壯藥矮陀陀含藥血清通過(guò)激活Bax/Caspase-3誘導(dǎo)H22凋亡

陶林，吳霜，文建文，韋立志（.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)辦公室，南寧 530007；.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南寧 530007；3.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南寧 530007）

肝癌新發(fā)病例全球每年約有78萬(wàn)，其死亡率僅次于肺癌，排名第二[1]。我國(guó)肝癌的5年生存率僅為10.1%，一經(jīng)確診已為晚期[2]。肝癌患者主要以放療、化療為最主要的有效治療手段。順鉑因抗瘤譜廣、療效顯著已經(jīng)成為治療多種惡性腫瘤的臨床一線用藥，其抗腫瘤作用與DNA損傷和DNA合成抑制相關(guān)，主要通過(guò)激活細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。近年來(lái)中醫(yī)藥在腫瘤治療方面取得了較好的成果[3]。壯藥矮陀陀原植物（Munronia henryi）又稱小地黃連、小獨(dú)根、千年矮、思茅地黃連等，其味甘微苦，性涼，具有清熱解毒、活血止痛的功效。廣西民間常用其全草臼爛水煎內(nèi)服治療腹痛、風(fēng)濕痛等[4]，還可用于治療跌打瘀痛、感冒發(fā)熱、咽喉炎、癰腫疔瘡[5]。劉越滇等[6]發(fā)現(xiàn)矮陀陀乙醇提取物具有鎮(zhèn)痛、抗炎活性。Lin 等[7]發(fā)現(xiàn)矮陀陀提取物具有抑菌活性，其中mulavanin D和2α，3α，15β-trihydroxy-20（S）-tigloyl-pregnane對(duì)紅色毛廯菌的MIC（最低抑菌濃度）分別為 25、50 μg·mL－1。此外，矮陀陀具有抗病毒活性，能抑制煙草花葉病毒（TMV）的復(fù)制。Yan等[8]發(fā)現(xiàn)矮陀陀中分離所得檸檬苦素衍生物具有抗腫瘤活性，能顯著抑制HL-60、H22、A-549、MCF-7、SW480 等5種癌細(xì)胞株增殖。Qi等[9]的研究表明矮陀陀提取物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，能夠抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖（抑制率32.8%），并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。矮陀陀在體內(nèi)是否具有抗腫瘤活性尚未見報(bào)道，本研究擬探究矮陀陀含藥血清對(duì)小鼠肝癌H22細(xì)胞株的增殖影響及機(jī)制，闡明矮陀陀的抗腫瘤活性及可能機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞與動(dòng)物

小鼠肝癌細(xì)胞株H22購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科院腫瘤醫(yī)院（廣西醫(yī)科大學(xué)藥理教研室傳代保存）。SPF級(jí)雄性SD大鼠25只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF動(dòng)物房，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK桂2014-0002。

1.2 試藥

壯藥矮陀陀，采自廣西靖西縣，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥鑒定室文建文主管藥師鑒定為楝科植物地黃連屬云南地黃連Munronia delavayiFranch.干燥全株，注射用順鉑（江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：20 mg，批號(hào)：150701），DMEM培養(yǎng)液（Sigma公司），F(xiàn)BS（胎牛血清，杭州四季青生物公司），胰蛋白酶消化液（Hyclone公司），青霉素鏈霉素混合液（Solarbio公司），MTT（四甲基偶氮唑藍(lán)）檢測(cè)試劑盒（科昊生物公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA公司），caspase-3（細(xì)胞凋亡蛋白酶）檢測(cè)定量試劑盒（abcamab公司），TRIzol裂解液（Invitrogen公司），Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（翊圣生物公司）。PCR引物設(shè)計(jì)由擎科生物公司設(shè)計(jì)，見表1及表2。

表1 熒光定量PCR引物序列Tab 1 Quantitative real-time PCR primer sequence

表2 PCR反應(yīng)體系Tab 2 Reaction system of PCR

1.3 儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Heal Force公司），流式細(xì)胞儀（Beckman公司），低溫高速離心機(jī)（Eppendorf公司），倒置顯微鏡（Nikon公司），熒光顯微鏡（Olympus公司），定量PCR儀（Applied Biosystems公司），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、Gel Image System凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-rad公司）。

2 方法

2.1 矮陀陀含藥血清制備

將4 kg藥材切成直徑0.5 cm左右的細(xì)條后用水提?。尤?倍量的純凈水先冷浸1 h，再文火加熱回流2 h，提取2次，過(guò)濾，合并濾液）；提取液濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋蒸濃縮為8 mg·mL－1的生藥液冷藏備用。使用時(shí)再配制成相應(yīng)的濃度。

