肖 攀，牛廷獻(xiàn)，羅曉紅，王紅義，郭曉宇，陸 璐，馮小明

（1. 聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050；2聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院內(nèi)分泌科，蘭州 730050）

我國(guó)高原地區(qū)急性重型高原病并發(fā)多臟器功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的發(fā)病率較高[1-2]。高原多臟器功能障礙綜合征（high altitude multiple organ dysfunction syndrome，H-MODS）在本質(zhì)上與平原地區(qū)發(fā)生的MODS沒(méi)有區(qū)別，但是受低氧等高原特殊環(huán)境的影響，H-MODS在病程及臨床發(fā)病特征方面具有一定的高原特異性，使其在臨床治療中顯得更為復(fù)雜和危險(xiǎn)[3]。本課題組前期采用具有高原特性的蕨麻豬成功建立了H-MODS動(dòng)物模型[4-6]，并發(fā)現(xiàn)促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）、皮質(zhì)酮（corticosterone，CORT）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 及低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）在H-MODS模型蕨麻豬的病程發(fā)展過(guò)程中發(fā)生明顯變化。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)多臟器損傷后，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）及C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）等炎性指標(biāo)的變化特點(diǎn)，以期了解H-MODS蕨麻豬模型發(fā)病過(guò)程中機(jī)體炎性反應(yīng)的變化特征。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

高原蕨麻豬24只，雌雄各半，體質(zhì)量為15 kg左右。所有蕨麻豬按雌雄各半隨機(jī)分為H-MODS蕨麻豬模型LPS高、中、低劑量組和對(duì)照組，每組6只。蕨麻豬為甘南地區(qū)散戶(hù)飼養(yǎng)（符合普通級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要求），檢測(cè)實(shí)驗(yàn)在本實(shí)驗(yàn)室[SYXK（軍）2017-0046]進(jìn)行，嚴(yán)格遵照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)福利倫理各項(xiàng)要求進(jìn)行操作。CRP檢測(cè)用ELISA試劑盒購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，IL-1β與TNF-α檢測(cè)用ELISA試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R＆D公司。氯胺酮（國(guó)藥準(zhǔn)字：H35020148）購(gòu)自福建古田藥業(yè)有限公司，地西泮注射液（國(guó)藥準(zhǔn)字：H12020957）購(gòu)自天津金耀氨基酸有限公司，LPS（血清型為O127: B8，批號(hào)為64H4010）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 H-MODS模型建立方法

建模方法參照文獻(xiàn)[4-7]。本實(shí)驗(yàn)在海拔3 500 m的甘南?？撇菰M(jìn)行，將豬運(yùn)到實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，待動(dòng)物狀態(tài)穩(wěn)定后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用氯胺酮（6 mg/kg）聯(lián)合安定（0.5 mg/kg）肌內(nèi)注射法進(jìn)行動(dòng)物麻醉，同時(shí)肌內(nèi)注射阿托品（0.05mg/kg）。動(dòng)物麻醉后經(jīng)耳緣靜脈泵入LPS，每組泵入時(shí)間均控制在30 min左右，低、中、高劑量組的泵入劑量分別為0.25 mg/kg（B組）、0.35 mg/kg（C組）和0.50 mg/kg（D組），對(duì)照組（A組）以等量的生理鹽水（即0.9%NaCl溶液）代替。經(jīng)過(guò)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用LPS高、中、低這3個(gè)劑量來(lái)誘導(dǎo)蕨麻豬多臟器損傷建立H-MODS模型，都可以引起蕨麻小型豬的生理生化指標(biāo)發(fā)生變化，同時(shí)中、高劑量組豬均出現(xiàn)死亡，提示3個(gè)劑量的LPS都可以成功建立H-MODS模型。

1.3 MODS的診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照胡森等[7]提出的動(dòng)物發(fā)生MODS時(shí)各個(gè)器官功能障礙分期診斷標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，在注射LPS后出現(xiàn)2個(gè)或2個(gè)以上器官或系統(tǒng)功能障礙時(shí)判定為MODS。

1.4 血清采集

3組豬分別于泵入LPS后0 h、3h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h，經(jīng)頸靜脈采血，分離血清，保存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 ELISA檢測(cè)指標(biāo)

IL-1β、TNF-α與CRP表達(dá)水平的檢測(cè)由本實(shí)驗(yàn)室按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作完成。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，各組間差異比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 炎性因子TNF-α的變化

