基于響應(yīng)面法的五行香草方揮發(fā)油提取工藝研究和體外抑菌作用評(píng)價(jià)

閆紅敏，于蘭蘭*，郭子燕（.河南省直第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州 450000；.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，鄭州 450000）

五行香草方是本院中醫(yī)專家在《備急千金要方》中避溫病方“粉身散”的基礎(chǔ)上以加減，經(jīng)大量臨床實(shí)例總結(jié)出的治療腳氣病的外用方，取得了較好的療效，該方由川芎、藁本、白芷、防風(fēng)、細(xì)辛組成，可作用于足底特殊穴位，對(duì)腳氣、腳臭、骨刺等有顯著的治療作用[1]。該方的有效成分多為揮發(fā)性成分，揮發(fā)油又是中藥“辛”味的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，也是該類中藥發(fā)揮治療作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一，即中藥“辛”味與揮發(fā)油、表證和炎癥關(guān)系密切[2-3]，且揮發(fā)油分子量小、脂溶性較強(qiáng)，容易穿過(guò)體內(nèi)生物膜，生物利用度高，能快速吸收起效[4]。在前期的臨床觀察中，將中藥粉通過(guò)一定的工藝制成中藥鞋墊使用，制作工藝復(fù)雜、重復(fù)利用率低，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)優(yōu)選工藝提取五行香草方中的揮發(fā)油，并通過(guò)體外抑菌實(shí)驗(yàn)觀察其抑菌效果，為進(jìn)一步改進(jìn)工藝、優(yōu)化劑型提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

揮發(fā)油提取器（北京新科實(shí)驗(yàn)室玻璃儀器有限公司），2015年版《中國(guó)藥典》藥典篩（浙江上虞市道墟五四儀器廠），DT-400電子天平（北京醫(yī)用激光儀器廠常熟分廠），F(xiàn)W-600高速萬(wàn)能粉碎機(jī)、MH3000電子調(diào)溫電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 試藥

白芷（批號(hào)：B712191-01）、川芎（批號(hào)：B810103-01）、防風(fēng)（批號(hào)B710304-01）（河北楚風(fēng)中藥飲片有限公司），細(xì)辛（批號(hào)：170701，湖北聚瑞中藥飲片有限公司），藁本（批號(hào)：1707005，江西樟樹(shù)天齊堂中藥飲片有限公司），經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院陳天朝主任藥師鑒定，符合《中國(guó)藥典》各品種項(xiàng)下規(guī)定。細(xì)菌培養(yǎng)基血瓊脂平板（批號(hào)：20191010B）、真菌培養(yǎng)基為沙保羅培養(yǎng)基（批號(hào)：20191007B）（安圖生物科技有限公司）。

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌（批號(hào)：A0291B，廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心）；白假絲酵母菌、紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌均由河南省直第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科臨床分離所得。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法

稱取100 g五行香草方全粉，過(guò)篩，加入適量蒸餾水，置于圓底燒瓶中，常壓加一定量蒸餾水，室溫下浸泡一定時(shí)間，連接揮發(fā)油提取器，提取一定時(shí)間，收集提取物，并加適量石油醚（60～90℃）萃取。精密讀取揮發(fā)油體積，計(jì)算其提取率，提取率（%）＝提取量（mL）/全粉質(zhì)量（g）×100%。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

查閱文獻(xiàn)[5-7]，分別設(shè)置粉末等級(jí)、浸泡時(shí)間（h）、提取時(shí)間（h）、液固比4個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置5個(gè)水平，以揮發(fā)油提取率為指標(biāo)對(duì)影響因素進(jìn)行初步篩選。

2.2.1 粉末等級(jí) 選擇浸泡時(shí)間2 h，提取時(shí)間3 h，液固比12∶1，考察粉末等級(jí)為原飲片、最粗粉（粒徑70～13 μm）、粗粉（粒徑29～9.9 μm）、中粉（粒徑9.9～7.6 μm）、細(xì)粉（粒徑7.6～6.6 μm）時(shí)對(duì)五行香草方揮發(fā)油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1A。

圖1 各因素對(duì)五行香草方揮發(fā)油提取率的影響Fig 1 Effect of various factors on the extraction rate of volatile oil in Wuxing vanilla formulae

當(dāng)粉末等級(jí)由飲片至粗粉時(shí)，揮發(fā)油提取率呈明顯的上升趨勢(shì)；粉末等級(jí)為粗粉時(shí)，揮發(fā)油提取率達(dá)到峰值；當(dāng)粉末由中粉到細(xì)粉時(shí)，五行香草方的揮發(fā)油提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。粉末等級(jí)從粗粉至細(xì)粉時(shí)，五行香草方的揮發(fā)油提取率逐漸減低，這是由于粉末過(guò)細(xì)，置于圓底燒瓶中沸騰提取揮發(fā)油時(shí)容易糊化，影響揮發(fā)油提取率，故粉末等級(jí)以粗粉為宜。

