順鉑通過ROS介導(dǎo)ClC-3上調(diào)誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡*

徐培聲，林嘉偉，俞美聲，譚秋嬋，朱林燕，彭 爽，陳麗新，王 亮 王立偉△

（暨南大學(xué)基礎(chǔ)與公共衛(wèi)生學(xué)院1生理學(xué)系，3藥理學(xué)系，4病理生理學(xué)系，廣東廣州510632；2佛山市第一人民醫(yī)院，廣東佛山528000；5暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，廣東廣州510632；6廣州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院生理學(xué)系，廣東廣州510180）

鼻咽癌是一種發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的上皮癌，集中發(fā)病于我國(guó)廣東、廣西等南部地區(qū)。使用順鉑（cisplatin，Cisp）化療的同時(shí)進(jìn)行放療是常用的治療晚期鼻咽癌手段之一［1］。然而順鉑的作用機(jī)制尚不十分明確。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，順鉑可激活低分化鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞氯電流［2］，ClC-3氯通道參與了雙氫青蒿素和唑來膦酸所誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞凋亡［3-4］。文獻(xiàn)報(bào)道，活性氧（reactive oxygen species，ROS）對(duì)氯通道發(fā)揮其生物學(xué)功能特性具有一定作用［5］。而ClC-3氯通道和ROS在順鉑誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制，目前還不清楚。本文主要探討ClC-3氯通道是否參與順鉑誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞凋亡，以及ROS在其中所發(fā)揮的作用，為探討氯離子通道在抗腫瘤中的作用提供更多的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 細(xì)胞株

本實(shí)驗(yàn)所用的人低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z由廣東醫(yī)科大學(xué)唐慰萍教授惠贈(zèng)。

2 主要試劑

5-二苯基溴化四氮唑噻唑藍(lán)［3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromide，MTT］、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、4，4'-二異硫氰酸基-2，2'-二苯乙烯磺酸二鈉（4，4'-Diisothiothiocy‐anatostilbene-2，2'-disulfonic acid disodium salt hy‐drate，DIDS）與N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-cys‐teine，L-NAC）購(gòu)于Sigma；順鉑購(gòu)自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，使用前用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至所需濃度；RPMI-1640培養(yǎng)基與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染專用培養(yǎng)液購(gòu)于Gib‐co；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)于Biologi‐cal Industries；活性氧檢測(cè)試劑盒與RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)于碧云天公司；ClC-3抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology；GAPDH抗體購(gòu)于Proteintech；山羊抗兔辣根過氧化物酶IgG（H+L）購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；siRNA購(gòu)于吉瑪；Annexin VFITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)于凱基生物。DIDS溶解于DMSO中，配制成50 mmol/L的儲(chǔ)存液，實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋成100μmol/L的工作溶液。L-NAC用PBS溶解，配制成100 mmol/L的儲(chǔ)存液，實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋成1 mmol/L的工作溶液。

3 主要方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用于CNE-2Z細(xì)胞培養(yǎng)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基內(nèi)含有10%FBS、1×105U/L的青霉素以及100 mg/L的鏈霉素。細(xì)胞在37℃、濕度飽和的5%CO2細(xì)胞孵育箱內(nèi)培養(yǎng)生長(zhǎng)。每48 h進(jìn)行傳代。

3.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 把處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的CNE-2Z細(xì)胞以每孔約7×103接種于96孔板，設(shè)6個(gè)復(fù)孔。待其貼壁，更換含有不同濃度順鉑（0.625～160μmol/L）的完全培養(yǎng)基，37℃下分別培養(yǎng)24 h和48 h后，每孔加入15μL的MTT，37℃培育4 h。棄除培養(yǎng)基，每孔加入150μL的DMSO，振蕩孔板，37℃孵育10 min，以充分溶解結(jié)晶。在酶標(biāo)儀上測(cè)定480 nm波長(zhǎng)處吸光度（A）值，以空白組調(diào)零，對(duì)比對(duì)照組，得到實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的存活率，用GraphPad Prism 8軟件計(jì)算順鉑24 h和48 h的IC50值。

