羥基紅花黃色素A通過(guò)調(diào)控Sirt1/FOXO1信號(hào)通路減輕大鼠肝缺血再灌注損傷*

朱仁英，郎玉玲，王久英，趙玉梅，曲治權(quán)

（牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江牡丹江157011）

肝臟缺血再灌注損傷（hepatic ischemia-reperfu‐sion injury，HIRI）是肝臟在缺血狀態(tài)下再灌注，不僅不能緩解疾病，反而加重細(xì)胞凋亡、炎癥因子釋放和氧化應(yīng)激等，造成肝組織損傷，造成功能障礙［1］。越來(lái)越多的藥物預(yù)處理辦法用于減輕HIRI，中藥提取物劑量穩(wěn)定，且安全性高、副作用小，在HIRI中有一定應(yīng)用［2］。羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）作為中藥紅花提取物中主要的有效成分，具有抗氧化、抗炎和抗缺血再灌注損傷等多種作用［3］，在肺缺血再灌注［4］和腦缺血再灌注［5］等缺血再灌注損傷中有一定的應(yīng)用價(jià)值，但尚未見(jiàn)其在HIRI中的相關(guān)研究。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent informa‐tion regulator 1，Sirt1）/叉頭框蛋白O1（forkhead box protein O1，F(xiàn)OXO1）信號(hào)通路在調(diào)節(jié)心肌缺血再灌注中研究廣泛，激活Sirt1/FOXO1通路可減輕缺血再灌注損傷，實(shí)現(xiàn)對(duì)缺血再灌注心肌的保護(hù)［6］，但在HIRI中研究較少。因此，本研究構(gòu)建HIRI大鼠模型，采用HSYA預(yù)處理觀察其對(duì)HIRI的影響，并初步探討其作用機(jī)制，為HIRI的治療方法提供參考資料。

材料和方法

1 動(dòng)物

96只SPF級(jí)雄性SD大鼠，7周齡，體重（260±10）g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2019-0014。動(dòng)物在溫度（23±1）℃、濕度（50±5）%、12 h光照/12 h黑暗條件下自由飲水?dāng)z食，暫養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合3R原則，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核并通過(guò)，倫理審批號(hào)為2018-0012。

2 主要試劑及儀器

HSYA凍干粉（成都康邦生物科技有限公司；批號(hào)：160301；規(guī)格：每支50 mg；純度89.5%）；Sirt1抑制劑selisistat（MedChemExpress）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialde‐hyde，MDA）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione per‐oxidase，GSH-Px）檢測(cè)試劑盒（碧云天生物科技公司）；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；抗Sirt1、FOXO1及乙酰 化FOXO1（acetylated FOXO1，Ac-FOXO1）抗 體（Abcam）。凝膠成像儀（型號(hào)：4351104，賽默飛世爾科技公司）。

3 主要方法

3.1 實(shí)驗(yàn)造模與給藥 96只大鼠隨機(jī)分為4組：假 手 術(shù)（sham）組、模 型（model）組、HSYA組 和HSYA+Sirt1抑制劑（HSYA+Sirt 1 inhibitor）組，每組24只。大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食但不禁水6 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg），除假手術(shù)組外，其余各組參考文獻(xiàn)［7］建立HIRI大鼠模型：大鼠固定在鼠板上，腹部朝上，腹部備皮消毒，取腹部正中切口暴露出劍突，分離肝臟左葉和中葉血管并用血管夾夾閉血管，缺血面積約占肝的70%，夾閉1 h后，去掉血管夾，恢復(fù)灌注，逐層縫合腹腔，并經(jīng)腹腔注射1×107U/L青霉素防止感染。假手術(shù)組除不用血管夾夾閉血管外，其余步驟相同。術(shù)后大鼠放在熱毯上復(fù)蘇。

