石榴皮活性成分治療痤瘡作用機制的網絡藥理學預測及實驗研究＊

魏 露，吳淑輝，張 曦，吳欣桐，劉 娟，朱明芳

(1.湖南中醫(yī)藥大學研究生院 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院皮膚科 長沙 410005)

痤瘡是一種常見的累及毛囊皮脂腺單位的慢性炎癥性皮膚病，青少年發(fā)病率高達79%-95%，且發(fā)病人群有向中年擴展的趨勢[1]。痤瘡病因復雜，皮脂穩(wěn)態(tài)失衡、炎癥反應、免疫應答、激素分泌等參與痤瘡的進程[2]。痤瘡不僅危害皮膚健康，對患者的社交、心理健康也造成了極大的影響?？股仡?、維A酸類等為痤瘡治療的常規(guī)藥物，它們在一定程度上可緩解痤瘡癥狀，但抗生素導致耐藥現(xiàn)象嚴重；維A酸有皮膚黏膜刺激和致畸性等副作用。鑒于目前痤瘡治療效果不理想、難以根治的現(xiàn)狀，開發(fā)新型抗痤瘡藥物迫在眉睫。

痤瘡屬于中醫(yī)“肺風粉刺”范疇，《內經》中載“肺者……其華在毛，其充在皮”。因此歷代醫(yī)家?；凇耙云ぶ纹ぁ崩碚撝委熎つw病?！耙云ぶ纹ぁ笔歉鶕嗅t(yī)象思維，在辨證論治的基礎上，運用植物藥材的皮部或動物的皮膚入藥，治療某些皮膚病的方法。石榴皮(Pomegranate peel)首載于《雷公炮炙論》，系石榴科植物石榴的干燥果皮，味酸、澀，性溫，有小毒，歸大腸經，有澀腸止瀉、止血、驅蟲等功效，其在皮膚病的治療中應用廣泛[3]。《醫(yī)學正宗》曰“石榴皮治腳肚生瘡，初起如粟，搔之漸開，黃水浸淫，癢痛潰爛，遂致繞脛而成痼疾：酸榴皮煎湯冷定，日日掃之，取愈乃止”?！兜门浔静荨吩啤笆衿?，酸、澀、溫……除目流冷淚，洗腳瘡濕爛”。同時，其在銀屑病[4]、扁平疣[5]的治療中也有應用?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，石榴皮具有抑菌[6-7]、抗炎[8]、抗氧化、調節(jié)腸道菌群[9]等藥理作用，但其作用機制尚不明確。同時，石榴提取物可通過抑制痤瘡丙酸桿菌(Cutibacterium acnes，C.acnes)及金黃色葡萄球菌生長、降低脂肪酶活性、抗角質細胞增殖和抗炎發(fā)揮治療痤瘡的作用[10]。課題組基于“以皮治皮”理論，利用皮類中藥石榴皮治療痤瘡，療效顯著，并申請了以石榴皮為主要組成的中藥面膜專利—一種中草藥面膜及其制備方法(申請?zhí)枺篊N201510648316.6)，獲得了良好的社會效益[11,12]。

如何理解中藥方劑配伍形成的復雜化學體系與病證復雜生物系統(tǒng)的相互作用是當前中藥研究面臨的重要挑戰(zhàn)。網絡藥理學通過將方藥、病證映射于生物分子網絡，建立方藥與病證的關聯(lián)機制，使得方劑現(xiàn)代研究由描述轉為預測，充分發(fā)揮了方劑配伍的特色與優(yōu)勢，為躋身藥物的前沿研究創(chuàng)造了有利條件[13-15]。本研究基于網絡藥理學方法篩選石榴皮的活性成分、作用機制，并通過動物實驗驗證上述預測結果，為闡明石榴皮治療痤瘡的作用靶點及機制提供參考，同時為“以皮治皮”理論在中醫(yī)皮膚科的應用提供現(xiàn)代理論依據。

1 材料及方法

1.1 石榴皮活性成分篩選

通過TCMSP數(shù)據庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、SymMap數(shù)據庫(http://www.symmap.org/)篩選中藥石榴皮的所有活性成分，以口服生物利用度(OB)≥30%，中藥類藥性(DL)≥0.18[16]作為篩選條件。利用SymMap數(shù)據庫獲得中藥的活性成分后，將OB≥30%的活性成分依次導入TCMSP數(shù)據庫，若DL≥0.18則將其納入結果。