3.3 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率CNE-2Z細(xì)胞以每孔約1.5×105接種于6孔板，待其貼壁，更換為含5μmol/L和10μmol/L順鉑的完全培養(yǎng)基，37℃下分別培養(yǎng)24 h和48 h。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化收集處理后，PBS洗滌細(xì)胞2次，用低速冷凍離心機(jī)以2 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞。去除PBS，先加入200μL的Binding Buffer重新懸浮細(xì)胞，再分別加入2μL的Annexin V-FITC和PI混勻。室溫避光，讓其反應(yīng)5～15 min后，在流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè)凋亡。

3.4 細(xì)胞ROS檢測(cè) 消化收集細(xì)胞，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗后，加入以1∶1 000稀釋熒光探針DCFH-DA的無血清培養(yǎng)基，37℃避光孵育30 min，重復(fù)清洗。用多功能微孔板檢測(cè)儀設(shè)置488 nm的激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm的發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行DCF連續(xù)實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度檢測(cè)，每分鐘收集一個(gè)數(shù)據(jù)。另外，用ROS檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ROS含量，各步驟按照生產(chǎn)廠家說明進(jìn)行，在流式細(xì)胞儀進(jìn)行ROS檢測(cè)。

3.5 轉(zhuǎn)染ClC-3 siRNA 細(xì)胞種板貼壁后，將轉(zhuǎn)染試劑放置常溫，使用前輕輕晃勻。用無血清和抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋轉(zhuǎn)染試劑Lipofectami‐neTM2000和待轉(zhuǎn)染的siRNA至合適體積，將二者混勻成轉(zhuǎn)染復(fù)合體，室溫靜置5 min。用無血清培養(yǎng)液洗孔板中的細(xì)胞2～3次，在每孔加入2 mL培養(yǎng)液，把siRNA和轉(zhuǎn)染試劑形成的轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻地加入6孔板內(nèi)，每孔400μL，6 h后更換為含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后完成轉(zhuǎn)染。除ClC-3 siRNA轉(zhuǎn)染組外，另外設(shè)置陰性對(duì)照（negative control，NC）siRNA組。ClC-3 siRNA正義鏈為5'-CAAUGGAUUUCCU‐GUCAUATT-3'，反義鏈為5'-UAUGACAGGAAAUC‐CAUUGTA-3'；NC siRNA正 義 鏈 為5'-UUCUCC‐GAACGUGUCACGUTT-3'，反 義 鏈 為5'-ACGUGA‐CACGUUCGGAGAATT-3'。

3.6 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集CNE-2Z細(xì)胞，PBS洗凈后加入合適的RIPA細(xì)胞裂解液，4℃冰上裂解30 min，再用高速冷凍離心機(jī)以12 000 r/min離心15 min。提取上清的蛋白溶液，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。制備10%的SDS-PAG，加入樣品蛋白后，首先80 V電泳至Marker彼此分開，然后轉(zhuǎn)換成120 V。其次把蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h。再以1∶800稀釋的ClC-3Ⅰ抗，4℃過夜孵育，TBST洗滌后，以1∶3 000稀釋的山羊抗兔辣根過氧化物酶IgG常溫孵育2 h。最后洗凈PVDF膜，利用凝膠成像系統(tǒng)顯影，采用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行圖像分析，測(cè)定灰度值。以GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算相對(duì)比值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。用單因素方差分析（one-way ANO‐VA）檢驗(yàn)均數(shù)差異顯著性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 氯通道阻斷劑抑制順鉑誘導(dǎo)的CNE-2Z細(xì)胞凋亡

如圖1A所示，順鉑抑制CNE-2Z細(xì)胞生長(zhǎng)，隨著順鉑的濃度增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活力逐漸降低，24 h和48 h時(shí)的IC50值分別為11.76μmol/L和5.05μmol/L。凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1B所示，5μmol/L順鉑組24 h和48 h凋亡率分別為（16.49±2.37）%和（42.27±4.83）%；10μmol/L順鉑組24 h和48 h凋亡率分別為（44.68±4.80）%和（84.98±5.19）%。表明順鉑誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞的凋亡作用存在時(shí)間和濃度依賴性。