HSYA凍干粉以生理鹽水配制成0.5 g/L HSYA溶液備用。HSYA組在血管夾夾閉血管前24、48和72 h尾靜脈注射5 mg/kg HSYA（實(shí)驗(yàn)劑量根據(jù)參考文獻(xiàn)4和5并做預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索）；HSYA+Sirt1抑制劑組在注射HSYA 72 h前采用0.01 mg/kg Sirt1抑制劑selisistat灌胃，然后尾靜脈注射5 mg/kg HSYA，假手術(shù)組和模型組于相同時(shí)點(diǎn)灌胃和注射等體積生理鹽水。

3.2 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能指標(biāo)［8］分別在再灌注1、3和6 h隨機(jī)選8只大鼠經(jīng)尾靜脈采血，室溫靜置2 h，2 500×g離心10 min，取上清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ala‐nine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）和乳酸脫氫酶（lac‐tate dehydrogenase，LDH）活性。

3.3 試劑盒檢測(cè)血清中SOD、MDA和GSH-Px水平［9］取每組大鼠血清，參考試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清中SOD活性、MDA含量和GSH-Px活性。

3.4 HE染色觀察大鼠肝組織病理學(xué)變化［8］尾靜脈采血后立即處死大鼠，取部分肝組織于4%多聚甲醛中固定，另取部分肝組織置于?80℃冰箱保存。從4%多聚甲醛中取出肝組織，石蠟包埋，制成5μm厚的石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇脫水和蒸餾水清洗后，蘇木素染色、伊紅復(fù)染，經(jīng)二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察肝組織情況。

3.5 Western blot法檢測(cè)肝組織中Sirt1、FOXO1及Ac-FOXO1的蛋白水平［8］從?80℃冰箱中取肝組織，稱取30 mg，滅菌剪刀剪碎，添加400μL蛋白裂解液充分研磨，冰上裂解20 min，10 000×g離心20 min，取上清，BCA試劑盒測(cè)定肝組織蛋白總濃度。取30μg蛋白上樣，經(jīng)凝膠電泳、PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入Ⅰ抗［Sirt1抗體（1∶1 000）、FOXO1抗體（1∶2 000）、Ac-FOXO1抗體（1∶1 000）和GAPDH抗體（1∶5 000）］，4℃孵育過(guò)夜，加入Ⅱ抗室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色液顯色，凝膠成像儀拍照并進(jìn)行定量分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HSYA對(duì)大鼠血清中ALT、AST和LDH活性的影響

再灌注1 h，與假手術(shù)組相比，模型組和HSYA+Sirt1抑制劑組血清中ALT、AST和LDH活性及HSYA組血清中ALT和AST活性升高（P<0.05）；與模型組相比，HSYA組血清中ALT、AST和LDH活性及HSYA+Sirt1抑制劑組血清中AST活性降低（P<0.05）；與HSYA組相比，HSYA+Sirt1抑制劑組血清中ALT及AST活性升高（P<0.05）。再灌注3 h和6 h，與假手術(shù)組相比，模型組、HSYA組和HSYA+Sirt1抑制劑組血清中ALT、AST和LDH活性升高（P<0.05）；與模型組相比，HSYA組和HSYA+Sirt1抑制劑組血清中ALT、AST和LDH活性降低（P<0.05）；與HSYA組相比，HSYA+Sirt1抑制劑組血清中ALT、AST和LDH活性升高（P<0.05）。見(jiàn)圖1。

與再灌注1 h相比，再灌注3 h模型組和HSYA+Sirt1抑制劑組血清中ALT、AST和LDH活性及HSYA組血清中AST和LDH活性升高（P<0.05）；再灌注6 h假手術(shù)組、模型組、HSYA組和HSYA+Sirt1抑制劑組血清中ALT、AST和LDH活性升高（P<0.05）。與再灌注3 h相比，再灌注6 h假手術(shù)組血清中AST活性，模型組、HSYA組和HSYA+Sirt1抑制劑組血清中ALT和LDH活性升高（P<0.05）。見(jiàn)圖1。

