基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的芍藥內(nèi)酯苷抗肝癌的作用機(jī)制研究

周雅婷，羅志強(qiáng)，張彬彬，王武斌，孫睿，于國(guó)華*，史淵源，2*（.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 02488；2.深圳北京中醫(yī)藥大學(xué)研究院，深圳 588）

肝癌是全球癌癥診出率排第六的癌癥，西醫(yī)療法是治療肝癌的主要策略（如手術(shù)切除、肝移植、射頻、化療和靶向分子治療），但肝癌患者的一般預(yù)后仍然不佳[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，癌癥由痰濁、氣滯、血瘀等病理產(chǎn)物與乖戾之氣相合，郁積化為癌毒，邪盛正虛所致。臨床治法強(qiáng)調(diào)肝脾同調(diào)，療效肯定[2]。白芍在中醫(yī)理論中歸肝經(jīng)，具有平肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗等功效，其靶器官很可能在肝臟。實(shí)驗(yàn)研究表明白芍有抑制腫瘤生長(zhǎng)[3]、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥[4]、影響肝癌預(yù)后[5]、抑制細(xì)胞遷移和侵襲[6]等作用。但相關(guān)研究多集中于中藥復(fù)方或者單味中藥，中藥藥物成分復(fù)雜，有多靶點(diǎn)多通路作用的特點(diǎn)，對(duì)獨(dú)立藥物成分抗腫瘤作用的研究可以有助于更好地解釋藥物作用的分子機(jī)制、指導(dǎo)臨床應(yīng)用和新藥研發(fā)。本研究選取肝癌治療常用藥白芍[7]的主要化學(xué)成分——芍藥內(nèi)酯苷[8]進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，進(jìn)一步探索其抗肝癌作用的生物學(xué)機(jī)制，為臨床用藥及新藥研發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 試藥及細(xì)胞

芍藥內(nèi)酯苷（賽譜銳思科技有限公司，貨號(hào)：B21149-20 mg）；CCK8試劑盒（北京蘭博利德商貿(mào)有限公司，貨號(hào)：ceb044hu）；Gibco澳洲胎牛血清（FBS，英濰捷基貿(mào)易有限公司，貨號(hào)：10099141C）；Corning-Cellgro RMPI 1640培養(yǎng)基（貨號(hào)：10-040-CVR）、Corning-Cellgro 0.25%EDTA胰蛋白酶（貨號(hào)：25-053-CI）（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）；Gibco青鏈霉素雙抗（P/S，北京歐北生物科技有限公司，貨號(hào)：15140122）；PBS干粉（北京百諾威生物科技有限公司，貨號(hào)：p1010）；Qiagen RNA提取試劑盒RNeasy Mini Kit（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司，貨號(hào)：74104）；Illumina TruSeqTM RNA sample preparation Kit（貨號(hào)：RS-122-2001）、Invitrogen SuperScript double-stranded cDNA synthesis Kit（貨號(hào)：11917020）（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。HepG2細(xì)胞系（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院）。

1.2 儀器

光學(xué)普通倒置顯微鏡（日本Olympus CKX53）；光學(xué)正倒置一體顯微鏡（日本ECHO RVL-100）；CO2恒溫培養(yǎng)箱160i（美國(guó)Thermo Scientific）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices SpectraMax i3X）；紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo NanoDrop One）；高通量測(cè)序平臺(tái)（美國(guó)Illumina Novaseq 6000）；電泳儀（中國(guó)六一DYCP-32B）；生物芯片分析儀（美國(guó)Agilent 2100）。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 不同濃度芍藥內(nèi)酯苷溶液 取芍藥內(nèi)酯苷樣品 5 mg，用RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗）溶解，渦旋5 min，逐步稀釋成濃度為50、100、250、500、1000、1500、2000、5000 μmol·L－1的溶液。

