陶林,吳霜,文建文,韋立志(.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)辦公室,南寧 530007;.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,南寧 530007;3.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部,南寧 530007)
肝癌新發(fā)病例全球每年約有78萬(wàn),其死亡率僅次于肺癌,排名第二[1]。我國(guó)肝癌的5年生存率僅為10.1%,一經(jīng)確診已為晚期[2]。肝癌患者主要以放療、化療為最主要的有效治療手段。順鉑因抗瘤譜廣、療效顯著已經(jīng)成為治療多種惡性腫瘤的臨床一線用藥,其抗腫瘤作用與DNA損傷和DNA合成抑制相關(guān),主要通過(guò)激活細(xì)胞凋亡,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。近年來(lái)中醫(yī)藥在腫瘤治療方面取得了較好的成果[3]。壯藥矮陀陀原植物(Munronia henryi)又稱小地黃連、小獨(dú)根、千年矮、思茅地黃連等,其味甘微苦,性涼,具有清熱解毒、活血止痛的功效。廣西民間常用其全草臼爛水煎內(nèi)服治療腹痛、風(fēng)濕痛等[4],還可用于治療跌打瘀痛、感冒發(fā)熱、咽喉炎、癰腫疔瘡[5]。劉越滇等[6]發(fā)現(xiàn)矮陀陀乙醇提取物具有鎮(zhèn)痛、抗炎活性。Lin 等[7]發(fā)現(xiàn)矮陀陀提取物具有抑菌活性,其中mulavanin D和2α,3α,15β-trihydroxy-20(S)-tigloyl-pregnane對(duì)紅色毛廯菌的MIC(最低抑菌濃度)分別為 25、50 μg·mL-1。此外,矮陀陀具有抗病毒活性,能抑制煙草花葉病毒(TMV)的復(fù)制。Yan等[8]發(fā)現(xiàn)矮陀陀中分離所得檸檬苦素衍生物具有抗腫瘤活性,能顯著抑制HL-60、H22、A-549、MCF-7、SW480 等5種癌細(xì)胞株增殖。Qi等[9]的研究表明矮陀陀提取物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性,能夠抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖(抑制率32.8%),并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。矮陀陀在體內(nèi)是否具有抗腫瘤活性尚未見報(bào)道,本研究擬探究矮陀陀含藥血清對(duì)小鼠肝癌H22細(xì)胞株的增殖影響及機(jī)制,闡明矮陀陀的抗腫瘤活性及可能機(jī)制,為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
小鼠肝癌細(xì)胞株H22購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科院腫瘤醫(yī)院(廣西醫(yī)科大學(xué)藥理教研室傳代保存)。SPF級(jí)雄性SD大鼠25只,體質(zhì)量180~220 g,購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF動(dòng)物房,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK桂2014-0002。
壯藥矮陀陀,采自廣西靖西縣,由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥鑒定室文建文主管藥師鑒定為楝科植物地黃連屬云南地黃連Munronia delavayiFranch.干燥全株,注射用順鉑(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司,規(guī)格:20 mg,批號(hào):150701),DMEM培養(yǎng)液(Sigma公司),F(xiàn)BS(胎牛血清,杭州四季青生物公司),胰蛋白酶消化液(Hyclone公司),青霉素鏈霉素混合液(Solarbio公司),MTT(四甲基偶氮唑藍(lán))檢測(cè)試劑盒(科昊生物公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA公司),caspase-3(細(xì)胞凋亡蛋白酶)檢測(cè)定量試劑盒(abcamab公司),TRIzol裂解液(Invitrogen公司),Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(翊圣生物公司)。PCR引物設(shè)計(jì)由擎科生物公司設(shè)計(jì),見表1及表2。
表1 熒光定量PCR引物序列Tab 1 Quantitative real-time PCR primer sequence
表2 PCR反應(yīng)體系Tab 2 Reaction system of PCR
CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heal Force公司),流式細(xì)胞儀(Beckman公司),低溫高速離心機(jī)(Eppendorf公司),倒置顯微鏡(Nikon公司),熒光顯微鏡(Olympus公司),定量PCR儀(Applied Biosystems公司),酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、Gel Image System凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-rad公司)。
將4 kg藥材切成直徑0.5 cm左右的細(xì)條后用水提?。尤?倍量的純凈水先冷浸1 h,再文火加熱回流2 h,提取2次,過(guò)濾,合并濾液);提取液濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋蒸濃縮為8 mg·mL-1的生藥液冷藏備用。使用時(shí)再配制成相應(yīng)的濃度。