2 HSYA對(duì)大鼠血清中SOD和GSH-Px活性及MDA含量的影響

再灌注1 h和3 h，與假手術(shù)組相比，模型組、HSYA組和HSYA+Sirt1抑制劑組血清中SOD和GSH-Px活性降低，MDA含量升高（P<0.05）；與模型組相比，HSYA組和HSYA+Sirt1抑制劑組血清中SOD和GSH-Px活性升高，MDA含量降低（P<0.05）；與HSYA組相比，HSYA+Sirt1抑制劑組血清中SOD和GSH-Px活性降低，MDA含量升高（P<0.05）。再灌注6 h，與假手術(shù)組相比，模型組、HSYA組和HSYA+Sirt1抑制劑組血清中SOD活性降低，MDA含量升高，模型組和HSYA+Sirt1抑制劑組血清中GSHPx活性降低（P<0.05）；與模型組相比，HSYA組和HSYA+sirt1抑制劑組血清中SOD和GSH-Px活性升高，MDA含量降低（P<0.05）；與HSYA組相比，HSYA+Sirt1抑制劑組血清中SOD和GSH-Px活性降低，MDA含量升高（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

Figure 1.The activity of ALT，ASTand LDH in serum at 1，3 and 6 h after ischemia-reperfusion.A：the activity of ALT；B：the ac‐tivity of AST；C：the activity of LDH.Mean±SD.n=8.*P<0.05 vs sham group；△P<0.05 vs model group；▲P<0.05 vs HSYA group；#P<0.05 vs reperfusion 1 h；&P<0.05 vs reperfusion 3 h.圖1 缺血再灌注1、3和6 h血清中ALT、AST和LDH的活性情況

與再灌注1 h相比，再灌注3 h模型組血清中MDA含量升高，假手術(shù)組、HSYA組和HSYA+Sirt1抑制劑組血清中GSH-Px活性降低（P<0.05）；再灌注6 h模型組、HSYA組和HSYA+Sirt1抑制劑組血清中SOD和GSH-Px活性降低，MDA含量升高，假手術(shù)組血清中SOD和GSH-Px活性降低（P<0.05）。與再灌注3 h相比，再灌注6 h假手術(shù)組血清中SOD活性降低，假手術(shù)組和模型組血清中SOD和GSH-Px活性降低，模型組、HSYA組和HSYA+Sirt1抑制劑組血清中MDA含量升高（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

3 HSYA對(duì)大鼠肝組織病理形態(tài)的影響

假手術(shù)組肝組織形態(tài)正常、質(zhì)地均勻，肝細(xì)胞胞核大小均一且染色均勻；模型組在肝缺血再灌注1、3和6 h，出現(xiàn)嚴(yán)重病理性充血，細(xì)胞質(zhì)空泡化、肝細(xì)胞壞死和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加；HSYA組在肝缺血再灌注，出現(xiàn)少量的肝細(xì)胞壞死，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)但不明顯；HSYA+Sirt1抑制劑組在肝缺血再灌注1、3和6 h，隨著時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞質(zhì)空泡化現(xiàn)象嚴(yán)重，肝細(xì)胞壞死，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)但不明顯，見(jiàn)圖3。

4 HSYA對(duì)大鼠肝組織中Sirt1、FOXO1和Ac-FOXO1蛋白表達(dá)的影響

Figure 2.The levels of SOD，MDA and GSH-Px in serum at 1，3 and 6 h after ischemia-reperfusion.A：SODactivity；B：MDA con‐tent；C：GSH-Px activity.Mean±SD.n=8.*P<0.05 vs sham group；△P<0.05 vs model group；▲P<0.05 vs HSYA group；#P<0.05 vs reperfusion 1 h；&P<0.05 vs reperfusion 3 h.圖2 缺血再灌注1、3和6 h血清中SOD、MDA和GSH-Px水平的變化

Figure 3.The liver tissue morphology of 1，3 and 6 h after ischemia-reperfusion（HEstaining）.The scale bar=250μm.圖3 缺血再灌注1、3和6 h肝組織病理形態(tài)變化