2.1.2 0.1%結(jié)晶紫溶液 稱取適量結(jié)晶紫，用無(wú)水乙醇溶解配制成濃度為0.5%的結(jié)晶紫母液。以1∶4比例用PBS將其稀釋成0.1%的結(jié)晶紫溶液，用以細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)染色。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。每1～2日傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞進(jìn)行消化計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為約4×104個(gè)·mL－1，以每孔180 μL分別接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別加入20 μL各濃度芍藥內(nèi)酯苷溶液[終濃度為5、10、25、50、100、150、200 μmol·L－1]，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK8，孵育1 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。以不加藥的細(xì)胞為對(duì)照。細(xì)胞存活率（%）＝OD樣品/OD對(duì)照×100%。

2.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

用無(wú)血清的預(yù)冷細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋matrigel基質(zhì)膠，至濃度為250 μg·mL－1。將150 μL稀釋膠加入到transwell上室中。37℃條件下孵育2～4 h后去除未結(jié)合的matrigel基質(zhì)膠。饑餓細(xì)胞12～24 h后消化離心收集細(xì)胞沉淀，PBS清洗1～2遍，用適量芍藥內(nèi)酯苷溶液（終濃度為200 μmol·L－1）或培養(yǎng)基（對(duì)照）重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個(gè)·mL－1。取細(xì)胞懸液200 μL加入transwell小室，下室加入含血清的培養(yǎng)基500 μL。放入培養(yǎng)箱37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后染色拍照計(jì)數(shù)。

2.5 總RNA提取

將細(xì)胞分成對(duì)照組（C組）和500 μmol·L－1芍藥內(nèi)酯苷給藥組（ALB組）兩個(gè)組，每組3個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞懸液鋪進(jìn)12孔板中，7200個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h后，去除上層培養(yǎng)基，對(duì)照組加入培養(yǎng)基200 μL，給藥組加入含終濃度為500 μmol·L－1的芍藥內(nèi)酯苷培養(yǎng)基溶液200 μL，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。加200 μL 0.25% EDTA胰蛋白酶將12孔板中的細(xì)胞消化1 min后終止消化，1000 r·min－1離心，棄去上清液，用PBS清洗細(xì)胞。按RNeasy Mini Kit說(shuō)明書(shū)提取總RNA，測(cè)定RNA濃度和OD260/OD280比值后備用。

2.6 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

真核mRNA測(cè)序使用基于第二代測(cè)序技術(shù)的Illumina Novaseq 6000測(cè)序平臺(tái)，對(duì)真核生物特定組織或細(xì)胞在某個(gè)時(shí)期轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有mRNA進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序?qū)嶒?yàn)采用Illumina TruSeqTM RNA sample prep Kit試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。

2.7 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SeqPrep（https：//github.com/jstjohn/SeqPrep）和Sickle（https：//github.com/najoshi/sickle）軟件對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾分析。將質(zhì)控后的數(shù)據(jù)，即clean data（reads）與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，使用HISAT2（https：//daehwankimlab.github.io/hisat2/）[9]軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析。獲得用于后續(xù)分析的mapped data（reads），同時(shí)運(yùn)用測(cè)序覆蓋度的指標(biāo)對(duì)本次測(cè)序的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。使用軟件StringTie（http：//ccb.jhu.edu/software/stringtie/）[10]將mapped reads進(jìn)行組裝拼接，與已知轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比較，獲得沒(méi)有注釋信息的轉(zhuǎn)錄本，并對(duì)其中潛在的新轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行功能注釋。總結(jié)它們注釋到GO、KEGG、EggCOG、NR、Swiss-Prot、Pfam常用的六大數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)量和百分比。使用RSEM[11]軟件分別對(duì)基因/轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，獲得每個(gè)樣本基因/轉(zhuǎn)錄本的Read Counts。然后對(duì)其進(jìn)行FPKM或TPM轉(zhuǎn)換，進(jìn)而得到標(biāo)準(zhǔn)化的基因/轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平。獲得基因/轉(zhuǎn)錄本的Read Counts數(shù)后，運(yùn)用DESeq2[12]多樣本（≥ 2）項(xiàng)目進(jìn)行樣本間基因/轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)差異分析，設(shè)定閾值差異倍數(shù)Fold-change ≥ 2，P-value＜0.05篩選差異基因，通過(guò)Goatools[13]和R語(yǔ)言編寫(xiě)腳本分析對(duì)差異基因集進(jìn)行聚類(lèi)分析，GO功能分析，KEGG通路富集分析、基因表達(dá)差異分析。