取SPF級(jí)雄性SD大鼠25只，體質(zhì)量180～220 g，隨機(jī)分成5組，每組5只，分別為空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量給藥組、中劑量給藥組和高劑量給藥組?？瞻讓?duì)照組灌胃給予生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃給予順鉑（1 mg·kg－1），低、中、高劑量組分別按20、40、80 mg·kg－1灌胃給予由生理鹽水配制的生藥液；每日給藥2次，每次1 mg·mL－1，連續(xù)給藥5 d。末次給藥前禁食不禁水12 h，末次給藥后1 h，以0.003 g·mL－1水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血。血液室溫放置4 h后，待血塊凝結(jié)，3000 r·min－1離心20 min，吸取上部血清得到含藥血清。同組動(dòng)物血清合并，經(jīng)56℃滅活30 min，于無(wú)菌環(huán)境中用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝，置冰箱－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 H22細(xì)胞培養(yǎng)

H22細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的濃度接種于96孔板中，10%FBS的DMEM作為培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每日換液一次，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)采用胰蛋白酶消化液進(jìn)行消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H22細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)過(guò)夜。待其貼壁后，棄去上層培養(yǎng)基，分別加入含15%不同含藥血清的培養(yǎng)基（根據(jù)前期文獻(xiàn)調(diào)研及預(yù)實(shí)驗(yàn)確定），在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入20 μL 5 mg·mL－1的MTT孵育4 h，棄去全部液體，每孔加入200 μL DMSO，搖床震蕩10 min 后，酶標(biāo)儀在492 nm處測(cè)定吸光度值，每孔設(shè)定5個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞抑制率＝（OD空白對(duì)照組－OD實(shí)驗(yàn)組）/OD空白對(duì)照組×100%。

2.4 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H22細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中，按“2.3”項(xiàng)下方法加藥培養(yǎng)24 h。0.25%胰酶室溫消化細(xì)胞3 min，1000 r·min－1離心3 min，棄去上清液。細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2遍后，用500 μL Binding Buffer重懸，依次加入1 μL Annexin V-FITC和5 μL PI（碘化丙啶）混勻，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2.5 RT-PCR檢測(cè)Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)情況

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H22細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中，按“2.3”項(xiàng)下方法加藥培養(yǎng)24 h。0.25%胰酶室溫消化，1000 r·min－1離心3 min，棄去上清液，細(xì)胞用PBS清洗2遍，收集細(xì)胞按照TAKARA試劑盒說(shuō)明書提取mRNA，PCR條件：94℃預(yù)變性 2 min，“94℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s”×35 個(gè)循環(huán)，72℃終延伸 2 min。以β-actin為內(nèi)參與空白對(duì)照組進(jìn)行相對(duì)定量，計(jì)算方法采用2－△△ct計(jì)算相對(duì)定量結(jié)果。

2.6 蛋白提取以及Western Blot檢測(cè)Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H22細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中，按“2.3”項(xiàng)下方法加藥培養(yǎng)24 h。加入100×蛋白酶抑制劑0.8 μL和80 μL RIPA反復(fù)吹打裂解，冰上裂解15 min后12 000 r·min－1、4℃離心10 min。取上清液，加入五分之一體積的5×蛋白上樣緩沖液，沸水加熱5 min變性，－20℃保存。BCA試劑盒定量后，將蛋白樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠 100 V 電泳約 1 h，電轉(zhuǎn)液中濕性電轉(zhuǎn)（80 V）2 h，電轉(zhuǎn)至 PVDF（聚偏氟乙烯）膜，4%脫脂奶粉 37℃封閉2 h，搖床搖勻，加入抗體Caspase3（1∶1000 稀釋）、Bax 抗體（1∶1000 稀釋）、Bcl-2（1∶1000 稀釋）、β-actin（1∶2000稀釋），4℃搖床過(guò)夜。1% TBST洗膜，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育2 h，1% TBST洗膜后加入適宜劑量的 ECL 顯色液在暗室凝膠成像儀下曝光成像，并用 Image J 軟件進(jìn)行圖像分析。