再灌注1 h，與假手術(shù)組相比，模型組和HSYA+Sirt1抑制劑組肝組織中Sirt1和Ac-FOXO1/FOXO1蛋白水平及HSYA組肝組織中Sirt1蛋白水平降低（P<0.05）；與模型組相比，HSYA組肝組織中Sirt1和Ac-FOXO1/FOXO1蛋白水平升高（P<0.05）；與HSYA組相比，HSYA+Sirt1抑制劑組肝組織中Sirt1和Ac-FOXO1/FOXO1蛋白水平降低（P<0.05）。再灌注3 h，與假手術(shù)組相比，模型組和HSYA+Sirt1抑制劑組肝組織中Sirt1和Ac-FOXO1/FOXO1蛋白水平及HSYA組肝組織中Sirt1蛋白水平降低（P<0.05）；與模型組相比，HSYA組和HSYA+Sirt1抑制劑組肝組織中Sirt1和Ac-FOXO1/FOXO1蛋白水平升高（P<0.05）；與HSYA組相比，HSYA+Sirt1抑制劑組肝組織中Sirt1和Ac-FOXO1/FOXO1蛋白水平降低（P<0.05）。再灌注6 h，與假手術(shù)組相比，模型組、HSYA組和HSYA+Sirt1抑制劑組肝組織中Sirt1和Ac-FOXO1/FOXO1蛋白水平降低（P<0.05）；與模型組相比，HSYA組和HSYA+Sirt1抑制劑組肝組織中Sirt1和Ac-FOXO1/FOXO1蛋白水平升高（P<0.05）；與HSYA組相比，HSYA+Sirt1抑制劑組肝組織中Sirt1和Ac-FOXO1/FOXO1蛋白水平降低（P<0.05）。再灌注1、3和6 h，F(xiàn)OXO1蛋白水平在各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖4。

與再灌注1 h相比，再灌注3 h后HSYA+Sirt1抑制劑組肝組織中Sirt1和FOXO1/Ac-FOXO1水平，以及模型組和HSYA組肝組織中Sirt1蛋白水平升高（P<0.05），HSYA組和HSYA+Sirt1抑制劑組肝組織FOXO1蛋白水平降低（P<0.05）；再灌注6 h假手術(shù)組肝組織中Sirt1、FOXO1和FOXO1/Ac-FOXO1蛋白水平，HSYA組和HSYA+Sirt1抑制劑組肝組織中Sirt1和FOXO1/Ac-FOXO1蛋白水平，以及模型組肝組織中Sirt1蛋白水平升高（P<0.05）。與再灌注3 h相比，再灌注6 h假手術(shù)組、HSYA組和HSYA+Sirt1抑制劑組肝組織中Sirt1、FOXO1和FOXO1/Ac-FOXO1蛋白水平，以及模型組肝組織中Sirt1和FOXO1蛋白水平升高（P<0.05）。見(jiàn)圖4。

討 論

肝臟受到創(chuàng)傷后治療時(shí)易出現(xiàn)HIRI，此時(shí)肝細(xì)胞內(nèi)線粒體等功能遭到破壞，釋放出大量酶，如ALT、AST和LDH等，這些酶類的水平是肝損傷嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)［10］。紅花作為活血化瘀類藥物，研究發(fā)現(xiàn)其主要成分為HSYA［11］，在缺血再灌注的治療中具有抑制細(xì)胞凋亡、增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性等功效，從而緩解缺血再灌注損傷。本研究建立HIRI大鼠模型，可見(jiàn)HIRI大鼠肝組織出現(xiàn)明顯損傷，炎癥和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，肝細(xì)胞壞死嚴(yán)重，經(jīng)HSYA預(yù)處理的HIRI大鼠炎癥和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、肝細(xì)胞壞死及細(xì)胞質(zhì)空泡現(xiàn)象均得到明顯改善，且能降低血清中肝功能指標(biāo)，提示經(jīng)HSYA預(yù)處理后大鼠的肝功能損傷情況得到明顯緩解，具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

