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    獨(dú)角蓮抗腫瘤活性成分初步研究

    2021-07-03 08:18:36寧停波李濤姜宇珺梁紅寶姚景春張貴民山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司山東臨沂73400魯南制藥集團(tuán)股份有限公司中藥制藥共性技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室山東臨沂76006
    中南藥學(xué) 2021年6期
    關(guān)鍵詞:抑瘤抑瘤率獨(dú)角

    寧停波,李濤,姜宇珺,梁紅寶,姚景春,張貴民*(.山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司,山東 臨沂73400;.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司中藥制藥共性技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 臨沂 76006)

    獨(dú)角蓮為天南星科犁頭尖屬植物獨(dú)角蓮(Typhonium giganteumEngl.)的干燥地下塊莖,現(xiàn)主產(chǎn)于河南、甘肅等地區(qū)[1],在中國有著悠久的藥用歷史,具有逐寒、祛風(fēng)痰、止痛止痙、解毒散結(jié)之功效,臨床上常用來治療驚風(fēng)癲癇、破傷風(fēng)等癥,民間也用于治療惡瘡、毒蛇咬傷[2]。近年對獨(dú)角蓮的研究主要集中在其抗惡性腫瘤活性方面,且藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)獨(dú)角蓮具有顯著的抑制腫瘤生長作用[3-6],但其相關(guān)的活性成分卻一直沒有確定[7]。之前該植物化學(xué)成分研究主要集中于脂溶性部位,分離得到的化合物主要有腦苷類、有機(jī)酸、氨基酸等成分[8-10]?;讵?dú)角蓮的水提物具有較好活性[11],而且該部位化學(xué)成分的研究報(bào)道很少,所以本文采用活性追蹤法利用模式動(dòng)物對獨(dú)角蓮的水提物進(jìn)行抗腫瘤活性的初步研究。

    1 材料

    Bruker-600 MHz核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司);6500Serises Q-TOF質(zhì)譜儀(美國Aglient公司);半制備型高效液相色譜儀輸液泵(NP7010)、檢測器(NU3001)(漢邦科技)和色譜柱(50 mm×200 mm,北京創(chuàng)新通恒科技有限公司);001×7陽離子交換樹脂和201×4陰離子交換樹脂(天津南開化工廠);薄層硅膠色譜(青島海洋化工廠);步琪R3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司);切片機(jī)(上海南掘中藥機(jī)械制造有限公司,QYJ-200);烘干機(jī)(上海康健中藥機(jī)械制造有限公司,F(xiàn)YJ-8);粉碎機(jī)(上海市藥材藥材有限公司,F(xiàn)Y320);離心機(jī)(上海戴寶機(jī)械設(shè)備有限公司,GQ142);L-精氨酸對照品(深圳市斯坦德化工科技有限公司,純度≥98%);其他試劑均為分析純;ICR小鼠4~6周,雌雄各半,體質(zhì)量18~22 g [北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(京)2016-0011];S180小鼠腹水瘤細(xì)胞(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心);獨(dú)角蓮購自黑龍江省七臺(tái)河,經(jīng)魯南制藥集團(tuán)中藥制藥共性技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李守信高級(jí)工程師鑒定為獨(dú)角蓮Typhonium giganteumEngl.的塊莖,植物標(biāo)本存放于魯南制藥集團(tuán)中藥制藥共性技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

    2 提取與分離

    取鮮獨(dú)角蓮塊莖(50.0 kg)切片、烘干、粉碎,過40目篩,加入10倍量水加熱至微沸提取3次,每次提取2 h,合并提取液,加入95%乙醇調(diào)節(jié)醇濃度至30%,醇沉過夜,離心取上清液,減壓濃縮得總浸膏2.2 kg。將總浸膏溶解于純化水中,上樣預(yù)處理好的001×7陽離子交換樹脂柱(15 kg,13 mm×1400 mm),吸附過夜,收集上樣流出液,蒸干得組分Fr.1(1.8 kg);用純化水沖洗樹脂柱至無色,再用0.5%的氨水洗脫樹脂至無色,收集洗脫液,減壓濃縮至干膏,即得獨(dú)角蓮水提液的活性部位Fr.2(103.1 g)。Fr.2用純化水溶解,上樣預(yù)處理好的201×4陰離子交換樹脂柱(15 kg,13 mm×1400 mm),吸附過夜,收集上樣流出液,蒸干得組分Fr.3(63.7 g);用純化水沖洗樹脂柱至無色,再用0.1%的鹽酸洗脫樹脂至無色,收集洗脫液,減壓濃縮得干膏Fr.4(18.3 g)。Fr.4經(jīng)半制備高效液相色譜分離,甲醇-水(5∶95)為流動(dòng)相,檢測波長220 nm,純化得化合物1(198.3 mg,流速1 mL·min-1,tR=3.715 min)。