靜脈泵入LPS后，B、C、D組TNF-α表達(dá)量急劇升高，在6 h時(shí)升至最高，之后逐漸下降；在3～12 h時(shí)B、C、D組與同組0 h和同時(shí)間點(diǎn)A組相比明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；24 h時(shí)B、D組與同組0 h和同時(shí)間點(diǎn)A組相比，均明顯升高（P＜0.05）；72h時(shí)B組明顯高于A組（P＜0.05）。TNF-α表達(dá)量情況與走勢(shì)詳見(jiàn)表1和圖1。

2.2 炎性因子IL-1β的變化

低、中、高劑量組在注入LPS后，IL-1β表達(dá)量均開(kāi)始上升，并在6 h時(shí)達(dá)到峰值；在3～12 h時(shí)B、C、D組與0 h和A組相比，其表達(dá)量均有明顯升高（P＜0.05或P＜0.01)；24 h時(shí)D組高于0h和A組（P＜0.05）。之后各組IL-1β表達(dá)量逐漸降低，在48 h、72 h時(shí)B、C、D組與0 h和A組相比，均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。從各劑量組的表達(dá)量來(lái)看，高劑量組的IL-1β表達(dá)水平高于低劑量組。IL-1β表達(dá)量情況與走勢(shì)詳見(jiàn)表1和圖1。

表 1 各組蕨麻豬給予LPS不同時(shí)點(diǎn)的TNF-α、IL-1β和CRP水平比較Table 1 Comparison of TNF-α, IL-1β and CRP levels at different time points in Juema pigs after different LPS infusion treatments( ± s, n=6)

表 1 各組蕨麻豬給予LPS不同時(shí)點(diǎn)的TNF-α、IL-1β和CRP水平比較Table 1 Comparison of TNF-α, IL-1β and CRP levels at different time points in Juema pigs after different LPS infusion treatments( ± s, n=6)

注：TNF-a即腫瘤壞死因子-a，IL-1b即白細(xì)胞介素-1b，CRP即C反應(yīng)蛋白。A為對(duì)照組，通過(guò)耳緣靜脈注入等量的生理鹽水；B～D分別為低、中、高劑量組，即分別經(jīng)耳緣靜脈泵入0.25mg/kg（B組）、0.35mg/kg（C組）、0.50mg/kg（D組）的脂多糖（LPS）。與對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與0h相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 0 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h 7 2 h TNF-α ρ/(pg·mL-1) A B C D IL-1β ρ/(pg·mL-1) A B C D CRP ρ/(μg·mL-1) A B C D 96.52±10.21 100.87±9.95 94.98±10.26 98.93±7.20 101.84±21.10 212.54±78.21**△△1 058.35±99.68**△△1 145.73±65.99**△△ 93.24±9.65 1 255.91±153.41**△△1 076.56±42.89**△△1 233.61±93.60**△△ 118.35±11.36 1 071.01±122.1**△△ 615.30±96.11*△ 681.92±103.46*△ 105.28±10.89 190.61±16.04*△ 117.68±14.40 156.35±17.20*△98.64±12.25 86.12±26.33 69.36±65.67 76.71±19.65 91.68±9.32 147.39±11.70*△128.56±13.34 133.66±32.08 66.25±21.41 60.43±6.49 57.32±4.05 65.71±11.24 59.14±16.32 187.59±16.34*△ 243.33±112.12**△△ 469.26±17.86**△△ 50.28±22.81 271.43±94.95**△△1 373.57±489.92**△△2 155.14±328.30**△△ 65.34±19.64 113.59±22.58*△ 542.14±261.27**△△ 936.43±57.58**△△ 58.23±28.25 42.14±17.17 80.71±52.22 90.48±19.20*△70.17±11.25 21.58±5.57*△△31.42±6.62*△14.28±8.08**△△ 63.58±31.35 22.37±8.35*△ 28.70±8.19*△ 16.43±5.91*△△ 11.23±2.52 12.38±4.51 10.91±2.26 14.23±3.96 13.78±3.45 19.26±3.84 18.48±4.01* 22.77±6.86△ 14.46±4.98 27.02±6.96*△ 28.69±3.56**△ 29.77±6.65*△ 15.49±2.47 35.44±5.21**△ 40.79±8.21*△△ 43.38±8.31**△ 10.33±3.64 41.93±8.11*△ 45.72±7.38**△△ 50.85±3.81**△△15.74±2.58 33.67±7.65*△42.22±4.49*△△53.08±5.50**△△ 12.11±4.14 29.32±4.77*△ 34.36±5.85*△ 40.46±6.35*△

