堿蓬紅色素的理化性質(zhì)及抗氧化作用研究

常麗新，賈長虹，馮月

(華北理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 河北 唐山 063210)

堿蓬又稱為翅堿蓬，俗稱“鹽蒿”，堿蓬幼苗俗稱龍須菜，為藜科堿蓬，屬一年生草本植物[1-3]。在我國，堿蓬資源豐富，主要分布在東北、西北、華北以及含鹽量較高的沿海地區(qū)，生長于潮間帶和濱海鹽堿地帶上，是一種典型的鹽堿地指示植物[1,2]。堿蓬綠色天然，幼嫩的堿蓬味道鮮美，富含脂肪、蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸和微量元素[1,4]。堿蓬還可入藥，中醫(yī)認(rèn)為堿蓬具有清熱、消食之功效，常入藥治療發(fā)熱、積食。堿蓬提取物具有抗癌、抗衰老、抗炎、降血糖、降血壓、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等多種功能[3,4]。堿蓬植株在秋季呈紅紫色，富含花青素[5-9]，花青素類色素大多可以清除自由基，具有抗氧化作用，是一種天然安全的抗氧化劑[10]。

目前，從安全性、藥理性等方面考慮，天然色素越來越受到人們的青睞。但天然色素容易受外界條件的影響而穩(wěn)定性較差。該研究探討了經(jīng)過AB-8大孔吸附樹脂純化的堿蓬紅色素的吸收光譜、理化性質(zhì)以及抗氧化作用，為堿蓬的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

堿蓬：11月份采自于華北理工大學(xué)校園外。將采來的堿蓬快速用自來水沖洗干凈，然后用蒸餾水快速沖洗2遍，用干凈的干紗布吸干表面的水珠。放入30～50 ℃干燥箱中烘干，粉碎，過篩備用。

1.2 主要儀器

FA1204B電子天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海安亭電子儀器廠；GOLD-SIM冷凍干燥儀：西盟國際公司；HHD-2電熱恒溫水浴鍋：上海比朗儀器有限公司；UV-5500紫外可見分光光度計(jì) ：上海元析儀器有限公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；GZX-9030MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；C-30玻璃儀器氣流烘干器：北京瑞成偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司；AVATAR 360傅立葉紅外光譜儀：美國尼高力儀器公司。

1.3 試劑

無水乙醇、95%乙醇、甲醇、鹽酸、檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鋅、氯化銅、氯化亞鐵、三氯化鐵、維生素C、蔗糖、亞硫酸鈉、山梨酸鉀、亞硝酸鈉、過氧化氫、水楊酸、鄰苯三酚，均為分析純；Tris北京博奧拓科技有限公司；DPPH 如吉生物科技公司。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1 堿蓬紅色素的的制備

(1)堿蓬紅色素的提?。悍Q取80目堿蓬粉末30 g按固液比1：20加入去離子水，在25 ℃下超聲提取10 min，取出，抽濾，將濾液置于干燥潔凈的棕色瓶中，濾渣按固液比1：10反復(fù)提取3～4次，直到濾液無色，合并濾液。

(2)堿蓬紅色素提取液的濃縮：將濾液于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至濾液略粘稠。

(3)堿蓬紅色素的分離純化：首先將AB-8大孔樹脂用95%乙醇浸泡24 h后，用蒸餾水沖洗2遍，進(jìn)行濕法裝柱，裝柱時(shí)注意避免柱中氣泡的產(chǎn)生，而后繼續(xù)用蒸餾水沖洗至中性，即可使用。將濃縮后的濾液緩慢倒入大孔樹脂柱上，待完全被吸附后，以2倍樹脂體積的蒸餾水洗脫雜質(zhì)，當(dāng)水的顏色變?yōu)闇\紅色時(shí)，以30%乙醇作為洗脫液洗脫色素，控制流速為2 mL/min，收集洗脫液，直到大孔樹脂中無紅色素。

(4)洗脫液的濃縮、干燥：洗脫液于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至濃稠。而后在冷凍干燥儀的多歧管進(jìn)行干燥，提前打開冷凍干燥儀，當(dāng)溫度降低到-40 ℃時(shí)，將色素溶液放入瓶中，進(jìn)行預(yù)凍，然后在-60 ℃溫度下進(jìn)行冷凍干燥，最終得到暗紅色粉末。于4 ℃冰箱中避光保存。