    3 結(jié)構(gòu)鑒定

    化合物1:白色結(jié)晶,mp 244℃;1H NMR(600 MHz,D2O)δ:1.59(1H,m,H-2),1.80(1H,d,H-5),3.27(1H,t,H-6);13C NMR(150 MHz,D2O)δ:157.67(C-1),40.39(C-2),23.78(C-3),28.48(C-4),54.22(C-5),179.38(C-6);ESI-MS:m/z175.1 [M+H]-。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12],在相同TLC、HPLC條件下,化合物1與L-精氨酸對照品的Rf值、顯色情況以及出峰時(shí)間完全一致,故鑒定化合物1為L-精氨酸。

    4 對小鼠S180實(shí)體瘤抑制活性

    4.1 對小鼠S180實(shí)體瘤的體內(nèi)抑瘤活性檢測

    體外培養(yǎng)S180細(xì)胞,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×107個(gè)·mL-1,取0.2 mL接種于備用小鼠的腹腔,形成腹水,按以下方法傳代:脫頸處死荷瘤小鼠,放入盛有75%乙醇的燒杯中浸泡5~10 min,將消毒后的小鼠放入超凈工作臺(tái)中,暴露腹部,無菌條件下,抽取小鼠腹水,1000 r·min-1離心5 min,生理鹽水清洗5遍,去除蛋白等雜質(zhì),用生理鹽水調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×107個(gè)·mL-1,0.2 mL接種于備用小鼠的腹腔,待生成腹水后重復(fù)傳代步驟。取2~3代狀態(tài)良好的乳白色腹水離心后,生理鹽水調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×106個(gè)·mL-1,每只0.2 mL接種于實(shí)驗(yàn)小鼠腋下。

    將上述已造模的小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為21組,每組10只,分別為:模型組和不同劑量給藥組;給藥組組分Fr.1、Fr.2按表1所列劑量給藥,組分Fr.3、Fr.4按表2所列劑量給藥,化合物1、L-精氨酸按表3所列劑量給藥。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)劑量灌胃給藥,模型組給予等體積純化水,1次·d-1,連續(xù)10 d。分組后連續(xù)給藥,待模型組腫瘤直徑長至1.2~1.5 cm停藥,麻醉放血,剖檢小鼠,稱取小鼠腫瘤質(zhì)量。抑瘤率=(模型組瘤質(zhì)量-用藥組瘤質(zhì)量)/模型組瘤質(zhì)量×100%。應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間比較采用單因素方差分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(±s)表示,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    4.2 獨(dú)角蓮水提液活性部位的抑瘤活性

    由表1可知,組分Fr.2中、高劑量均能顯著抑制小鼠S180實(shí)體瘤的生長,抑瘤率分別為48.15%和53.70%,而組分Fr.1(001樹脂上樣流出液)不具有抑瘤活性或活性很低。

    表1 組分Fr.1和Fr.2對小鼠S180實(shí)體瘤的抑瘤作用(±s)Tab 1 Anti-tumor effect of Fr.1 and Fr.2 on sarcoma-180 ascite tumor-bearing mice (±s)

    表1 組分Fr.1和Fr.2對小鼠S180實(shí)體瘤的抑瘤作用(±s)Tab 1 Anti-tumor effect of Fr.1 and Fr.2 on sarcoma-180 ascite tumor-bearing mice (±s)

    注(Note):與模型組比較,*P<0.05(Compared with the model group,*P<0.05)。

    組別劑量/(g·kg-1)瘤質(zhì)量/g抑瘤率/%模型組-1.62±0.26-Fr.1不同劑量組21.32±0.31-3.14 4 1.39±0.22 0.61 8 1.24±0.32-8.17 Fr.2不同劑量組20.86±0.31 39.63 4 0.84±0.33* 48.15*8 0.75±0.23* 53.70*

    由表2可知,組分Fr.2繼續(xù)用201×4陰離子交換樹脂柱處理所得組分Fr.4,在低、中、高劑量抑瘤率分別為45.28%、50.31%和55.35%,而組分Fr.3(201×4樹脂上樣流出液)不具有抑瘤活性或活性很低(抑瘤率≤23.47%)。

    表2 組分Fr.3和Fr.4對小鼠S180實(shí)體瘤的抑瘤作用(±s)Tab 2 Anti-tumor effect of Fr.3 and Fr.4 on sarcoma-180 ascite tumor-bearing mice (±s)