取SPF級(jí)雄性SD大鼠25只,體質(zhì)量180~220 g,隨機(jī)分成5組,每組5只,分別為空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量給藥組、中劑量給藥組和高劑量給藥組??瞻讓?duì)照組灌胃給予生理鹽水,陽(yáng)性對(duì)照組灌胃給予順鉑(1 mg·kg-1),低、中、高劑量組分別按20、40、80 mg·kg-1灌胃給予由生理鹽水配制的生藥液;每日給藥2次,每次1 mg·mL-1,連續(xù)給藥5 d。末次給藥前禁食不禁水12 h,末次給藥后1 h,以0.003 g·mL-1水合氯醛麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈取血。血液室溫放置4 h后,待血塊凝結(jié),3000 r·min-1離心20 min,吸取上部血清得到含藥血清。同組動(dòng)物血清合并,經(jīng)56℃滅活30 min,于無(wú)菌環(huán)境中用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌,分裝,置冰箱-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
H22細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的濃度接種于96孔板中,10%FBS的DMEM作為培養(yǎng)基,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,每日換液一次,待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)采用胰蛋白酶消化液進(jìn)行消化傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H22細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中,37℃、5%CO2培養(yǎng)過(guò)夜。待其貼壁后,棄去上層培養(yǎng)基,分別加入含15%不同含藥血清的培養(yǎng)基(根據(jù)前期文獻(xiàn)調(diào)研及預(yù)實(shí)驗(yàn)確定),在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入20 μL 5 mg·mL-1的MTT孵育4 h,棄去全部液體,每孔加入200 μL DMSO,搖床震蕩10 min 后,酶標(biāo)儀在492 nm處測(cè)定吸光度值,每孔設(shè)定5個(gè)復(fù)孔,細(xì)胞抑制率=(OD空白對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組)/OD空白對(duì)照組×100%。
將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H22細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中,按“2.3”項(xiàng)下方法加藥培養(yǎng)24 h。0.25%胰酶室溫消化細(xì)胞3 min,1000 r·min-1離心3 min,棄去上清液。細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2遍后,用500 μL Binding Buffer重懸,依次加入1 μL Annexin V-FITC和5 μL PI(碘化丙啶)混勻,室溫避光孵育15 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H22細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中,按“2.3”項(xiàng)下方法加藥培養(yǎng)24 h。0.25%胰酶室溫消化,1000 r·min-1離心3 min,棄去上清液,細(xì)胞用PBS清洗2遍,收集細(xì)胞按照TAKARA試劑盒說(shuō)明書提取mRNA,PCR條件:94℃預(yù)變性 2 min,“94℃變性 30 s,60℃退火 30 s,72℃延伸 30 s”×35 個(gè)循環(huán),72℃終延伸 2 min。以β-actin為內(nèi)參與空白對(duì)照組進(jìn)行相對(duì)定量,計(jì)算方法采用2-△△ct計(jì)算相對(duì)定量結(jié)果。
將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H22細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中,按“2.3”項(xiàng)下方法加藥培養(yǎng)24 h。加入100×蛋白酶抑制劑0.8 μL和80 μL RIPA反復(fù)吹打裂解,冰上裂解15 min后12 000 r·min-1、4℃離心10 min。取上清液,加入五分之一體積的5×蛋白上樣緩沖液,沸水加熱5 min變性,-20℃保存。BCA試劑盒定量后,將蛋白樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠 100 V 電泳約 1 h,電轉(zhuǎn)液中濕性電轉(zhuǎn)(80 V)2 h,電轉(zhuǎn)至 PVDF(聚偏氟乙烯)膜,4%脫脂奶粉 37℃封閉2 h,搖床搖勻,加入抗體Caspase3(1∶1000 稀釋)、Bax 抗體(1∶1000 稀釋)、Bcl-2(1∶1000 稀釋)、β-actin(1∶2000稀釋),4℃搖床過(guò)夜。1% TBST洗膜,加入相應(yīng)二抗,室溫孵育2 h,1% TBST洗膜后加入適宜劑量的 ECL 顯色液在暗室凝膠成像儀下曝光成像,并用 Image J 軟件進(jìn)行圖像分析。
