慢性間歇性低氧模型大鼠的甲狀腺功能分析

田 慧，高 隆，王澤輝

（1. 榆林市第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，綏德 718000 ；2. 榆林市第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，榆林 719000；3. 延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，延安 716000）

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS）是一種病因不明的睡眠呼吸疾病，臨床表現(xiàn)為夜間睡眠打鼾伴呼吸暫停和白天嗜睡[1-2]。由于呼吸暫停引起反復(fù)發(fā)作的夜間低氧和高碳酸血癥，可導(dǎo)致高血壓、冠心病、糖尿病和腦血管疾病[3-4]，因此受到人們廣泛關(guān)注。慢性間歇性低氧（chronic intermittent hypoxia, CIH）是OSAHS的主要病理特征，其表現(xiàn)為睡眠中反復(fù)出現(xiàn)低氧情況，而且它也是OSAHS導(dǎo)致心腦血管并發(fā)癥的主要因素[5-6]。OSAHS和甲狀腺功能減退癥均為內(nèi)科常見的疾病，它們在體征和癥狀方面有很多相似的臨床表現(xiàn)，如：乏力、嗜睡、體質(zhì)量增加、情緒低落等[7-8]。甲狀腺、垂體等是高代謝器官，而OSAHS可造成組織缺氧，長此以往可能使這些組織器官（甲狀腺、垂體）功能下降或異常[9]。因此，進一步明確OSAHS與甲狀腺功能之間的關(guān)系顯得尤為重要。本實驗通過建立與OSAHS病理生理特征相似的CIH大鼠模型，檢測各組大鼠血清中促甲狀腺激素釋放激素（thyrotropin releasing hormone，TRH）、促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）、三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）和甲狀腺素（thyroxine，T4）的表達水平，同時觀察各組大鼠甲狀腺組織的病理變化和超微結(jié)構(gòu)變化，探討OSAHS與甲狀腺功能之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物飼養(yǎng)

30只SPF級雄性SD大鼠，7周齡，體質(zhì)量（200±20）g， 購自延安大學(xué)實驗動物中心[SCXK（陜）2019-0014]。大鼠適應(yīng)環(huán)境 [SYXK（陜）2019-0007] 2周后進行實驗，動物實驗經(jīng)本單位動物福利倫理委員會批準(zhǔn)（201902005）。

1.2 試劑和設(shè)備

TRH、TSH、T3和T4放射免疫分析試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所），HE染色試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司），甲苯胺藍染色試劑盒（北京華威銳科化工有限公司），電子分析天平（日本SHIMADZU公司），光學(xué)顯微鏡和Leica 2065切片機（德國Leica公司），Hitachi-7500電子顯微鏡（日本Hitachi公司），γ-放射免疫分析儀（眾成機電技術(shù)公司），動物低氧艙（上海塔望智能科技有限公司，型號：ProOx-810）。

1.3 動物分組和CIH模型制備

將30只SD大鼠隨機分為對照（control）組、CIH組和復(fù)氧（reoxygenation，RH）組，每組10只。CIH組和RH組大鼠每日9∶00～17∶00放入低氧艙內(nèi)。低氧艙內(nèi)循環(huán)，先輸入壓縮空氣30 s，后輸入氮氣30 s，以此循環(huán)[10]。實驗過程中注意檢測低氧艙內(nèi)的氧濃度，使艙內(nèi)氧濃度控制在體積分?jǐn)?shù)8%～21%。實驗過程中艙內(nèi)產(chǎn)生的二氧化碳和水蒸氣被生石灰和硅膠吸取。CIH組大鼠連續(xù)進行實驗4周，其余時間均正常飲食飲水；RH組連續(xù)進行低氧艙實驗4周后正常飼養(yǎng)4周（復(fù)氧），其余時間均正常飲食飲水；control組大鼠不予任何處理，正常飲食飲水4周。

1.4 大鼠灌注與取材

實驗結(jié)束后，大鼠經(jīng)腹腔麻醉后，將其四肢固定于解剖板上，并從頸靜脈抽血約5 mL，于4 ℃以3 000 r/min 離心15 min，吸取上層血清（其中TRH采血管中預(yù)先加入TRH 抗滅活劑硫酸8-羥基喹啉、Tween-20和乙二胺四乙酸二鈉），于－80 ℃冰箱保存。接著打開大鼠胸腔，由左心室插入靜脈針頭至升主動脈，剪開右心房，快速灌注4%多聚甲醛溶液，約30 min，至大鼠尾變硬。迅速解剖大鼠頸部肌肉，可看到甲狀軟骨和氣管，在甲狀軟骨和氣管環(huán)兩側(cè)可看到一對長橢圓形深紅褐色組織，即甲狀腺，輕輕摘除雙側(cè)甲狀腺組織，用干紗布吸水后迅速置于電子天平上稱重。甲狀腺組織經(jīng)戊二醛固定等步驟后制成切片，染色并攝影觀察。