1.2 藥物作用靶點與疾病靶點預測

采用Perl軟件對相關活性成分作用靶點進行預測。利用Perl軟件(https://www.perl.org/get.html)和UniProt數(shù)據庫(http://www.uniprot.org/)查找靶點“蛋白名”對應的“基因名”，并對重復作用靶點及無對應基因名的靶點進行整合。以“acne”“acne vulgaris”和“common acne”作為關鍵詞，通過GeneCards數(shù)據庫(https://genealacart.genecards.org/)、OMIM數(shù)據庫(https://www.omim.org/)獲取疾病相關靶點。利用R語言軟件(https://www.r-project.org/)將痤瘡相關靶點與石榴皮靶點取交集，初步獲得石榴皮治療痤瘡的潛在作用靶點。

1.3 藥物作用靶點與痤瘡疾病靶點互作網絡構建及可視化

將中藥與疾病的交集靶點導入String數(shù)據庫(https://string-db.org/)，設置物種為人，得到潛在作用靶點之間的相互關系，導出為.tsv格式。將上述結果導入Cytoscape3.6.1軟件，并利用“Network Analyzer”插件對網絡的拓撲參數(shù)進行分析，以節(jié)點大小及顏色深淺反映其degree值大小。

1.4 通路富集分析

采用David生物信息學資源平臺6.8(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)對上述篩選的靶點進行KEGG信號通路富集分析，限定研究物種為人，以P＜0.05為閾值，從中篩選石榴皮治療痤瘡的潛在信號通路。值得一提的是，雖然David數(shù)據庫功能全面且易操作，但限于其覆蓋范圍及更新速度，其預測結果可能存在假陽性現(xiàn)象，故本研究以P＜0.05為閾值，篩選前20條通路，并結合計算機檢索CNKI、WanFang和PubMed數(shù)據庫，搜索痤瘡發(fā)病機制相關信號通路，將兩者結果進行整合，剔除無文獻報道通路，增加文獻報道較多的通路。所有中英文數(shù)據庫檢索時限均為2018年1月1日-2020年12月31日。中文檢索詞包括：“痤瘡”“尋常痤瘡”“通路”英文檢索詞包括“acne”“acne vulgaris”“common acne”“signaling pathway”。匯 總 檢索文獻的基本信息，包括：作者、年份、標題等。

1.5 “成分-靶點-通路”網絡的構建及可視化

將上述所有分析結果導入Cytoscapev3.6.1軟件，并通過Merge插件將“靶點-通路”網絡與“成分-靶點”網絡進行整合及可視化分析，構建石榴皮“成分-靶點-通路”網絡。網絡中的成分、靶點、信號通路采用節(jié)點(node)表示，節(jié)點之間的相互作用通過邊(edge)表示。

1.6 實驗動物

SPF級金黃地鼠18只，雄性，體質量(110-130)g，由中南大學實驗動物學部購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0011，動物實驗倫理審查編號：2019sydw0136]，實驗前動物適應性飼養(yǎng)1周。動物實驗按照中南大學實驗動物學部福利和倫理原則操作。

1.7 藥品與試劑

70%石榴皮多酚提取物(西安瑞盈生物科技有限公司)；自制石榴皮多酚乳膏，制作方法及步驟參考課題組的前期研究[17]。10%水合氯醛(上海山浦化工有限公司)，0.025%維A酸乳膏(商品名：迪維，規(guī)格:15g/支，國藥準字：H50021817，生產廠家：重慶華邦制藥有限公司)，PI3K兔多克隆抗體(美國Proteintech公司)。

1.8 動物分組及給藥

將受試動物按隨機數(shù)字表分為3組，即空白對照組、基質組、石榴皮多酚乳膏組[0.32g生藥/(kg·天)，通過體表面積換算[18]，相當于等效劑量的2倍]，每組6只，給藥方法為外用，給藥部位為雙側皮脂腺斑處，2次/天，連續(xù)用藥4周。