將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H22細(xì)胞以2×104個(gè)/孔接種于放有蓋玻片的24孔板中,按“2.3”項(xiàng)下方法加藥培養(yǎng)24 h。玻片用PBS清洗2次,每次2 min。室溫下用4%多聚甲醛孵育10 min固定細(xì)胞。磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)清洗細(xì)胞2次,每次2 min;PBS-5% Tween 20浸潤(rùn)10 min;PBST清洗細(xì)胞2次,每次2 min;5% FBS室溫封閉1 h;人源Caspase-3抗體按1∶100比例稀釋用5% FBS稀釋后,取20 μL加入細(xì)胞室溫孵育2 h;PBST清洗細(xì)胞2次,每次2 min;加入按1∶100比例用5% FBS稀釋的山羊抗人的異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記IgG二抗,室溫孵育1 h;PBST清洗細(xì)胞2次,每次2 min;細(xì)胞用5 μg·mL-14',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)室溫孵育1 h復(fù)染;最后用甘油封閉后,激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察拍照;用Image J軟件測(cè)量熒光強(qiáng)度,GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用方差分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果如表3所示,與空白對(duì)照組比較,矮陀陀含藥血清對(duì)H22細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用(P<0.05),并且隨著矮陀陀給藥劑量的增加,抑制率顯著增加。
表3 含順鉑、不同劑量矮陀陀的血清對(duì)H22增殖的影響(n=5)Tab 3 Effect of serum containing cisplatin,different doses of Munronia henryi on H22 proliferation (n=5)
矮陀陀含藥血清和順鉑含藥血清均能誘導(dǎo)H22細(xì)胞凋亡(見圖1)。隨著矮陀陀給藥劑量的增加,凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著增加,見表4。
圖1 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)含順鉑、不同劑量矮陀陀的血清分別在不同時(shí)間對(duì)H22凋亡的影響Fig 1 Annexin V-FITC/PI flow cytometry for determing the effect of serum containing cisplatin,different doses of Munronia henryi on H22 apoptosis at different time
表4 含順鉑、不同劑量矮陀陀的血清對(duì)H22凋亡的影響(n=3)Tab 4 Effect of serum containing cisplatin,different doses of Munronia henryi on H22 apoptosis (n=3)
與空白對(duì)照組相比,順鉑能顯著增加H22細(xì)胞中Bax和Caspase-3的mRNA水平,并且顯著降低Bcl-2的mRNA水平。不同劑量的矮陀陀含藥血清具有類似的作用,且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性,隨著矮陀陀給藥劑量的增加,Bcl-2的mRNA水平逐漸降低,Bax和Caspase-3的mRNA水平逐漸增加,結(jié)果見表5。
表5 含順鉑、不同劑量矮陀陀血清對(duì)H22細(xì)胞Bcl-2,Bax,Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響(n=3)Tab 5 Effect of serum containing cisplatin,different doses of Munronia henryi on relative expression levels of Bcl-2,Bax and Caspase-3 mRNA in H22 cells (n=3)
與空白對(duì)照組相比,矮陀陀含藥血清和順鉑含藥血清都能顯著增加H22細(xì)胞中Bax和Caspase-3的蛋白表達(dá),并且顯著抑制Bcl-2的蛋白表達(dá)。隨著矮陀陀濃度的增加Bax/Bcl-2比值逐漸增加,在高劑量時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005),表明矮陀陀可能通過(guò)增加Bax/Bcl-2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。結(jié)果如圖2所示。
圖2 Western Blot檢測(cè)含順鉑、不同劑量矮陀陀的血清處理后H22細(xì)胞中Bcl2、Bax和Caspase-3表達(dá)情況Fig 2 Western Blot in detecting the expression of Bcl2,Bax and Caspase-3 in H22 cells treated with serum containing containing cisplatin and different doses of Munronia henryi
如圖3A所示,相對(duì)于空白對(duì)照組,陽(yáng)性對(duì)照組和矮陀陀高劑量組Caspase-3熒光強(qiáng)度顯著增加(P<0.01),這一結(jié)果與Western Blot中的陽(yáng)性對(duì)照組和矮陀陀高劑量組Caspase-3表達(dá)量顯著增加一致,如圖3B所示,隨著矮陀陀劑量的增加Caspase-3熒光強(qiáng)度也逐漸增加,呈劑量依賴性。
