∶60，80%乙醇沉淀，采用水提醇沉法測定生壁虎中多糖的含量，平行測定3次。

3 結(jié)果

3.1 壁虎烘制樣品的含量測定

生品和不同烘制條件下所得壁虎樣品指標(biāo)成分的含量見表3。

表3 不同烘制條件下壁虎指標(biāo)性成分含量結(jié)果(±s，n＝3)Tab 3 Content of index components in gecko under different baking conditions (±s，n＝3)

表3 不同烘制條件下壁虎指標(biāo)性成分含量結(jié)果(±s，n＝3)Tab 3 Content of index components in gecko under different baking conditions (±s，n＝3)

物/%L*a*b*粗脂/%硬度/N黏附性/組別水分/%水溶性浸出（N.sec）咀嚼性/N蛋白質(zhì)含量/（mg·g－1）多糖含量/（mg·g－1）16.88±0.059.45±0.0354.21±0.264.22±0.0219.88±1.0814.24±0.5180.39±2.740.14±0.091.57±0.07131.61±0.880.73±0.01 26.54±0.025.72±0.0157.45±0.523.72±0.0120.00±0.4015.67±0.1225.25±4.230.09±0.000.03±0.04130.63±0.370.60±0.01 36.68±0.027.04±0.0255.48±1.544.23±0.0620.33±0.2513.38±0.3775.46±3.590.04±0.001.63±0.00135.14±0.051.30±0.02 46.21±0.016.32±0.0755.59±0.803.85±0.0520.24±0.8912.80±0.3155.14±1.360.01±0.001.47±0.01131.93±0.050.86±0.01 55.62±0.026.03±0.0456.04±0.433.41±0.0720.29±0.3113.80±0.6834.52±3.890.13±0.020.10±0.23130.29±0.140.91±0.03 65.97±0.066.11±0.0255.92±1.404.51±0.1621.93±1.5816.32±0.1558.88±0.540.20±0.010.55±0.12131.34±0.121.06±0.01 75.12±0.076.33±0.0453.03±2.705.30±0.0921.50±1.3314.29±0.3323.16±1.210.17±0.04－0.07±0.00132.94±0.941.02±0.04 85.44±0.067.15±0.0253.20±0.984.19±0.0520.13±0.7916.34±0.7420.32±1.210.39±0.040.21±0.00131.46±0.161.07±0.03 94.70±0.049.10±0.0452.24±0.895.35±0.2421.20±1.5514.66±0.2912.70±0.630.08±0.060.37±0.00133.41±0.331.02±0.04生品7.14±0.056.29±0.0457.50±1.034.03±0.1921.01±1.0812.76±0.5588.76±1.220.05±0.010.16±0.09132.51±0.750.77±0.01

3.2 壁虎烘制工藝優(yōu)選的主成分分析

本試驗(yàn)測定了與壁虎烘制有關(guān)的11個理化指標(biāo)，不同烘制條件之間各指標(biāo)值具有不同程度的差異。由于不同指標(biāo)具有不同程度的量綱及數(shù)量級，并且存在正負(fù)相關(guān)性，為了消除對結(jié)果的影響，在數(shù)據(jù)分析前要先對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行極差標(biāo)準(zhǔn)化處理[9]。標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)通過SPSS 25進(jìn)行主成分分析得到碎石圖、相關(guān)性矩陣表和方差貢獻(xiàn)分析表分別如圖1、表4和表5所示。由表4可知，相關(guān)性矩陣中大部分?jǐn)?shù)據(jù)大于0.3，說明數(shù)據(jù)具有相關(guān)性。

表4 壁虎各理化指標(biāo)相關(guān)性矩陣表Tab 4 Correlation matrix of physical and chemical index for gecko

圖1 壁虎烘制工藝優(yōu)選的主成分分析碎石圖Fig 1 Scree plot of principal component analysis of gecko baking process