    表2 組分Fr.3和Fr.4對小鼠S180實(shí)體瘤的抑瘤作用(±s)Tab 2 Anti-tumor effect of Fr.3 and Fr.4 on sarcoma-180 ascite tumor-bearing mice (±s)

    注(Note):與模型組比較,*P<0.05(Compared with the model group,*P<0.05)。

    組別劑量/(mg·kg-1)瘤質(zhì)量/g抑瘤率/%模型組-1.59±0.33-Fr.3不同劑量組2001.64±0.3214.12 4001.63±0.3318.35 8001.72±0.3323.47 Fr.4不同劑量組2000.87±0.3545.28 4000.79±0.31*50.31*8000.71±0.22**55.35**

    由以上數(shù)據(jù)可以可知,獨(dú)角蓮提取物經(jīng)過抑瘤活性追蹤和離子交換樹脂分離純化后,得到的組分Fr.4仍具有顯著的抑瘤活性。

    4.3 L-精氨酸的抑瘤活性

    獨(dú)角蓮化合物1與同等劑量的L-精氨酸對照品對小鼠S180實(shí)體瘤的生長抑制結(jié)果顯示,中、高劑量L-精氨酸能夠顯著抑制小鼠S180實(shí)體瘤的生長,抑瘤率分別為48.17%、55.48%。表明L-精氨酸在一定劑量范圍內(nèi)對小鼠S180實(shí)體瘤具有劑量依賴性,且與同等劑量的獨(dú)角蓮化合物1組分效果相當(dāng)(見表3)。

    表3 化合物1和L-精氨酸對小鼠S180實(shí)體瘤的抑瘤作用(±s)Tab 3 Anti-tumor effect of compound 1 and L-arginine on sarcoma-180 ascite tumor-bearing mice (±s)

    表3 化合物1和L-精氨酸對小鼠S180實(shí)體瘤的抑瘤作用(±s)Tab 3 Anti-tumor effect of compound 1 and L-arginine on sarcoma-180 ascite tumor-bearing mice (±s)

    注(Note):與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01(Compared with the model control group,*P<0.05,**P<0.01)。

    組別劑量/(mg·kg-1)瘤質(zhì)量/g抑瘤率/%模型組-3.01±0.33-化合物1 82.18±0.3127.57 241.53±0.25*49.20*721.33±0.22**55.81**L-精氨酸 82.21±0.3326.58 241.56±0.22*48.17*721.34±0.29*55.48*

    5 討論

    大量的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)獨(dú)角蓮水煎液具有顯著的抗腫瘤活性,但到目前為止其有效成分仍不明確。為了對獨(dú)角蓮的抗腫瘤活性成分進(jìn)行研究,本課題組摸索過提取其他成分,諸如皂苷和多糖類成分,但經(jīng)荷瘤小鼠S180抗腫瘤實(shí)驗(yàn)篩選發(fā)現(xiàn)其活性很低甚至沒有。本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過對獨(dú)角蓮提取物抑瘤活性研究初步確定了Fr.1和Fr.2給藥劑量范圍2~8 g·kg-1、Fr.3和Fr.4給藥劑量范圍200~800 mg·kg-1、化合物1和精氨酸給藥劑量范圍8~24 mg·kg-1。本文在上述工作的基礎(chǔ)上,選擇抗腫瘤活性顯著的大極性水提液進(jìn)行研究,最終經(jīng)HPLC純化得單體化合物1,經(jīng)鑒定其為L-精氨酸,用同等劑量的L-精氨酸對照品作為對照,發(fā)現(xiàn)抑瘤活性與化合物1基本一致。該實(shí)驗(yàn)初步證明獨(dú)角蓮抗腫瘤活性的有效成分之一是L-精氨酸。

    張劍等[13-14]均報(bào)道L-精氨酸具有一定的抗腫瘤活性;Grossie等[15]認(rèn)為,小劑量和過高劑量L-精氨酸均能促進(jìn)腫瘤生長,只有合適劑量才能抑制腫瘤;也有報(bào)道認(rèn)為L-精氨酸對腫瘤生長無影響,但可促進(jìn)化療藥物發(fā)揮療效[16]。鑒于此,L-精氨酸的抗腫瘤活性作用機(jī)制,還有待進(jìn)一步研究和探討。

    本實(shí)驗(yàn)采用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)活性追蹤法對獨(dú)角蓮抗腫瘤有效成分進(jìn)行了追蹤,最終找到了具有抗腫瘤作用的活性成分之一——L-精氨酸,但由于L-精氨酸抗腫瘤機(jī)制不明,不排除是多種成分協(xié)同作用產(chǎn)生活性的可能性。本文為獨(dú)角蓮抗腫瘤活性研究提供一定的參考,如需明確抗腫瘤機(jī)制,還需要進(jìn)一步研究。

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