圖3 免疫熒光檢測(cè)含順鉑、不同劑量矮陀陀的血清處理后H22細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá)情況(標(biāo)尺=50 μm)Fig 3 Immunofluorescence was used to detect the expression of Caspase-3 in H22 cells treated with serum containing cisplatin and different doses of Munronia henryi(scale=50 μm)
本實(shí)驗(yàn)涉及的矮陀陀供試液為其水提粗提物。含藥血清為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)灌胃給藥一定時(shí)間后采集到的動(dòng)物血清,適宜于研究成分復(fù)雜的中草藥藥理藥效。采集含藥血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)使中藥藥效的研究不再局限于整體的功能研究,而是根據(jù)體內(nèi)有效藥物的主要存在部位,結(jié)合細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)手段,從基因、基因產(chǎn)物、藥物受體和酶活性等方面闡述藥物作用機(jī)制[10]。采用血清藥理學(xué)的研究方法,在藥物體外活性研究時(shí)能在一定程度上排除粗提物其他因素的干擾,使結(jié)果更為可靠[11]。含中藥的血清可直接用于體外研究,所反映的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為客觀具體,為中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥的研究拓寬了思路,提供了新的方法。然而,該方法起步較晚,仍然存在一些不足,首先在含藥血清的制備過(guò)程中,給藥劑量、采血時(shí)間和動(dòng)物模型都沒(méi)有嚴(yán)格的規(guī)定,標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一,無(wú)法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化制訂,為解決這一問(wèn)題,在實(shí)驗(yàn)開啟前需要查閱文獻(xiàn)并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn),才能最大程度地提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的客觀性。其次當(dāng)藥物進(jìn)入體內(nèi)血液循環(huán),經(jīng)過(guò)代謝可能轉(zhuǎn)化為其他代謝產(chǎn)物,導(dǎo)致最終進(jìn)入血液的不是藥物原形成分,為解決這一問(wèn)題,可與藥物分析、藥代動(dòng)力學(xué)、藥物化學(xué)等專業(yè)結(jié)合,聯(lián)合采用質(zhì)譜、液相、核磁等分析手段,進(jìn)一步完善和發(fā)展血清藥理學(xué)。
本研究結(jié)果證明,矮陀陀可抑制肝癌細(xì)胞株H22增殖并促進(jìn)其凋亡(P<0.05)。線粒體中凋亡分子Apaf-1釋放與細(xì)胞色素C相互作用激活Caspase-3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[12],激活后的Caspase-3、PARP1、Bcl-2和Bax可直接激活上述一種或幾種凋亡通路,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。本研究中矮陀陀處理后Caspase-3的顯著升高是其導(dǎo)致H22凋亡的主要原因。Bax/Bcl-2比值對(duì)于細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡狀態(tài)有決定意義,Bcl-2分布在細(xì)胞質(zhì)中調(diào)控線粒體膜的通透性,通過(guò)降低線粒體膜電位、抑制細(xì)胞色素C釋放以及Caspase-3激活從而對(duì)凋亡產(chǎn)生負(fù)調(diào)控[14];Bax作用正好相反,當(dāng)期構(gòu)象發(fā)生改變時(shí),進(jìn)入線粒體并破壞線粒體膜,釋放細(xì)胞色素C,激活Cyt C/Caspase-9信號(hào)通路,對(duì)細(xì)胞凋亡起正調(diào)控[15]。Bcl-2和Bax之間形成異源二聚體,Bax/Bcl-2比值增加可促進(jìn)細(xì)胞凋亡,降低則抑制細(xì)胞凋亡,故矮陀陀含藥血清促進(jìn)H22凋亡可能與激活Bax和Caspase-3表達(dá),以及增加Bax/Bcl-2比值有關(guān)。有大量研究指出多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展與Bax、Bcl-2密不可分,如Albamonte等[16]檢測(cè)了215例卵巢癌患者中Bax和Bcl-2表達(dá)情況,Bax陽(yáng)性率為30%,Bcl-2陽(yáng)性率為47%,Bax陽(yáng)性者的預(yù)后優(yōu)于Bax陰性者;Bcl-2陽(yáng)性者預(yù)后不如Bcl-2陰性者。崔運(yùn)浩等[17]研究也證明黃芪多糖能明顯增加人胃癌細(xì)胞中Bax/Bcl-2比值,從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。
綜上所述,矮陀陀能抑制H22細(xì)胞增殖,并且通過(guò)激活Bax和Caspase-3表達(dá),以及增加Bax/Bcl-2比值誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。