2.7 Caspase-3 的免疫熒光染色

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H22細(xì)胞以2×104個(gè)/孔接種于放有蓋玻片的24孔板中，按“2.3”項(xiàng)下方法加藥培養(yǎng)24 h。玻片用PBS清洗2次，每次2 min。室溫下用4%多聚甲醛孵育10 min固定細(xì)胞。磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）清洗細(xì)胞2次，每次2 min；PBS-5% Tween 20浸潤(rùn)10 min；PBST清洗細(xì)胞2次，每次2 min；5% FBS室溫封閉1 h；人源Caspase-3抗體按1∶100比例稀釋用5% FBS稀釋后，取20 μL加入細(xì)胞室溫孵育2 h；PBST清洗細(xì)胞2次，每次2 min；加入按1∶100比例用5% FBS稀釋的山羊抗人的異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記IgG二抗，室溫孵育1 h；PBST清洗細(xì)胞2次，每次2 min；細(xì)胞用5 μg·mL－14'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）室溫孵育1 h復(fù)染；最后用甘油封閉后，激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察拍照；用Image J軟件測(cè)量熒光強(qiáng)度，GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 矮陀陀抑制H22的增殖

結(jié)果如表3所示，與空白對(duì)照組比較，矮陀陀含藥血清對(duì)H22細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用（P＜0.05），并且隨著矮陀陀給藥劑量的增加，抑制率顯著增加。

表3 含順鉑、不同劑量矮陀陀的血清對(duì)H22增殖的影響(n＝5)Tab 3 Effect of serum containing cisplatin，different doses of Munronia henryi on H22 proliferation (n＝5)

3.2 矮陀陀含藥血清可促進(jìn)H22細(xì)胞的凋亡

矮陀陀含藥血清和順鉑含藥血清均能誘導(dǎo)H22細(xì)胞凋亡（見圖1）。隨著矮陀陀給藥劑量的增加，凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，見表4。

圖1 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)含順鉑、不同劑量矮陀陀的血清分別在不同時(shí)間對(duì)H22凋亡的影響Fig 1 Annexin V-FITC/PI flow cytometry for determing the effect of serum containing cisplatin，different doses of Munronia henryi on H22 apoptosis at different time

表4 含順鉑、不同劑量矮陀陀的血清對(duì)H22凋亡的影響(n＝3)Tab 4 Effect of serum containing cisplatin，different doses of Munronia henryi on H22 apoptosis (n＝3)

3.3 矮陀陀含藥血清對(duì)Bax、Caspase-3和 Bcl-2的mRNA表達(dá)水平的影響

與空白對(duì)照組相比，順鉑能顯著增加H22細(xì)胞中Bax和Caspase-3的mRNA水平，并且顯著降低Bcl-2的mRNA水平。不同劑量的矮陀陀含藥血清具有類似的作用，且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，隨著矮陀陀給藥劑量的增加，Bcl-2的mRNA水平逐漸降低，Bax和Caspase-3的mRNA水平逐漸增加，結(jié)果見表5。

表5 含順鉑、不同劑量矮陀陀血清對(duì)H22細(xì)胞Bcl-2，Bax，Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響(n＝3)Tab 5 Effect of serum containing cisplatin，different doses of Munronia henryi on relative expression levels of Bcl-2，Bax and Caspase-3 mRNA in H22 cells (n＝3)

3.4 矮陀陀含藥血清對(duì)Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白的表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組相比，矮陀陀含藥血清和順鉑含藥血清都能顯著增加H22細(xì)胞中Bax和Caspase-3的蛋白表達(dá)，并且顯著抑制Bcl-2的蛋白表達(dá)。隨著矮陀陀濃度的增加Bax/Bcl-2比值逐漸增加，在高劑量時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.005），表明矮陀陀可能通過(guò)增加Bax/Bcl-2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。結(jié)果如圖2所示。

圖2 Western Blot檢測(cè)含順鉑、不同劑量矮陀陀的血清處理后H22細(xì)胞中Bcl2、Bax和Caspase-3表達(dá)情況Fig 2 Western Blot in detecting the expression of Bcl2，Bax and Caspase-3 in H22 cells treated with serum containing containing cisplatin and different doses of Munronia henryi

3.5 免疫熒光檢測(cè)矮陀陀可增加Caspase-3蛋白的表達(dá)

如圖3A所示，相對(duì)于空白對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組和矮陀陀高劑量組Caspase-3熒光強(qiáng)度顯著增加（P＜0.01），這一結(jié)果與Western Blot中的陽(yáng)性對(duì)照組和矮陀陀高劑量組Caspase-3表達(dá)量顯著增加一致，如圖3B所示，隨著矮陀陀劑量的增加Caspase-3熒光強(qiáng)度也逐漸增加，呈劑量依賴性。