為了探討氯通道在順鉑誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞凋亡中的作用，我們觀察了氯通道阻斷劑DIDS對(duì)順鉑誘導(dǎo)的凋亡的影響。結(jié)果顯示，氯通道阻斷劑DIDS（100μmol/L）可顯著抑制順鉑誘導(dǎo)的CNE-2Z細(xì)胞凋亡，如圖1C所示，DIDS+Cisp組24 h細(xì)胞凋亡率為（29.69±3.57）%，與Cisp組凋亡率（40.36±3.14）%相比，凋亡率顯著降低（P<0.05）。兩組細(xì)胞48 h的凋亡率分別為（86.93±5.85）%和（41.29±5.71）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與對(duì)照（control，Ctrl）組相比，DIDS組的細(xì)胞凋亡率沒有明顯改變（P>0.05）。以上結(jié)果表明，氯通道阻斷劑可抑制順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提示氯通道在一定程度上參與了順鉑誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞的凋亡。

2 下調(diào)ClC-3蛋白表達(dá)可抑制順鉑誘導(dǎo)的CNE-2Z細(xì)胞凋亡

為進(jìn)一步研究參與順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的氯通道類型，我們觀察了順鉑作用后ClC-3氯通道表達(dá)的變化。結(jié)果如圖2A所示，順鉑可促進(jìn)ClC-3蛋白的表達(dá)，與對(duì)照組相比，差異有顯著性（P<0.05）。我們進(jìn)一步用ClC-3 siRNA下調(diào)細(xì)胞ClC-3的表達(dá)，觀察細(xì)胞凋亡的變化。由圖2B可以看出，ClC-3 siRNA可顯著下調(diào)ClC-3表達(dá)（P<0.01）。與Cisp組相比，ClC-3 siRNA+Cisp組凋亡率下降，順鉑作用細(xì)胞24 h的時(shí)候凋亡抑制率為32%（P<0.01），見圖2C。結(jié)果提示ClC-3氯通道參與了順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

3順鉑誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞ROS升高和細(xì)胞凋亡

為了研究ROS在順鉑誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞凋亡中的作用，我們用多功能微孔板檢測(cè)儀實(shí)時(shí)檢測(cè)了順鉑對(duì)ROS的影響，結(jié)果如圖3A所示，順鉑作用后在很短暫時(shí)間內(nèi)就誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞產(chǎn)生ROS，作用30 min左右時(shí)ROS比加藥前提高約65%（P<0.01），達(dá)到一個(gè)較穩(wěn)定的水平。氯通道阻斷劑DIDS對(duì)順鉑誘導(dǎo)的ROS提高沒有影響。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明，抗氧化劑L-NAC（1 mmol/L）幾乎完全抑制順鉑所致的ROS升高（圖3B），并且使細(xì)胞細(xì)胞凋亡率從（43.53±3.15）%明 顯 下 調(diào) 至（18.57±2.57）%（P<0.01），見圖3C。上述結(jié)果提示，順鉑通過刺激CNE-2Z細(xì)胞生成ROS而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

4 ROS、ClC-3與細(xì)胞凋亡

在上述結(jié)果基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步探討ROS、ClC-3在順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的相關(guān)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用抗氧化劑L-NAC抑制細(xì)胞產(chǎn)生ROS后，順鉑誘導(dǎo)的ClC-3蛋白表達(dá)被抑制（圖4A）。10μmol/L順鉑作用細(xì)胞24 h后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的ROS水平，結(jié)果顯示，ClC-3 siRNA+Cisp組的ROS水平與順鉑組相比無顯著性差異（P>0.05），ClC-3 siRNA組和無序siRNA組之間ROS水平也無顯著性差異（P>0.05），表明下調(diào)ClC-3蛋白表達(dá)水平不影響ROS水平，提示ROS在ClC-3的上游發(fā)揮作用。以上結(jié)果提示，ROS調(diào)控ClC-3介導(dǎo)的順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