2.3 CRP的變化

靜脈泵入LPS后，B、C、D組CRP表達(dá)量開(kāi)始升高，B、C組在24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大，D組在48 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大，之后各組表達(dá)量開(kāi)始逐漸下降；B組6～72 h時(shí)CRP表達(dá)量與0 h和A組相比，均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；C組6～72 h時(shí)CRP表達(dá)量與0 h和A組相比均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），其中3 h時(shí)CRP表達(dá)量與A組相比明顯升高（P＜0.05）；D組6～72 h時(shí)CRP表達(dá)量與0 h和A組相比明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），其中3 h時(shí)CRP表達(dá)量與0 h相比明顯升高（P＜0.05）。從各劑量組的表達(dá)量來(lái)看，高劑量組的CRP表達(dá)水平略高于低劑量組。CRP表達(dá)情況與走勢(shì)詳見(jiàn)表1和圖1。

3 討論

本研究通過(guò)LPS致蕨麻豬多臟器損傷而建立H-MODS模型，并在建立模型時(shí)選用高、中、低3個(gè)劑量。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高、中、低劑量的LPS均可引起蕨麻豬生理生化指標(biāo)的變化，且中、高劑量LPS可誘導(dǎo)蕨麻豬發(fā)生多臟器損傷[5]。目前，IL-1β、TNF-α與CRP已廣泛用來(lái)反映臨床疾病發(fā)生時(shí)的炎性反應(yīng)及病程變化程度[8-9]，并且這些指標(biāo)在全身炎性反應(yīng)及多臟器損傷疾病的診療中具有臨床指導(dǎo)意義[10-11]。因此，本研究進(jìn)一步利用蕨麻豬H-MODS模型，對(duì)蕨麻豬發(fā)生MODS時(shí)的炎性因子IL-1β、TNF-α與CRP進(jìn)行檢測(cè)，以期探討H-MODS發(fā)生、發(fā)展中炎性反應(yīng)的變化特點(diǎn)。

TNF-α由淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞分泌，是典型的促炎性因子，通過(guò)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)而參與炎性反應(yīng)[12]，導(dǎo)致組織細(xì)胞破壞。TNF-α可引起內(nèi)皮損傷，造成炎性反應(yīng)發(fā)生，同時(shí)可激活巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷性，對(duì)相關(guān)炎性因子有介導(dǎo)作用，從而引起器官組織的損傷[13]。IL-1是一種前炎性細(xì)胞因子，主要通過(guò)修飾基因達(dá)到對(duì)免疫炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。IL-1的基因結(jié)構(gòu)與其調(diào)節(jié)功能密切相關(guān)，并且內(nèi)皮損傷可刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放IL-1[14]。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠MODS模型也會(huì)引起TNF-α與IL-1β表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)[15-16]。本研究中TNF-α與IL-1β在LPS誘導(dǎo)MODS形成后表達(dá)量急劇升高，在6h時(shí)升至最高，之后逐漸下降。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量組蕨麻豬出現(xiàn)死亡；在蕨麻豬形成H-MODS時(shí)，其體內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重的應(yīng)激感染狀態(tài)；隨著炎性反應(yīng)逐漸增強(qiáng)，炎性因子TNF-α與IL-1β的表達(dá)也出現(xiàn)不同程度的上調(diào)；隨后機(jī)體進(jìn)入動(dòng)態(tài)免疫調(diào)節(jié)階段，抑制過(guò)度炎性反應(yīng)，維持機(jī)體的平衡；在6 h后TNF-α與IL-1β表達(dá)水平開(kāi)始慢慢降低，在72 h時(shí)IL-1β表達(dá)水平甚至低于對(duì)照組和0 h。以上結(jié)果提示，機(jī)體發(fā)生炎性反應(yīng)后出現(xiàn)免疫應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)迅速的免疫調(diào)節(jié)快速下調(diào)炎性因子表達(dá)。