2.2 堿蓬紅色素的光譜特性分析

稱取0.010 0 g堿蓬紅色素粉末，溶于10 mL去離子水中，用去離子水定容至100 mL，配制成0.1 mg/mL的堿蓬紅色素溶液。在350～600 nm波長下，每隔2 nm掃描其吸收光譜，確定最大吸收波長。

2.3 堿蓬紅色素的紅外光譜分析

取1～2 mg堿蓬紅色素在瑪瑙研缽中研磨成細(xì)粉末，而后與干燥的溴化鉀粉末(約100 mg，粒度200 目)混合均勻，裝入模具內(nèi)，在壓片機(jī)上壓制成片后進(jìn)行測定。

2.4 堿蓬紅色素的溶解性

稱取0.010 0 g堿蓬紅色素粉末，分別溶于5 mL水、30%乙醇、30%甲醇、0.1%鹽酸、0.5%檸檬酸中，觀察記錄顏色變化及溶解性。

2.5 堿蓬紅色素的理化性質(zhì)分析

稱取0.200 0 g堿蓬紅色素粉末，溶于100 mL去離子水中，并定容至1 000 mL，配制成0.2 mg/mL堿蓬紅色素溶液，于暗處避光保存，以備下列實(shí)驗(yàn)所用。

(1)溫度對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

取上述色素溶液7份各10 mL于7支試管中，分別置于40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃下保溫1 h，取出，觀察記錄顏色變化。冷卻至室溫后，在最大波長下測定其吸光值。

(2)酸堿性對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

取上述色素溶液8份各5 mL于8支試管中，分別加入5 mL，pH值為5.7、6.0、6.3、6.8、7.0、7.3、7.7、8.0的磷酸鹽緩沖溶液，充分混合均勻，室溫避光放置1 h，觀察記錄顏色變化。在最大波長下測定其吸光值。

(3)金屬離子對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

配制濃度為0.02%的氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、氯化鋅、氯化銅、氯化亞鐵、三氯化鐵溶液。取色素溶液8份各5 mL于8支試管中，分別加入5 mL上述不同金屬離子溶液，充分混合均勻，室溫避光放置1 h，觀察記錄顏色變化。在最大波長下測定其吸光值。

(4)氧化劑對堿蓬紅色素的影響

將亞硫酸鈉配制成濃度為0%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的溶液。取色素溶液6份各5 mL于6支試管中，分別加入5 mL上述不同濃度的亞硫酸鈉溶液，室溫避光放置1 h，觀察記錄顏色變化。在最大波長下測定吸光值。

(5)還原劑對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

將維生素C配制成濃度為0%、0.02%、0.04%、0.08%、0.16%、0.32%、0.64%的溶液。取色素溶液7份各5 mL于7支試管中，分別加入5 mL上述不同濃度的維生素C溶液，室溫避光放置1 h，觀察記錄顏色變化。在最大波長下測定其吸光值。

(6)食品添加劑對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

a. 檸檬酸

將檸檬酸配制成濃度為0%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的溶液。取色素溶液7份各5 mL于7支試管中，分別加入5 mL上述不同濃度的檸檬酸溶液，室溫避光放置1 h，觀察記錄顏色變化。在最大波長下測定其吸光值。

b. 蔗糖

將蔗糖配制成濃度為0%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的溶液。取色素溶液7份各5 mL于7支試管中，分別加入5 mL上述不同濃度的蔗糖溶液，室溫避光放置1 h，觀察記錄顏色變化。在最大波長下測定其吸光值。

c. 山梨酸鉀

將山梨酸鉀配制成濃度為0%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%的溶液。取色素溶液6份各5 mL于6支試管中，分別加入5 mL上述不同濃度的山梨酸鉀溶液，室溫避光放置1 h，觀察記錄顏色變化。在最大波長下測定其吸光值。

d. 亞硝酸鈉

將亞硝酸鈉配制成濃度為0%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%的溶液。取色素溶液7份各5 mL于7支試管中，分別加入5 mL上述不同濃度的亞硝酸鈉溶液，室溫避光放置1 h，觀察記錄顏色變化。在最大波長下測定其吸光值。