表5 壁虎烘制方差分析貢獻(xiàn)表Tab 5 Variance contribution of gecko baking

由圖1可知，前4個主成分特征值均大于1，且從第5個主成分開始，特征值變化趨勢逐漸平緩，因前4個主成分已經(jīng)包含了11個指標(biāo)的主要信息，可以用前4個主成分來評價壁虎的烘制工藝[10]。

由表5可知，前4個主成分的特征值分別為4.204、2.498、1.723、1.198，方差貢獻(xiàn)率分別為38.219、22.707、15.668、10.887，表明前4個主成分分別可以反映壁虎樣本38.219%、22.707%、15.668%、10.887%的信息量，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到87.481%，根據(jù)主成分理論分析，若前n個主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到85%，則這n個主成分即可反映足夠信息的原則[11]，因此可采用前4個主成分代替11個指標(biāo)來評價壁虎的烘制工藝，這4個主分量基本保留了原有變量的全部信息，結(jié)果與圖1相同。

由表6可以看出第一主成分以色澤紅綠參數(shù)a*（0.893）的影響為主，水分（0.869）和黃藍(lán)參數(shù)b*（0.778）的影響為輔；第二主成分以蛋白質(zhì)（0.940）的影響為主，水溶性浸出物（0.790）和多糖（0.726）的影響為輔；第三主成分以脆度（0.843）的影響為主，以咀嚼性（0.629）的影響為輔；第四主成分以粗脂（0.853）影響為主，以黏附性（0.526）的影響為輔。通過各成分的貢獻(xiàn)率可知，在烘制過程中，壁虎的色澤、水溶性蛋白質(zhì)、粗脂和質(zhì)地這4個指標(biāo)變化較顯著。

表6 壁虎烘制成分矩陣表Tab 6 Composition matrix for gecko baking

以特征向量為主成分的矩陣數(shù)據(jù)除以SQR主成分的特征值，可得到4個主成分表達(dá)式的系數(shù)。具體計(jì)算方法以第一主成分表達(dá)式為例，將表6中第一主成分的數(shù)據(jù)輸入SPSS 25的數(shù)據(jù)編輯窗口（X1），點(diǎn)擊“轉(zhuǎn)換 → 計(jì)算變量”，在對話框中輸入表達(dá)式“A1＝X1/SQR（4.204）”，即可得到特征向量，即第一主成分表達(dá)式的系數(shù)A1。其余3個主成分系數(shù)的計(jì)算方法與第一主成分系數(shù)的計(jì)算方法相同，結(jié)果見表7。將得到的特征向量與標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)相乘，即可得到主成分表達(dá)式[12]。

表7 壁虎烘制特征向量表Tab 7 Feature vector for gecko baking

F1（第1主成分）＝0.2278Z－多糖＋（－0.0005Z）－蛋白質(zhì)＋0.4238Z－水分＋0.0536Z－水溶性浸出物＋（－0.3887Z）－L*＋0.4355Z－a*＋0.3794Z－b*＋0.2502Z－脆度＋（－0.2980Z）－黏附性＋0.2999Z－咀嚼性＋0.1985Z－粗脂

F2（第2主成分）、F3（第3主成分）、F4（第4主成分）的計(jì)算如F1所示。

根據(jù)計(jì)算公式F＝0.3822F1＋0.2271F2＋0.1567F3＋0.1089F4，可得出壁虎烘制品的主成分得分[13]，即不同烘制條件下多個指標(biāo)的綜合得分，并進(jìn)行排序，結(jié)果見表8。根據(jù)綜合得分的排序，可以看到不同條件下壁虎烘制品的品質(zhì)差異，第9組的綜合得分值最高，即A3B3C2，此條件的工藝參數(shù)為烘箱溫度100℃，鋪藥厚度3 cm，烘制時間70 min。

表8 主成分得分表Tab 8 Principal component score

3.3 正交試驗(yàn)方差分析

以得到的主成分綜合得分為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表9及表10。

表9 壁虎烘制正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 9 Orthogonal test of gecko baking

表10 壁虎烘制正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab 10 Variance of orthogonal test of gecko baking