在HIRI中，SOD、MDA和GSH-Px已經(jīng)成為反映機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)，SOD活性升高能夠減輕肝損傷，MDA含量能夠反映肝損傷情況，GSH-Px可反映機(jī)體抗氧化能力［12］。Sirt1在氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和代謝調(diào)控等病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而這種生物學(xué)功能的實(shí)現(xiàn)需FOXO等發(fā)揮作用［13］，Sirt1可以調(diào)控FOXO1蛋白去乙酰化作用，從而減輕缺血再灌注損傷［14］。在腦缺血再灌注中激活Sirt1/FOXO1通路可以降低活性氧水平、增加GSH-Px和SOD水平，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腦缺血再灌注的緩解［15］。在本研究中，HIRI肝組織中Sirt1蛋白水平降低，對(duì)FOXO1的去乙?；饔脺p弱，血清中SOD和GSH-Px活性降低，MDA含量升高，機(jī)體損傷嚴(yán)重，SOD對(duì)機(jī)體氧化損傷的修復(fù)和GSH-Px對(duì)機(jī)體過(guò)氧化氫的分解作用減弱，過(guò)氧化物代謝加劇，從而導(dǎo)致機(jī)體抗氧化能力降低，氧化應(yīng)激作用加強(qiáng)，損傷嚴(yán)重。HSYA預(yù)處理后，肝組織中Sirt1蛋白水平升高，促進(jìn)FOXO1去乙?；現(xiàn)OXO1乙?；山档瓦^(guò)氧化物產(chǎn)物含量、升高抗氧化酶活性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)肝損傷的緩解；在HSYA預(yù)處理同時(shí)添加Sirt1抑制劑，各個(gè)指標(biāo)向模型組水平靠攏，提示HSYA通過(guò)激活Sirt1從而實(shí)現(xiàn)對(duì)FOXO1的乙?；饔眉訌?qiáng)，促進(jìn)機(jī)體抗氧化能力增強(qiáng)、氧化產(chǎn)物水平降低，實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體氧化損傷的保護(hù)作用。

本研究檢測(cè)HIRI 1、3和6 h時(shí)各指標(biāo)水平的變化，結(jié)果顯示在該段時(shí)間內(nèi)隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，血清中ALT、AST和LDH活性及MDA含量升高，SOD和GSH-Px活性降低。研究發(fā)現(xiàn)，早期HIRI損傷在再灌注2 h內(nèi)，主要代謝是氧化應(yīng)激發(fā)揮作用；中期HIRI損傷在再灌注2～6 h，與炎癥介質(zhì)等關(guān)系密切［16］。在缺血預(yù)處理這一過(guò)程中，機(jī)體氧化應(yīng)激現(xiàn)象明顯，機(jī)體損傷明顯，疾病加重。但肝組織中Sirt1和Ac-FOXO1/FOXO1蛋白水平?jīng)]有降低，提示HSYA預(yù)處理后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不會(huì)降低對(duì)Sirt1增加的水平，穩(wěn)定性較強(qiáng)。

綜上所述，HSYA預(yù)處理在HIRI損傷早、中期中可以通過(guò)激活Sirt1/FOXO1通路實(shí)現(xiàn)對(duì)氧化應(yīng)激的緩解，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)穩(wěn)定性較強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)HIRI的保護(hù)作用。但本項(xiàng)工作尚未研究在HIRI后期對(duì)疾病的影響，后續(xù)可根據(jù)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步研究其對(duì)HIRI的影響。

Figure 4.The effect of ischemia-reperfusion injury on Sirt1，F(xiàn)OXO1 and Ac-FOXO1 protein levels in liver tissue.Mean±SD.n=8.*P<0.05 vs sham group；△P<0.05 vs model group；▲P<0.05 vs HSYA group；#P<0.05 vs reperfusion 1 h group；&P<0.05 vs reperfusion 3 h group.圖4 缺血再灌注損傷對(duì)肝組織中Sirt1、FOXO1和Ac-FOXO1蛋白水平的影響