2.6 堿蓬紅色素的抗氧化作用

(1)堿蓬紅色素對羥自由基的清除作用

將堿蓬紅色素分別配制成濃度為0 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL、300 μg/mL的溶液。取8支試管，分別加入濃度為10 mmol/L的硫酸亞鐵溶液1 mL，再加入2 mL濃度為10 mmol/L的H2O2，充分搖勻后，加入2 mL濃度為5 mmol/L水楊酸-乙醇溶液(注意：水楊酸溶液用濃度為95%乙醇配制)，搖勻，然后分別加入濃度為0 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL、300 μg/mL的色素溶液5 mL，使溶液總體積為10 mL。在37 ℃反應(yīng)30 min。以去離子水作參比調(diào)儀器零點(diǎn)，在510 nm波長下，測定試劑空白液(即不同濃度的色素溶液)和加了各濃度色素溶液的反應(yīng)體系液的吸光度。

按照公式(1)計(jì)算清除率：

(1)

式中：E：清除率，%；

Ao：未加色素測得的吸光值；

Ax：加各濃度色素溶液的吸光值；

An：不同濃度色素溶液的吸光值。

(2)堿蓬紅色素對氧自由基的清除作用

取8支試管，加入Tris-HCl 4.5 mL(pH為8.2)，加入濃度為0 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL、300 μg/mL的色素溶液4 mL，充分搖勻，加入去離子水1 mL，37 ℃水浴保溫20 min，再加入3 mmol/L 鄰苯三酚0.5 mL。在325 nm處測量其吸光值，每過30 s測量一個(gè)數(shù)，反應(yīng)6 min時(shí)記下最終結(jié)果。以去離子水調(diào)零點(diǎn)，測定試劑空白液(即不同濃度的色素溶液)和加了各濃度色素溶液的反應(yīng)體系液的吸光度。

按照公式(1)計(jì)算清除率。

(3)堿蓬紅色素對總自由基(DPPH·)的清除

取8支試管，加入濃度為0 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL、300 μg/mL的色素溶液4 mL，分別加入濃度為200 μmol/L的DPPH·溶液4 mL，室溫避光處靜置30 min后，分別以不同濃度的色素溶液作參比，于517 nm波長下測定各溶液的吸光值。

按照公式(2)計(jì)算清除率。

(2)

式中：E：清除率，%；

Ao：未加樣品溶液測定的吸光值；

Ax：加樣品溶液測定的吸光值。

3結(jié)果與分析

3.1 堿蓬紅色素的光譜特性分析

圖1所示為堿蓬紅色素的吸收光譜。

圖1 堿蓬紅色素的吸收光譜

由圖1可以看出，堿蓬紅色素在波長540 nm處具有最高吸收峰。因此，確定堿蓬紅色素的最大吸收波長為540 nm[11]。

3.2 堿蓬紅色素的紅外光譜分析

圖2所示為堿蓬紅色素的紅外光譜。

圖2 堿蓬紅色素的紅外光譜

由圖2可知，在3 422 cm-1處為-OH伸縮振動(dòng)吸收峰， 2 967 cm-1、2 925 cm-1處分別為-CH3、-CH2伸縮振動(dòng)吸收峰。芳香族化合物的苯環(huán)骨架振動(dòng)吸收在1 620～1 470 cm-1之間，1 630 cm-1處為C=O伸縮振動(dòng)吸收峰，可以確定堿蓬紅色素為酚類化合物。

3.3 堿蓬紅色素的溶解性

表1所示為堿蓬紅色素的溶解性能。

表1 堿蓬紅色素的溶解性

由表1可知，堿蓬紅色素在去離子水中，溶解速度快且全部溶解；在30%乙醇溶液中，溶解速度較慢且有漂浮現(xiàn)象；在30%甲醇溶液中，溶解速度緩慢，且大部分較難溶解；在0.1%鹽酸溶液中，溶解速度快，但有微量沉淀產(chǎn)生；在0.5%檸檬酸溶液中，溶解速度較慢且有少量沉淀產(chǎn)生。說明堿蓬紅色素極易溶于水，為水溶性色素。