1.5 放射免疫分析

將－80 ℃冰箱中的血清置于冰上進行溶解，待其溶解后按照試劑盒上的說明書進行操作，計算血清中TRH、TSH、T3和T4的含量。

1.6 HE染色

將甲狀腺組織用4%多聚甲醛溶液固定2～3h；然后對甲狀腺組織進行包埋，并切成4 μm切片；切片放入蘇木精染液中5 min，自來水清洗后，置于1%的鹽酸乙醇溶液分化數(shù)秒，并用流水沖洗。切片放入伊紅染液中染色3 min，流水清洗。之后切片置于梯度乙醇溶液（70%、80%、90%、100%）中脫水，各5min，再放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明，分別5min。將切片取出，用濾紙輕輕拭干切片上殘余的二甲苯，在組織上滴加中性樹膠封固，使用光學(xué)顯微鏡觀察并攝影。

1.7 甲苯胺藍染色

將甲狀腺組織用4%多聚甲醛溶液固定2～3 h；然后對甲狀腺組織進行包埋，并切成4 μm的切片；將切片用含30%乙醇的甲苯胺藍溶液染色30 min；用無水乙醇洗10 min；中性樹脂封固，光學(xué)顯微鏡下觀察并攝影。

1.8 電子顯微鏡觀察

將甲狀腺組織用戊二醛溶液固定2～3 h，漂洗后用 l%鋨酸溶液固定2 h，之后用丙酮溶液進行梯度脫水，甲狀腺組織塊包埋在電子顯微鏡標(biāo)本模板中，置烤箱內(nèi)加溫烘干，并切成厚片或半薄切片。將切片轉(zhuǎn)移到滴有蒸餾水的潔凈載玻片上，展平，等待其干燥后，用甲苯胺藍染劑染色，光學(xué)顯微鏡下定位，以確定觀察區(qū)域。接著制作超薄切片，并將超薄切片轉(zhuǎn)到有聚乙烯醇縮甲醛支持膜的銅載網(wǎng)上，將3%檸檬酸+0.1%醋酸鈾染色液滴于石蠟板上，把貼有切片的銅網(wǎng)放在石蠟板上，染色15 min，清水洗凈。使用Hitachi-7500電子顯微鏡攝影觀察。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CIH模型的鑒定

實驗過程中，CIH組和RH組大鼠分別在低氧艙內(nèi)氧最低濃度和氧最高濃度時，隨機對CIH組和RH組大鼠進行血氧飽和度和動脈血氣分析檢測，其血氧飽和度為70%～92%，動脈氧分壓為60.7～80.1 mmHg，接近OSAHS病理生理特點，提示CIH動物模型建立成功。

2.2 各組大鼠血清中TRH、TSH、T3和T4的含量

如表1所示，與control組比較，CIH組大鼠血清中TRH、TSH、T3和T4的表達水平明顯降低（均P＜0.05）；與CIH組比較，RH組大鼠血清中TRH、TSH、T3和T4的表達水平明顯升高（均P＜0.05）。

表 1 各組大鼠血清中TRH、TSH、T3和T4的含量Table 1 The serum levels of TRH, TSH, T3 and T4 in each group of rats( ± s, n=10)

表 1 各組大鼠血清中TRH、TSH、T3和T4的含量Table 1 The serum levels of TRH, TSH, T3 and T4 in each group of rats( ± s, n=10)

注：TRH為促甲狀腺激素釋放激素，TSH為促甲狀腺激素，T3為三碘甲狀腺原氨酸，T4為甲狀腺素。Control為對照組，CIH為慢性間歇性低氧組，RH為復(fù)氧組。與control組比較，*P<0.05；與CIH組比較，#P<0.05。

-1-1-1-1 組別 TRH/(μg·L) TSH/(μg·L) T3/(μg·L) T4/(μg·L)Control CIH RH 37.67±2.45 24.56±1.87*32.45±1.56#2.22±0.56 1.45±0.31*1.98±0.35#1.25±0.47 0.66±0.07*1.22±0.32#85.78±3.24 57.67±2.54*78.95±2.38#

2.3 各組大鼠甲狀腺質(zhì)量變化

與control組大鼠甲狀腺質(zhì)量[（43.67±1.56）g]比較，CIH組[（71.78±1.67）g]明顯增加（P＜0.01）；與CIH組大鼠甲狀腺質(zhì)量比較，RH組[（50.45±1.32）g]明顯減輕（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠甲狀腺組織的病理變化

HE染色結(jié)果（圖1）顯示，control組大鼠甲狀腺組織含有均質(zhì)嗜酸膠體的濾泡，并被具有中央核的簡單立方嗜堿性濾泡細胞排列；CIH組大鼠甲狀腺組織的正常濾泡結(jié)構(gòu)喪失，其中膠體耗盡，一些濾泡細胞出現(xiàn)空泡，基核較暗；RH組大鼠甲狀腺組織顯示正常濾泡結(jié)構(gòu)，但某些濾泡細胞仍呈空泡狀，膠體出現(xiàn)了變化。