討 論

Figure 1.Cisplatin-induced apoptosis of CNE-2Z cells was inhibited by chloride channel blockers（DIDS）.MTT assay was used to determine the viability of cells treated with cisplatin.A：viability curve after treatment with cisplatin for 24 h and 48 h；B：the apoptosis induced by cisplatin was detected by Annexin V-FITC/PI double staining assay；C：the inhibitory effects of the chloride channel blocker，DIDS（100μmol/L），on cisplatin-induced apoptosis for 24 h and 48 h.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs control group；#P<0.05 vs Cisp group.圖1 氯通道阻斷劑DIDS抑制順鉑誘導(dǎo)的CNE-2Z細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡異常在腫瘤以及許多疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。多種抗腫瘤藥物通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而起到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。凋亡誘導(dǎo)劑可激活細(xì)胞膜氯通道，伴隨水的外流而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡性容積減小，促發(fā)細(xì)胞凋亡［6-8］。氯通道是機(jī)體體內(nèi)最常見的陰離子通道，介導(dǎo)細(xì)胞膜內(nèi)外氯離子及其他多種陰離子的流動(dòng)，廣泛參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、自噬以及細(xì)胞器酸化等多種細(xì)胞生理過程。我們前文報(bào)道，紫杉醇和阿霉素可能通過激活氯通道而發(fā)揮抗腫瘤作用［9-10］。順鉑是一種常用的化療藥物，順鉑可以激活氯電流，該電流對(duì)容積變化敏感［11］。氯通道的類型較多，參與順鉑抗腫瘤作用的氯通道類型及其作用機(jī)制目前尚不清楚，本文探討了ClC-3氯通道在順鉑誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞凋亡中的作用。

Figure 2.Inhibition of ClC-3 protein expression suppressed the apoptosis induced by cisplatin.A：the representative band of ClC-3 and control protein（GAPDH）after treatment with cisplatin for 24 h and the intensity ratio of ClC-3 band to the standard band GAPDH；B：ClC-3 expression after treatment with negative siRNA and ClC-3 siRNA；C：down regulating ClC-3 in‐hibited cisplatin-induced apoptosis.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs 0μmol/L group；△△P<0.01 vs Ctrl group；##P<0.01 vs Cisp group.圖2 抑制ClC-3蛋白表達(dá)可降低順鉑誘導(dǎo)的CNE-2Z細(xì)胞凋亡

本研究結(jié)果表明，順鉑時(shí)間和濃度依賴性抑制CNE-2Z細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，該作用可被氯通道阻斷劑所抑制，表明氯通道參與了順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。氯通道有多種類型，包括囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)器（CFTR）、電壓門控氯通道（ClC）、細(xì)胞容積調(diào)節(jié)性氯通道（VRAC）以及配體門控性氯通道。ClC-3是ClC電壓門控氯通道家族的一員。ClC-3氯通道由CLCN3基因編碼［12］，廣泛分布在各種器官與細(xì)胞中［13-14］，尤其在腫瘤細(xì)胞中具有較高活性［15］。ClC-3在質(zhì)膜、細(xì)胞核和細(xì)胞器上都有表達(dá)，在細(xì)胞的增殖、遷移和耐藥等中起重要作用［16-18］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，ClC-3可能是紫杉醇和蟾蜍二烯羥酸等多種抗腫瘤藥物作用的靶點(diǎn)之一，ClC-3的過表達(dá)是胃癌患者預(yù)后不佳的生物標(biāo)志，XRCC5調(diào)控ClC-3在胃癌中的表達(dá)和功能，ClC-3在胃癌中主要生物學(xué)功能是參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移，PI3K/Akt信號(hào)通路為其下游主要信號(hào)通路［19］。蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯激活細(xì)胞ClC-3氯通道，同時(shí)抑制PIK3/Akt/mTOR，導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡［20］。H2O2促進(jìn)原來不易進(jìn)入細(xì)胞的熒光染料進(jìn)入細(xì)胞，而氯通道阻斷劑可阻抑細(xì)胞攝取熒光染料［7］。文獻(xiàn)報(bào)道，抑制ClC-3表達(dá)對(duì)順鉑誘導(dǎo)的人卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥株SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用［21］，推測(cè)可能與該通道參與調(diào)節(jié)藥物跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，提高耐藥細(xì)胞內(nèi)藥物濃度和細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性有關(guān)?；熕幬镒仙即伎缮险{(diào)ClC-3蛋白的表達(dá)，參與細(xì)胞凋亡［9］。高糖在誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡的同時(shí)，ClC-3表達(dá)也上調(diào)［22］。ClC-3蛋白還參與CNE-2Z細(xì)胞的自噬［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，順鉑促進(jìn)CNE-2Z細(xì)胞ClC-3蛋白表達(dá)，ClC-3 siRNA下調(diào)細(xì)胞ClC-3的表達(dá)可使細(xì)胞凋亡率明顯下降，提示ClC-3可能是順鉑致凋亡作用的靶點(diǎn)之一。