圖3 免疫熒光檢測(cè)含順鉑、不同劑量矮陀陀的血清處理后H22細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá)情況（標(biāo)尺＝50 μm）Fig 3 Immunofluorescence was used to detect the expression of Caspase-3 in H22 cells treated with serum containing cisplatin and different doses of Munronia henryi（scale＝50 μm）

4 討論

本實(shí)驗(yàn)涉及的矮陀陀供試液為其水提粗提物。含藥血清為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)灌胃給藥一定時(shí)間后采集到的動(dòng)物血清，適宜于研究成分復(fù)雜的中草藥藥理藥效。采集含藥血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)使中藥藥效的研究不再局限于整體的功能研究，而是根據(jù)體內(nèi)有效藥物的主要存在部位，結(jié)合細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)手段，從基因、基因產(chǎn)物、藥物受體和酶活性等方面闡述藥物作用機(jī)制[10]。采用血清藥理學(xué)的研究方法，在藥物體外活性研究時(shí)能在一定程度上排除粗提物其他因素的干擾，使結(jié)果更為可靠[11]。含中藥的血清可直接用于體外研究，所反映的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為客觀具體，為中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥的研究拓寬了思路，提供了新的方法。然而，該方法起步較晚，仍然存在一些不足，首先在含藥血清的制備過(guò)程中，給藥劑量、采血時(shí)間和動(dòng)物模型都沒(méi)有嚴(yán)格的規(guī)定，標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，無(wú)法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化制訂，為解決這一問(wèn)題，在實(shí)驗(yàn)開啟前需要查閱文獻(xiàn)并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)，才能最大程度地提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的客觀性。其次當(dāng)藥物進(jìn)入體內(nèi)血液循環(huán)，經(jīng)過(guò)代謝可能轉(zhuǎn)化為其他代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致最終進(jìn)入血液的不是藥物原形成分，為解決這一問(wèn)題，可與藥物分析、藥代動(dòng)力學(xué)、藥物化學(xué)等專業(yè)結(jié)合，聯(lián)合采用質(zhì)譜、液相、核磁等分析手段，進(jìn)一步完善和發(fā)展血清藥理學(xué)。

本研究結(jié)果證明，矮陀陀可抑制肝癌細(xì)胞株H22增殖并促進(jìn)其凋亡（P＜0.05）。線粒體中凋亡分子Apaf-1釋放與細(xì)胞色素C相互作用激活Caspase-3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]，激活后的Caspase-3、PARP1、Bcl-2和Bax可直接激活上述一種或幾種凋亡通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。本研究中矮陀陀處理后Caspase-3的顯著升高是其導(dǎo)致H22凋亡的主要原因。Bax/Bcl-2比值對(duì)于細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡狀態(tài)有決定意義，Bcl-2分布在細(xì)胞質(zhì)中調(diào)控線粒體膜的通透性，通過(guò)降低線粒體膜電位、抑制細(xì)胞色素C釋放以及Caspase-3激活從而對(duì)凋亡產(chǎn)生負(fù)調(diào)控[14]；Bax作用正好相反，當(dāng)期構(gòu)象發(fā)生改變時(shí)，進(jìn)入線粒體并破壞線粒體膜，釋放細(xì)胞色素C，激活Cyt C/Caspase-9信號(hào)通路，對(duì)細(xì)胞凋亡起正調(diào)控[15]。Bcl-2和Bax之間形成異源二聚體，Bax/Bcl-2比值增加可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低則抑制細(xì)胞凋亡，故矮陀陀含藥血清促進(jìn)H22凋亡可能與激活Bax和Caspase-3表達(dá)，以及增加Bax/Bcl-2比值有關(guān)。有大量研究指出多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展與Bax、Bcl-2密不可分，如Albamonte等[16]檢測(cè)了215例卵巢癌患者中Bax和Bcl-2表達(dá)情況，Bax陽(yáng)性率為30%，Bcl-2陽(yáng)性率為47%，Bax陽(yáng)性者的預(yù)后優(yōu)于Bax陰性者；Bcl-2陽(yáng)性者預(yù)后不如Bcl-2陰性者。崔運(yùn)浩等[17]研究也證明黃芪多糖能明顯增加人胃癌細(xì)胞中Bax/Bcl-2比值，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，矮陀陀能抑制H22細(xì)胞增殖，并且通過(guò)激活Bax和Caspase-3表達(dá)，以及增加Bax/Bcl-2比值誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。