3.4 堿蓬紅色素的理化性質(zhì)

(1)溫度對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

圖3所示為溫度對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響。

圖3 溫度對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

由圖3可知，隨著溫度升高，堿蓬紅色素的吸光值不斷降低。從溶液顏色變化看，隨著溫度升高溶液顏色逐漸變淺，溫度從40℃升高到100 ℃時(shí)，吸光值從0.329降到0.119，100 ℃時(shí)溶液幾乎呈無色，說明溫度對堿蓬紅色素的穩(wěn)定性具有明顯影響。

(2)光照對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

圖4所示為光照對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響。

圖4 光照對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

由圖4可知，隨著光照時(shí)間的增加，堿蓬紅色素的吸光值不斷降低，光照1～6 d時(shí)，吸光值從0.335降到0.209，說明光照對堿蓬紅色素的穩(wěn)定性有明顯影響。

(3)pH對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

圖5所示為pH對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響。

圖5 pH對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，隨著pH值變大，堿蓬紅色素的吸光值逐漸變小，pH在5.7～6.8時(shí)，色素溶液顏色較深，當(dāng)pH超過6.8之后，顏色逐漸變淺。說明堿蓬紅色素在pH為5.7～6.8時(shí)比較穩(wěn)定。

(4)金屬離子對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

圖6所示為金屬離子對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響。

圖6 金屬離子對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

由圖6可知，氯化鈉、 氯化鉀、 氯化鈣、氯化鎂溶液對堿蓬紅色素的影響較小，吸光度和顏色變化不明顯。而氯化鋅、氯化銅、氯化亞鐵、 氯化鐵溶液對堿蓬紅色素的影響較大，吸光值分別從0.173變?yōu)?.151、0.124、0.147和0.109，而且顏色變化明顯，加入氯化鋅、氯化銅、氯化亞鐵溶液后，色素溶液顏色變淺，而加入氯化鐵溶液后，色素溶液顏色變?yōu)榈G色 。

(5)氧化劑對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

圖7所示為氧化劑對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響。

圖7 氧化劑對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

由圖7可知，加入氧化劑亞硫酸鈉后堿蓬紅色素溶液的吸光值變小，顏色略微變淺。但隨著亞硫酸鈉溶液濃度的增大，吸光度和顏色變化不明顯。說明添加氧化劑對堿蓬紅色素溶液的穩(wěn)定性具有一定影響，但亞硫酸鈉溶液濃度在0.01%～0.05%范圍內(nèi)，濃度大小對堿蓬紅色素溶液的穩(wěn)定性影響不大。

(6)還原劑對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

圖8所示為還原劑對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響。

圖8 還原劑對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

由圖8可知，加入還原劑維生素C后堿蓬紅色素溶液的吸光值變小，顏色略微變淺。但隨著維生素C溶液濃度的增大，吸光度和顏色變化不明顯。說明還原劑對堿蓬紅色素溶液的穩(wěn)定性具有一定影響，但維生素C濃度在0. 02%～0.64%范圍內(nèi)，濃度大小對堿蓬紅色素溶液的穩(wěn)定性影響不大。

(7)食品添加劑對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

a. 檸檬酸對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

圖9所示為檸檬酸對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響。

圖9 檸檬酸對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

由圖9可知，添加檸檬酸后堿蓬紅色素的吸光值略有下降，但隨著檸檬酸溶液濃度的增大，吸光度和顏色變化不明顯。因此，檸檬酸濃度在0.1%～1.0%范圍內(nèi)時(shí)，濃度大小對堿蓬紅色素穩(wěn)定性無明顯影響。

b. 蔗糖對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

圖10所示為蔗糖對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響。

圖10 蔗糖對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

由圖10可知，添加蔗糖后堿蓬紅色素的吸光值無明顯變化，隨著蔗糖濃度增加，吸光值和顏色變化不明顯。說明添加蔗糖對堿蓬紅色素沒有明顯影響。

c. 山梨酸鉀對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

圖11所示為山梨酸鉀對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響。

圖11 山梨酸鉀對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

由圖11可知，添加山梨酸鉀后堿蓬紅色素的吸光值無明顯變化，隨著山梨酸鉀濃度的增加，堿蓬紅色素的吸光度和顏色無明顯變化。說明添加山梨酸鉀對堿蓬紅色素的穩(wěn)定性沒有明顯影響。