3 結(jié)果

3.1 抗肝癌活性

芍藥內(nèi)酯苷抗肝癌活性結(jié)果見(jiàn)圖1。48 h后，HepG2細(xì)胞隨著芍藥內(nèi)酯苷濃度升高，存活率顯著下降，在200 μmol·L－1時(shí)，存活率只有54%，接近其IC50值。說(shuō)明芍藥內(nèi)酯苷具有抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的效果。

圖1 芍藥內(nèi)酯苷對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用（n＝3）Fig 1 Growth inhibitory effect of albiflorin on HepG2 cells（n＝3）

3.2 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

如圖2所示，當(dāng)芍藥內(nèi)酯苷濃度為200 μmol·L－1時(shí)，具有顯著的抑制肝癌細(xì)胞侵襲的效果（P＜0.05）。說(shuō)明抑制侵襲可能是芍藥內(nèi)酯苷發(fā)揮抗腫瘤作用的途徑之一。

圖2 芍藥內(nèi)酯苷對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲抑制作用（n＝3）Fig 2 Inhibition of albiflorin on the invasion of HepG2 cells（n＝3）

3.3 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控

對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)測(cè)序接頭序列、低質(zhì)量讀段等因素過(guò)濾后的質(zhì)控分析如表1所示。由表1可知，對(duì)原始數(shù)據(jù)低質(zhì)量的因素進(jìn)行過(guò)濾后，所測(cè)樣本的Q30仍全部大于90%，說(shuō)明樣本的測(cè)序質(zhì)量很高，可以用于序列比對(duì)分析。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果分析表Tab 1 Analysis table of sequencing data quality control results

3.4 轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析

一般認(rèn)為基因表達(dá)量（log10[TPM]）在1以上具有較好的表達(dá)效果。因此，我們?cè)O(shè)置表達(dá)量為1，經(jīng)篩選得到，ALB組表達(dá)14 167個(gè)基因，C組表達(dá)14 184個(gè)基因，經(jīng)韋恩圖分析發(fā)現(xiàn)，交叉基因13 815個(gè)，單獨(dú)在ALB組表達(dá)的基因數(shù)是352個(gè)，單獨(dú)在C組表達(dá)的基因數(shù)是369個(gè)。

3.5 轉(zhuǎn)錄組差異分析

經(jīng)篩選，ALB組與空白C組相比，共得到340個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因154個(gè)，下調(diào)基因186個(gè)，見(jiàn)圖3（橫坐標(biāo)為基因在兩個(gè)樣本間表達(dá)差異的倍數(shù)變化值的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)為基因表達(dá)量變化差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)值，即P值的對(duì)數(shù)。圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)特定的基因，紅色點(diǎn)表示顯著上調(diào)的基因，綠色點(diǎn)表示顯著下調(diào)的基因，灰色點(diǎn)為非顯著差異基因）。通過(guò)對(duì)340個(gè)差異基因進(jìn)行GO功能富集和KEGG功能富集，對(duì)差異基因的功能進(jìn)行分類(lèi)和關(guān)聯(lián)。篩選得到GO條目的前10個(gè)條目，包括富集到BP模塊的差異基因，主要涉及到半乳糖基神經(jīng)酰胺生物合成、IL13的細(xì)胞應(yīng)答和鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程；富集到CC模塊的差異基因，主要涉及到核內(nèi)膜和核膜部分的組成；富集到MF模塊的差異基因，主要涉及到膽堿跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。結(jié)果見(jiàn)表2。