2.2.2 浸泡時(shí)間 選擇粉末等級(jí)為粗粉，提取時(shí)間為3 h，液固比為12∶1，考察浸泡時(shí)間為0、1、2、3、4 h對(duì)五行香草方揮發(fā)油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1B。隨著浸泡時(shí)間的增加，揮發(fā)油提取率呈明顯的上升趨勢(shì)，至2 h后趨于平衡，3、4 h時(shí)揮發(fā)油提取率無(wú)明顯上升。故浸泡時(shí)間以2 h為宜。

2.2.3 提取時(shí)間 選擇粉末等級(jí)為粗粉，浸泡時(shí)間為2 h，液固比為12∶1，考察提取時(shí)間為1、2、3、4、5 h對(duì)五行香草方揮發(fā)油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1C。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，揮發(fā)油提取率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；當(dāng)提取時(shí)間為3 h時(shí)，揮發(fā)油提取率達(dá)到峰值，延長(zhǎng)時(shí)間提取率無(wú)明顯上升，故提取時(shí)間以3 h為宜。

2.2.4 液固比 選擇粉末等級(jí)為粗粉，浸泡時(shí)間為2 h，提取時(shí)間為3 h，考察液固比為6∶1、9∶1、12∶1、15∶1、18∶1對(duì)五行香草方揮發(fā)油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1D。當(dāng)液固比為6∶1、9∶1時(shí)，該方的揮發(fā)油提取率無(wú)明顯變化；當(dāng)液固比為12∶1時(shí)，揮發(fā)油提取率呈明顯上升趨勢(shì)；當(dāng)液固比為15∶1、18∶1時(shí)，揮發(fā)油提取率呈現(xiàn)略微的下降趨勢(shì)。故選擇液固比12∶1為宜。

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，初步篩選的較優(yōu)的提取條件為粉末等級(jí)為粗粉、浸泡時(shí)間2 h、提取時(shí)間3 h、液固比12∶1。最終選擇浸泡時(shí)間1～3 h，提取時(shí)間3～5 h，液固比為9∶1～15∶1進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，優(yōu)化五行香草方的揮發(fā)油提取工藝。

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化揮發(fā)油提取工藝

選取浸泡時(shí)間（X1）、液固比（X2）、提取時(shí)間（X3）為考察變量，揮發(fā)油提取率（Y）為響應(yīng)值，采用Box-Behnken design（BBD）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案[8]，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)17組實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。因素與水平表見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素與水平表Tab 1 Factor and level

表2 Box-Behnken響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 2 Design and results of Box-Behnken response surface method

應(yīng)用Design Expert軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到Y(jié)對(duì)X1、X2、X3之間的二次多項(xiàng)回歸方程為Y＝1.44＋0.11X1＋0.045X2＋0.041X3－0.0025X1X2＋0.025X1X3－0.018X2X3－0.076X12－0.054X22－0.091X32；剔除不顯著項(xiàng)后Y＝1.44＋0.11X1＋0.045X2＋0.041X3＋0.025X1X3－0.018X2X3－0.076X12－0.054X22－0.091X32。由方程可知，各因素對(duì)方中揮發(fā)油提取率的影響大小排序?yàn)閄1＞X2＞X3，即浸泡時(shí)間＞液固比＞提取時(shí)間。對(duì)上述回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3可以看出該模型P＝0.0007＜0.001，說(shuō)明該響應(yīng)面回歸方程模型顯著；且模型失擬項(xiàng)P＝0.0704＞0.05不顯著，說(shuō)明方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合較好。模型中X1、X2、X3、X12、X22、X33項(xiàng)具有顯著性，表明各個(gè)自變量與因變量間的線性關(guān)系較為明顯，對(duì)各因素繪制曲面圖和等高線圖，更能直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響以及最優(yōu)條件下各因素的取值結(jié)果，詳見(jiàn)圖2。

圖2 各因素對(duì)五行香草方揮發(fā)油提取率的曲面圖和等高線圖Fig 2 Surface plot and contour map of various factors to extraction rate of volatile oil in Wuxing vanilla formulae

表3 Box-Behnken響應(yīng)面法方差分析Tab 3 Variance analysis of Box-Behnken response surface method

根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，采用Design Expert軟件擬合可得最優(yōu)工藝條件為浸泡時(shí)間2.39 h，液固比14.36∶1，提取時(shí)間4.30 h，在此條件下得到的揮發(fā)油得率為1.50%。

為驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，平行精密稱定五行香草方3份，每份100 g，對(duì)模型優(yōu)化的工藝進(jìn)行驗(yàn)證?？紤]到實(shí)驗(yàn)的可操作性與便捷性，選擇工藝參數(shù)浸泡時(shí)間為2.5 h、液固比14∶1、提取時(shí)間4 h對(duì)3批樣品進(jìn)行提取工藝驗(yàn)證，計(jì)算揮發(fā)油提取率，求其平均值為1.51%（RSD＝0.77%，n＝3），與理論預(yù)測(cè)值基本吻合。