d. 亞硝酸鈉對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

圖12所示為亞硝酸鈉對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響。

圖12 亞硝酸鈉對堿蓬紅色素穩(wěn)定性的影響

由圖12可知，添加亞硝酸鈉后堿蓬紅色素的吸光值有所下降，隨著亞硝酸鈉濃度的增加，吸光值略有降低，但當(dāng)添加亞硝酸鈉的濃度達(dá)到0.05%時(shí)，吸光值出現(xiàn)一小峰值，但低于不添加亞硝酸鈉的吸光值。說明亞硝酸鈉對堿蓬紅色素的穩(wěn)定性有一定的影響。

3.5 堿蓬紅色素的抗氧化作用

表2所示為堿蓬紅色素的抗氧化作用。

表2 堿蓬紅色素的抗氧化作用

由表2可知，堿蓬紅色素對羥自由基具有一定的清除作用，堿蓬紅色素濃度在0～300 mg/mL范圍內(nèi)，隨著堿蓬紅色素濃度的增加，對羥自由基的清除作用增強(qiáng)。當(dāng)堿蓬紅色素的濃度達(dá)到300 mg/mL時(shí)，對羥自由基的清除率可達(dá)到16.47%。堿蓬紅色素的濃度與清除率之間的關(guān)系符合回歸方程y=0.054 2x-0.606。當(dāng)清除率達(dá)到50%時(shí)，堿蓬紅色素的濃度需要達(dá)到934 mg/mL。堿蓬紅色素對氧自由基具有一定的清除作用，堿蓬紅色素濃度在0～300 mg/mL范圍內(nèi)，隨著堿蓬紅色素濃度的增加，對氧自由基的清除作用增強(qiáng)。當(dāng)堿蓬紅色素的濃度達(dá)到300 mg/mL時(shí)，對氧自由基的清除率可達(dá)到42.80%。堿蓬紅色素的濃度與清除率之間的關(guān)系符合回歸方程y=0.125 8x+2.086 7，當(dāng)清除率達(dá)到50%，堿蓬紅色素的濃度需要達(dá)到380 mg/mL。堿蓬紅色素對總自由基(DPPH·)具有一定的的清除作用，堿蓬紅色素濃度在0～300 mg/mL范圍內(nèi)，隨著堿蓬紅色素濃度的增加，對總自由基的清除作用明顯增強(qiáng)。當(dāng)堿蓬紅色素的濃度達(dá)到300 mg/mL時(shí)，總自由基的清除率可達(dá)到98.85%。堿蓬紅色素的濃度與清除率之間的關(guān)系符合回歸方程y=0.275 2x+26.695。當(dāng)清除率達(dá)到50%，堿蓬紅色素的濃度需要達(dá)到85 mg/mL。

4結(jié)論

(1)堿蓬紅色素在波長540 nm處有最大吸收峰，通過紅外光譜分析確定堿蓬紅色素為酚類化合物。堿蓬紅色素易溶于水，為水溶性色素。

(2)高溫能破壞堿蓬紅色素的穩(wěn)定性，氧化劑、還原劑對堿蓬紅色素的穩(wěn)定性有一定影響，但在一定濃度范圍內(nèi)，濃度大小對其影響不明顯，食品添加劑檸檬酸、蔗糖、山梨酸對堿蓬紅色素?zé)o明顯影響。金屬離子Na+、K+、Ca2+、Mg2+對堿蓬紅色素的影響較小，而Zn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+對堿蓬紅色素的影響較大，堿蓬紅色素對羥自由基和氧自由基、DPPH具有一定清除作用，隨著堿蓬紅色素濃度的增大清除作用增強(qiáng)。同樣濃度的堿蓬紅色素對DPPH的清除作用遠(yuǎn)大于氧自由基和羥自由基。堿蓬紅色素?zé)o毒無害，可以廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料和化妝品等行業(yè)。