CRP是由肝細(xì)胞分泌的一種非特異性生化標(biāo)志物的炎性因子，其表達(dá)量的增加與機(jī)體受到刺激引起的炎性反應(yīng)關(guān)系緊密。同時(shí)，CRP作為一種急性反應(yīng)蛋白能夠快速反映出機(jī)體的慢性或急性炎癥狀態(tài)[17]。CRP會(huì)激活單核細(xì)胞，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，促進(jìn)其他炎性因子的釋放，最終誘導(dǎo)多臟器損傷。當(dāng)機(jī)體受到外界LPS的作用時(shí)，多臟器出現(xiàn)不同程度的損傷，炎性反應(yīng)開(kāi)始加劇，CRP表達(dá)量就會(huì)迅速升高。此外，CRP能夠誘導(dǎo)氧自由基產(chǎn)生，因此在炎性反應(yīng)出現(xiàn)時(shí)IL-6、TNF-α等炎性因子開(kāi)始大量釋放；并且伴隨著炎性反應(yīng)的加劇，CRP還能夠誘導(dǎo)血小板激活，加重心肌組織、腎臟組織微循環(huán)障礙[18]，使得炎性反應(yīng)持續(xù)加劇。本研究發(fā)現(xiàn)，蕨麻豬泵入LPS誘導(dǎo)多臟器出現(xiàn)損傷時(shí)，低、高、中劑量組的CRP表達(dá)量開(kāi)始升高，并在6 h時(shí)與0 h和對(duì)照組相比明顯升高；各組均在24～48 h表達(dá)量達(dá)到最大，在72 h后才緩慢降低。

目前，臨床上廣泛采用CRP、TNF-α及IL-1等炎性因子來(lái)評(píng)價(jià)患者疾病感染情況以及臨床治療效果，這些炎性因子已經(jīng)成為臨床評(píng)價(jià)病情及治療效果的標(biāo)志之一[19-22]。本研究中蕨麻豬經(jīng)LPS誘導(dǎo)發(fā)生多臟器炎性反應(yīng)后，其TNF-α及IL-1β表達(dá)量在6 h達(dá)到最大，之后開(kāi)始快速降低，到48 h已經(jīng)接近恢復(fù)正常；而CRP在6 h時(shí)處于上升期，到48 h才達(dá)到頂峰，之后緩慢回落。由此可以看出，在LPS誘導(dǎo)蕨麻豬形成H-MODS時(shí)，炎性因子TNF-α及IL-1β在體內(nèi)表達(dá)量迅速上升再下降，相對(duì)而言，CRP的表達(dá)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)且變化比較緩慢，這可能是因?yàn)楦鱾€(gè)因子的分泌器官及場(chǎng)所不同。因此，在評(píng)價(jià)HMODS炎性反應(yīng)的發(fā)展變化時(shí)，應(yīng)該對(duì)病程隨時(shí)監(jiān)測(cè)，根據(jù)各檢測(cè)指標(biāo)的變化來(lái)評(píng)估炎性反應(yīng)的程度，以便及時(shí)調(diào)整治療方案。臨床研究顯示，膿毒癥患者與H-MODS患者的TNF-α及CRP具有相近的變化特點(diǎn)[23-24]。在H-MODS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，炎性反應(yīng)及免疫反應(yīng)貫穿整個(gè)疾病的發(fā)展始末，促炎細(xì)胞因子與抗炎細(xì)胞因子之間伴隨著免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)，最終取得平衡以達(dá)到內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，所以TNF-α及IL-1β炎性指標(biāo)的變化呈現(xiàn)迅速的拋物線(xiàn)形趨勢(shì)，這種變化趨勢(shì)使得機(jī)體的炎性反應(yīng)及時(shí)得到調(diào)整，不會(huì)出現(xiàn)過(guò)度抗炎性反應(yīng)及免疫功能抑制。本研究發(fā)現(xiàn)，蕨麻豬模型HMODS形成時(shí)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，炎性因子TNF-α、IL-1β表達(dá)迅速升高，這時(shí)免疫調(diào)節(jié)作用也迅速對(duì)炎性因子高表達(dá)進(jìn)行反向調(diào)節(jié)，迅速下調(diào)TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平，所以機(jī)體出現(xiàn)炎性反應(yīng)時(shí)炎性因子的變化特點(diǎn)是短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)急劇波動(dòng)，且會(huì)經(jīng)免疫調(diào)節(jié)快速達(dá)到平衡狀態(tài)；相對(duì)而言，CRP表達(dá)的變化比較緩慢，其表達(dá)量表征著機(jī)體炎性反應(yīng)的整個(gè)過(guò)程。

綜上所述，研究H-MODS發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中炎性因子及CRP的變化特點(diǎn)，將有助于人們準(zhǔn)確預(yù)判H-MODS的病程發(fā)展，為進(jìn)一步深入探討H-MODS的致病機(jī)制提供理論參考，并且對(duì)H-MODS的臨床精準(zhǔn)診斷及治療具有重要的指導(dǎo)意義。