Figure 3.The antioxidant L-NACsuppressed cisplatin-induced apoptosis.A：the levels of ROSunder different treatments.The level of ROSincreased after the stimulation with cisplatin.B：the antioxidant L-NACinhibited the Cisp-induced release of ROS.C：the inhibitory effect of L-NACon Cisp-induced apoptosis for 24 h.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs Ctrl group；##P<0.01 vs Cisp group.圖3 抗氧化劑L-NAC抑制順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制復(fù)雜，caspase途徑、p53、死亡結(jié)構(gòu)域家族、Bcl家族和三磷酸鳥苷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多條凋亡通路參與順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。順鉑還可通過增加細(xì)胞胞內(nèi)的氧化自由基提高其活性以及下調(diào)細(xì)胞中抗氧化酶類活性，從而對(duì)細(xì)胞造成氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本文結(jié)果顯示，無論用氯通道阻斷劑還是利用siRNA干擾ClC-3氯通道的表達(dá)，都只能部分抑制順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡效應(yīng)，表明除了氯通道以外，還存在其他的作用靶點(diǎn)參與順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

Figure 4.Cisplatin-induced ClC-3 protein expression was inhibited by L-NAC.A：the ClC-3 protein expression under different treat‐ments；B：the ROSlevel detected by flow cytometry under the indicated conditions.After treatment with cisplatin，the ROSlevel in CNE-2Z cells was significantly increased but had little change in cells which transfected with CLC-3 siRNA.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs Cisp group；##P<0.01 vs Ctrl group；△△P<0.01 vs NCsiRNA group；▲▲P<0.01 vs ClC-3 siRNA group.圖4 順鉑誘導(dǎo)的ClC-3蛋白表達(dá)上調(diào)被L-NAC抑制

高濃度的活性氧會(huì)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)并直接損傷細(xì)胞，觸發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡?；钚匝跖c氯通道有密切的關(guān)系，ROS在ClC-3內(nèi)部二硫鍵的形成和半胱氨酸硫代陰離子的修飾中發(fā)揮了重要作用，對(duì)ClC-3的表達(dá)和功能至關(guān)重要［24］。H2O2激活氯通道，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示活性氧可能是調(diào)控氯通道開放的重要因素［7］。活性氧能激活VSOR氯通道，引起調(diào)節(jié)性細(xì)胞容積回縮［25］?？谇击[狀細(xì)胞可以通過ROSAMPK通路而影響順鉑對(duì)細(xì)胞的自噬以及凋亡作用［26］，欖香烯能通過該途徑增強(qiáng)順鉑對(duì)膀胱癌細(xì)胞的凋亡作用［26］。唑來膦酸通過升高細(xì)胞內(nèi)ROS含量，激活氯電流，誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞發(fā)生凋亡［4］。LNAC是一種有效的抗氧化劑，具有干擾自由基生成和清除自由基的功能。我們前文報(bào)道［23］，鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞在無血清培養(yǎng)液處理下，產(chǎn)生活性氧ROS，并上調(diào)ClC-3蛋白表達(dá)。本研究結(jié)果表明，順鉑促使CNE-2Z細(xì)胞ROS升高和ClC-3蛋白表達(dá)上調(diào)，抗氧化劑L-NAC非常有效地阻斷這些作用，使細(xì)胞凋亡率明顯下降。而下調(diào)ClC-3表達(dá)水平并不能改變ROS的水平，以上結(jié)果提示，ROS可能在ClC-3的上游發(fā)揮作用，順鉑通過提升CNE-2Z細(xì)胞ROS水平，上調(diào)ClC-3氯通道蛋白而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。