2.5 各組大鼠甲狀腺組織中甲狀腺濾泡的變化

甲苯胺藍染色結(jié)果（圖2）表明，control組大鼠甲狀腺組織有完整的甲狀腺濾泡，內(nèi)襯濾泡細胞和輕濾泡旁細胞；CIH組大鼠甲狀腺顯示不規(guī)則甲狀腺濾泡，腔內(nèi)有脫落的濾泡和濾泡旁細胞；RH組大鼠甲狀腺組織表現(xiàn)出完整的甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)，但有些濾泡細胞仍顯示為空泡，并帶有深色核。

圖 1 HE染色觀察各組大鼠甲狀腺組織的病理變化（×100）Figure 1 HE staining to observe the pathological changes of thyroid tissue in each group of rats (×100)

圖 2 甲苯胺藍染色觀察各組大鼠甲狀腺的病理變化（×100）Figure 2 Toluidine blue staining to observe the pathological changes of thyroid in each group of rats (×100)

2.6 各組大鼠甲狀腺組織超微結(jié)構(gòu)的變化

電子顯微鏡檢查結(jié)果（圖3）表明，control組大鼠甲狀腺具有正常的濾泡細胞，濾泡細胞中具有常染色體、完整的溶酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；CIH組大鼠甲狀腺濾泡細胞出現(xiàn)細胞核收縮，異染色質(zhì)增加，基質(zhì)損失，線粒體空泡，溶酶體和脂質(zhì)滴增加；RH組大鼠甲狀腺顯示出或多或少完整的濾泡細胞結(jié)構(gòu)，其中有常染色體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體。

圖 3 電子顯微鏡觀察各組大鼠甲狀腺超微結(jié)構(gòu)變化（×5 000）Figure 3 Electron microscopy observation of the ultrastructural changes of the thyroid gland in each group of rats(×5 000)

3 討論

OSAHS是一種常見疾病，會導(dǎo)致呼吸中斷，吸氧時間減少（呼吸暫?；蚝粑蛔悖缓笤诨颊呷胨瘯r迅速進行重新充氧[11]。氧氣吸入的減少導(dǎo)致缺氧、高碳酸血癥和胸腔內(nèi)壓力降低[12]。在OSAHS期間，反復(fù)的低氧血癥和高碳酸血癥可能會導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，兒茶酚胺、內(nèi)皮素和腎素-血管緊張素系統(tǒng)紊亂，內(nèi)分泌功能障礙，以及血尿動力學(xué)改變[13]。OSASH與全身性疾病相關(guān)，包括高血壓、高脂血癥、冠狀動脈疾病、自身免疫性疾病和癌癥[14-15]。

甲狀腺功能減退是由多種原因引起的，其機制是甲狀腺激素合成及分泌減少，或其生理效應(yīng)不足所致機體代謝降低；按其病因分為原發(fā)性甲狀腺功能減退、繼發(fā)性甲狀腺功能減退及周圍性甲狀腺功能減退三類[16]。甲狀腺功能的調(diào)節(jié)是復(fù)雜的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)過程，受多種因素的影響。內(nèi)分泌系統(tǒng)直接由下丘腦調(diào)控，產(chǎn)生TRH，通過垂體門脈系統(tǒng)進入腺垂體，促使腺垂體釋放TSH，TSH可使甲狀腺釋放T4和T3。其中腺垂體除受到下丘腦的調(diào)節(jié)外，還受到甲狀腺激素的負反饋調(diào)節(jié)[17]。

研究發(fā)現(xiàn)，OSAHS患者血清中游離T3、游離T4水平均明顯下降[18]。本實驗結(jié)果表明，CIH組較control組的血清TRH、TSH、T3、T4水平降低，說明OSAHS可能會引起下丘腦受損，使TRH的分泌減少，從而使TSH（腺垂體分泌）的分泌減少，最終使T3和T4的分泌降低，引起甲狀腺功能減退癥狀。熊俊偉[19]研究表明，CIH可引起大鼠甲狀腺質(zhì)量增加，去除缺氧因素后甲狀腺質(zhì)量基本恢復(fù)正常。本研究中也對大鼠甲狀腺進行了稱量，發(fā)現(xiàn)CIH組大鼠甲狀腺質(zhì)量明顯增加，說明OSAHS對甲狀腺是有損傷作用的。從HE染色、甲苯胺藍染色和電子顯微鏡觀察結(jié)果可知，CIH組大鼠甲狀腺組織有一定程度的損傷；然而，進行4周復(fù)氧后RH組大鼠血清中TRH、TSH、T3、T4水平升高，甲狀腺質(zhì)量減輕，甲狀腺組織的損傷程度減小。

綜上所述，OSAHS對甲狀腺有一定的損傷作用，但是復(fù)氧可以減輕其損傷，因此在臨床上可以對OSAHS患者給予持續(xù)正壓通氣治療。在本實驗中沒有對下丘腦和垂體進行深入的研究，因此OSAHS的病理機制還有待進一步研究。