2.4 五行香草方揮發(fā)油抗菌活性測(cè)定

2.4.1 揮發(fā)油的提取 按“2.3”項(xiàng)下優(yōu)化方法提取白芷、川芎、防風(fēng)、細(xì)辛、藁本及五行香草方中的揮發(fā)油。

2.4.2 抑菌片的制備 取無(wú)菌干燥、直徑為6 mm的濾紙片，每片滴加揮發(fā)油30 μL浸潤(rùn)，然后將濾紙片平放于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，置于室溫下干燥后備用；另取同樣無(wú)菌干燥、直徑為6 mm的濾紙片，每片滴加滅菌水30 μL，干燥后作為對(duì)照無(wú)菌片；在無(wú)菌條件下，用接種環(huán)分別挑取一環(huán)金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌、紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌接入研缽中，以少量生理鹽水進(jìn)行研磨，直至均勻，即得供試菌懸液[9]。

2.4.3 抗菌活性的測(cè)定 采用濾紙片法測(cè)定揮發(fā)油的抑菌圈[10]。精密吸取各供試菌懸液100 μL分別涂布于相應(yīng)的培養(yǎng)基平板上；在無(wú)菌操作下，每種揮發(fā)油均取3片抑菌片和1片對(duì)照無(wú)菌片貼放在相應(yīng)菌液的固體培養(yǎng)基平板上并將對(duì)照無(wú)菌片置于平板中心。實(shí)驗(yàn)菌群為金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌時(shí)，在37℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h；實(shí)驗(yàn)菌為紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌時(shí)，在26℃恒溫條件下培養(yǎng)7 d，重復(fù)3 次，觀察結(jié)果，并計(jì)算出抑菌環(huán)的平均直徑，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同揮發(fā)油抑菌實(shí)驗(yàn)(±s，n＝3)Tab 4 Antibacterial test of different volatile oils (±s，n＝3)

表4 不同揮發(fā)油抑菌實(shí)驗(yàn)(±s，n＝3)Tab 4 Antibacterial test of different volatile oils (±s，n＝3)

注（Note）：對(duì)照無(wú)菌片無(wú)抑菌作用（The control sterile tablets had no antibacterial effect）。

供試液抑菌環(huán)直徑/mm金黃色葡萄球菌白假絲酵母菌紅色毛癬菌石膏樣小孢子菌細(xì)辛揮發(fā)油11.2±0.268.9±0.3312.7±0.1210.1±0.09白芷揮發(fā)油6.3±0.167.1±0.437.3±0.086.6±0.26防風(fēng)揮發(fā)油8.5±0.367.3±0.148.9±0.099.3±0.22川芎揮發(fā)油6.2±0.146.3±0.146.2±0.056.5±0.37藁本揮發(fā)油6.8±0.098.0±0.346.8±0.227.2±0.14五行香草方揮發(fā)油10.9±0.089.1±0.1813.5±0.2912.7±0.24

結(jié)果表明，五行香草方中各飲片提取的揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌、紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌均有抑制作用，抑菌效果為金黃色葡萄球菌：細(xì)辛＞五行香草方＞防風(fēng)＞藁本＞白芷＞川芎；白假絲酵母菌：五行香草方＞細(xì)辛＞藁本＞防風(fēng)＞白芷＞川芎；紅色毛癬菌：五行香草方＞細(xì)辛＞防風(fēng)＞白芷＞藁本＞川芎；石膏樣小孢子菌：五行香草方＞細(xì)辛＞防風(fēng)＞藁本＞白芷＞川芎。

3 討論

中藥揮發(fā)油是從芳香中藥中提取出來(lái)的一類化學(xué)成分復(fù)雜、藥理活性廣泛的油狀液體[11]，本實(shí)驗(yàn)中提取的中藥復(fù)方揮發(fā)油的抑菌強(qiáng)度強(qiáng)于單味中藥飲片，表明復(fù)方配伍對(duì)抑菌效果有一定的增效作用。且前期研究表明，方中諸藥均有不同程度的抑菌抗菌作用[12-20]，復(fù)方抑菌作用強(qiáng)于單味中藥，說(shuō)明方中各藥味間存在明顯的協(xié)同作用，中藥復(fù)方配伍對(duì)揮發(fā)油的化學(xué)成分和含量存在一定的影響。若要進(jìn)一步闡明抑菌物質(zhì)基礎(chǔ)，可對(duì)該復(fù)方進(jìn)行更為深入的GC、GC-MS研究，分析單味藥與復(fù)方揮發(fā)性成分的組成及含量，為五行香草方的抑菌效果提供確切的理論依據(jù)，為后期的劑型優(yōu)化提供物質(zhì)基礎(chǔ)。