圖3 差異基因火山圖Fig 3 Differences gene volcanic map

表2 GO功能富集結(jié)果Tab 2 Results of GO functional enrichment

KEGG功能富集分析篩選得到8條生物學(xué)通路，見(jiàn)圖4，包括色氨酸代謝通路、磷酸肌醇代謝通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、癌癥膽堿代謝通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)通路、鈣信號(hào)通路、炎癥介質(zhì)對(duì)色氨酸通道的調(diào)節(jié)通路、縫隙連接通路，主要集中在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝活動(dòng)、神經(jīng)活性等方面。

圖4 KEGG功能富集的關(guān)鍵生物學(xué)通路Fig 4 Key biological pathways of KEGG functional enrichment

肝癌的發(fā)展過(guò)程一般呈現(xiàn)出四個(gè)階段，從炎癥反應(yīng)到脂肪變性到肝硬化再到肝細(xì)胞癌，在這個(gè)過(guò)程當(dāng)中，代謝功能出現(xiàn)了紊亂，尤其是脂質(zhì)代謝和蛋白質(zhì)代謝的異常變化[14-15]。脂質(zhì)是細(xì)胞膜的主要組成部分，在腫瘤細(xì)胞的血管形成、細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移中具有不容忽視的作用。蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生氨基酸，肝癌細(xì)胞對(duì)氨基酸的代謝是其能量的主要來(lái)源，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖具有重要意義。因此，癌癥膽堿代謝通路、磷酸肌醇代謝通路與色氨酸代謝通路在肝癌細(xì)胞的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)常常在肝病患者體內(nèi)活化增高，血管緊張素Ⅱ可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子形成，促進(jìn)血管生成，推動(dòng)腫瘤的基本發(fā)展過(guò)程，引起肝癌的發(fā)生和加劇[16]。

瞬時(shí)受體電位（transient receptor poential，TRP）通道，是廣泛存在的一種陽(yáng)離子通道，可以與多種炎癥因子結(jié)合，激活TRP通道通透鈣離子（Ca2＋）等陽(yáng)離子，活化鈣信號(hào)通路等陽(yáng)離子信號(hào)通路，通過(guò)對(duì)陽(yáng)離子濃度變化的調(diào)節(jié)進(jìn)一步影響細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)信號(hào)通路的傳遞、轉(zhuǎn)導(dǎo)和整合，引起細(xì)胞功能特性的改變[17]。Ca2＋作為一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)媒介，可以通過(guò)TRP通道的傳導(dǎo)，激活下游的生物學(xué)過(guò)程，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。

近年來(lái)，神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)遞質(zhì)在腫瘤微環(huán)境中的作用逐漸受到關(guān)注，研究表明其通過(guò)激活相應(yīng)的信號(hào)通路來(lái)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)或增加細(xì)胞的遷移活動(dòng)[18]，提示了神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路在肝癌發(fā)展過(guò)程中的重要性。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞縫隙連接與腫瘤的生長(zhǎng)、增殖和變化關(guān)系密切[19]。在癌變初始階段，癌細(xì)胞與周?chē)＜?xì)胞的細(xì)胞間隙連接功能被抑制，通信障礙導(dǎo)致細(xì)胞喪失接觸抑制而無(wú)限擴(kuò)增，由此形成癌變[20]。趙增強(qiáng)等[21]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素能增強(qiáng) HepG2細(xì)胞間縫隙連接功能，重建HepG2細(xì)胞間通信，闡釋了該藥物治療肝癌的可能的作用機(jī)制之一，說(shuō)明細(xì)胞縫隙連接在肝癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用。