通過表10方差分析結(jié)果可知，3個因素對壁虎烘制品的影響主次順序?yàn)楹嬷茰囟龋ˋ）＞烘制時間（C）＞鋪藥厚度（B），烘制溫度對壁虎烘制工藝有顯著影響。根據(jù)表9正交試驗(yàn)，以及主成分綜合得分越高越好的原則，對烘制溫度進(jìn)行分析，確定烘制溫度的最佳水平為A3，鋪藥厚度和烘制時間對主成分綜合得分的影響較小，綜合各因素選擇B3、C2，因此最優(yōu)水平組合為A3B3C2，分析結(jié)果與表8主成分分析結(jié)果相同。即最終確定的最佳烘制工藝為：取凈壁虎，置于30 cm×20 cm的白色搪瓷盤內(nèi)，鋪藥厚度為3 cm，設(shè)定烘箱溫度為100℃，烘制70 min，取出，晾涼，即得。

3.4 工藝驗(yàn)證

按照上述所得的壁虎烘制最優(yōu)工藝平行制備3份壁虎烘制品，測定指標(biāo)性成分含量，按照“3.2”項(xiàng)下方法計(jì)算11種指標(biāo)的主成分綜合得分，結(jié)果見表11，計(jì)算得3份樣品的主成分綜合得分平均值為0.6139，RSD值為1.7%。說明該烘制工藝結(jié)果穩(wěn)定，可以用于壁虎的烘制。

表11 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab 11 Verification test

4 討論與分析

現(xiàn)代常用烘焙法對壁虎生品進(jìn)行炮制，可以矯臭去腥，減弱壁虎生品明顯的腥臭味，并利用烘制后產(chǎn)生的焦香氣，提高口服用藥的適口性。本課題組前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用鍋來焙制壁虎時，溫度很難控制，且焙制過程中，常會溢出油脂，造成壁虎成分的損失，同時還會產(chǎn)生大量濃煙。近年來有研究發(fā)現(xiàn)[14]，壁虎烘干未焙制品比焙制品抑制腫瘤的效果更好。因此本文采用烘法炮制壁虎生品。

有研究發(fā)現(xiàn)，動物類藥材烘制溫度過高會使蛋白質(zhì)變性失活[15]，而動物類藥材中含有的蛋白質(zhì)和多肽是動物藥的有效成分[16]，因此本試驗(yàn)選取的最高烘制溫度為100℃。

采用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行壁虎的物性特性檢測[17]，可以得到硬度、脆度、內(nèi)聚力、黏附性和咀嚼性5組數(shù)據(jù)，但因?yàn)榕R床使用的壁虎多為研磨吞服，故只選用硬度、黏附性、咀嚼性3個指標(biāo)進(jìn)行壁虎的物性特性檢測。

主成分分析法多用于多樣本多指標(biāo)的樣本分析[18]。本文采用主成分分析法對壁虎的外觀性狀與內(nèi)在指標(biāo)進(jìn)行了分析[19]，通過提取11個指標(biāo)性成分的主成分因子，計(jì)算特征向量，得到主成分表達(dá)式，再通過累計(jì)貢獻(xiàn)率原則，選擇前4個主成分因子代替原有的11個主成分因子，建立壁虎烘制品的質(zhì)量評價方法，通過主成分綜合得分對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行排序，進(jìn)而得到壁虎烘制的最佳工藝。

由于動物藥成分復(fù)雜，選擇單一成分作為壁虎烘制的優(yōu)化指標(biāo)，無法全面評價藥物的內(nèi)在品質(zhì)[20-21]。因此，本文選擇了物質(zhì)基礎(chǔ)（蛋白質(zhì)、多糖、粗脂）、外觀性狀（硬度、黏附性、咀嚼性、顏色）和常規(guī)檢查項(xiàng)目（水分、水溶性浸出物）等指標(biāo)來評價壁虎的烘制工藝，進(jìn)而得出壁虎烘制的較優(yōu)工藝。