芍藥內(nèi)酯苷對(duì)8條關(guān)鍵通路的調(diào)控集中于10個(gè)上調(diào)基因（GRM1、ADRB1、P2RX7、BDKRB1、REN、ASIC4、SLC22A2、AC002996.1、AC104662.2、AC092143.2），12個(gè)下調(diào)基因（TUBA8、PHKA2-AS1、CACNA1H、PLCG1-AS1、RHEBP1、SLC44A5、AANAT、AC135048.1、AL513325.1、AC027796.3、AC011603.2、AL355315.1），其中調(diào)控兩條以上關(guān)鍵通路的基因?yàn)锽DKRB1（2條）、AC011603.2（2條）、TUBA8（2條）、ADRB1（3條）、GRM1（3條）、PLCG1-AS1（4條）。

4 討論

中藥對(duì)腫瘤的殺傷能力普遍弱于化學(xué)藥物，但中藥在提高患者免疫力，減輕放化療的毒副作用、減輕疼痛、防止癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。因此，采用中藥配合放化療等主流療法來(lái)抗擊腫瘤，對(duì)于提高患者的生存質(zhì)量具有重要的意義[22]。本研究選取芍藥代表性成分芍藥內(nèi)酯苷來(lái)探討其抑制肝癌的作用效果，芍藥內(nèi)酯苷能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)和侵襲，在25 μmol·L－1時(shí)對(duì)HepG2的抑制率即達(dá)到30%，且已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明芍藥內(nèi)酯苷具有明確鎮(zhèn)痛作用[23-24]，可聯(lián)合化學(xué)藥物作為輔助用藥，降低化學(xué)藥物用藥劑量，減輕患者痛苦。

本研究結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)探究了芍藥內(nèi)酯苷抗肝癌細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，獲得了芍藥內(nèi)酯苷調(diào)控的關(guān)鍵差異基因，并通過(guò)大數(shù)據(jù)通路富集等方法，進(jìn)一步挖掘了其分子作用機(jī)制。GO功能中富集的差異基因，主要涉及到半乳糖基神經(jīng)酰胺生物合成、IL13的細(xì)胞應(yīng)答和鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、核內(nèi)膜和核膜部分的組成、膽堿跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。在KEGG功能分析中，主要集中在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝活動(dòng)、神經(jīng)活性等方面。許多重要的細(xì)胞生命活動(dòng)如細(xì)胞增殖、分化以及死亡均與信號(hào)傳導(dǎo)密不可分。代謝為細(xì)胞增殖遷移活動(dòng)提供能量保障。KEGG富集通路中受調(diào)節(jié)的重要編碼區(qū)上調(diào)基因?yàn)锽DKRB1、ADRB1、GRM1，下調(diào)基因?yàn)門(mén)UBA8。BDKRB1為緩激肽受體，BDKRB1上調(diào)可通過(guò)下游響應(yīng)促進(jìn)PAK表達(dá)[25]，抑制MLCK降低肌球蛋白收縮，減少肝癌細(xì)胞遷移[26]；BDKRB1還可以通過(guò)調(diào)節(jié)鈣離子信號(hào)通路上調(diào)PKC同工酶表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲[27]。TUBA8編碼α微管蛋白家族的成員，實(shí)驗(yàn)表明TUBA8過(guò)表達(dá)增強(qiáng)HepG2細(xì)胞中的細(xì)胞遷移[28]。ADRB1、GRM1通過(guò)調(diào)節(jié)cAMP、Ca2＋濃度影響PKA、PKC，調(diào)控細(xì)胞縫隙連接，抑制肝癌細(xì)胞遷移和增殖[29-30]。因此，芍藥內(nèi)酯苷很可能是通過(guò)對(duì)上述相關(guān)通路及基因進(jìn)行調(diào)控實(shí)現(xiàn)抑制HepG2細(xì)胞系的生長(zhǎng)增殖與遷移。

綜上所述，芍藥內(nèi)酯苷對(duì)于減少化學(xué)藥物的給藥劑量以減輕其毒副作用，減輕患者癌性疼痛和減少癌細(xì)胞侵襲等具有“增效減毒”的可能。這一方面可為白芍的臨床應(yīng)用及生物學(xué)效應(yīng)機(jī)制提供部分理論支持；另一方面可為新藥研發(fā)提供指導(dǎo)。