1.9 皮脂腺斑大小測量

空白組不予任何藥物處理。給藥前及末次給藥24 h后，用剃須刀剔除金黃地鼠雙側側腹部毛發(fā)，使皮脂腺斑充分暴露，在強光照射下，用游標卡尺測量并記錄皮脂腺斑的最大橫徑(DT)、最大縱徑(DL)，計算

DT*DL。

1.10 免疫組化檢測

剪下各組金黃地鼠左側另一半皮脂腺斑，置于-80℃環(huán)境中保存，檢測皮脂腺斑組織中PI3K的表達情況，在放大20倍視野下隨機挑選5個測定區(qū)域，按一定域值分割陽性細胞，測定皮脂腺斑中PI3K表達的平均積分光密度。

1.11 統(tǒng)計學分析

使用SPSS21.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據進行處理，計量資料采用(xˉ±s)表示。用藥前后比較采用配對資料的t檢驗，組間多重比較采用單因素方差分析，并以LSD法進行兩兩比較。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 石榴皮有效成分的篩選

在TCMSP數(shù)據庫、SymMap數(shù)據庫中輸入“SHILIUPI”，以OB≥30%且DL≥0.18為篩選條件，共得到29種活性成分及相關信息。通過閱讀相關文獻，發(fā)現(xiàn)安石榴苷[19,20]、安石榴林[21,22]這兩種化學成分雖不滿足上述OB、DL篩選標準，但臨床藥理學實驗驗證有效，故亦納入活性成分進行研究(表1)。

表1 TCMSP數(shù)據庫篩選的石榴皮活性成分

2.2 中藥-疾病靶點預測

利用R語言軟件共收集到石榴皮活性成分靶點193個，痤瘡相關靶點1371個，將疾病相關靶點與藥物靶點取交集，共獲得79個石榴皮治療痤瘡的潛在靶點(見圖1)。

圖1 中藥-疾病靶點

2.3 潛在靶點互作網絡的構建

潛在靶點互作網絡見圖2，節(jié)點越大、顏色越深，其對應的Degree值越大。結果顯示該網絡中的關鍵節(jié)點主要包括Akt1、IL-6、VEGFA、PTGS2、JUN、IL-1B、CXCL8、MMP9、MAPK1等，可能是石榴皮實現(xiàn)藥理效應的核心靶點。

圖2 潛在靶點互作網絡

2.4 通路富集分析

通過對候選靶點進行通路富集分析，得到TNF signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway等7條信號通路。通過檢索數(shù)據庫，共檢索到75篇文獻，其中英文文獻25篇，中文文獻50篇，排除與David數(shù)據庫檢索結果重合通路后，共選用3篇文獻[23-25]，得到4個痤瘡發(fā)病機制相關通路，包括FoxOsignaling pathway、Ras signaling pathway、Insulin resistance、MAPK signaling pathway。將無文獻報道通路剔除，添加以上4個通路映射到富集分析結果中，共得到11條主要的生物信號通路，按富集的靶標總數(shù)(n)排序如表2。

表2 通路富集分析信息

2.5 “成分-靶點-通路”網絡構建及可視化

利用Cytoscape v3.6.1軟件繪制“活性成分-靶點-通路”網絡(圖3)。在網絡中，節(jié)點的度值代表和此節(jié)點相連接的邊的條數(shù)，根據網絡拓撲學原理篩選度值較大的化合物節(jié)點進行分析，度值排名前3的藥物成分為槲皮素(132)、木犀草素(49)、山奈酚(48)，其可能是石榴皮治療痤瘡關鍵活性成分。由圖3可見，PTGS2、PTGS1、KCNH2、AR、Akt1、MAPK1等靶點與藥效成分互作次數(shù)顯著高于其他節(jié)點，提示以上靶點在網絡中較重要，這與潛在靶點互作網絡的結果相符；根據通路富集分析結果的P值大小，可知PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、T細胞受體信號通路、FoxO信號通路等成為有效信號通路的可能性和準確性較高。

圖3 石榴皮“成分-靶點-通路”網絡

2.6 皮脂腺斑面積比較

給藥前，3組皮脂腺斑大小經方差檢驗，差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性。給藥后，各組皮脂腺斑大小較給藥前均有增大，考慮與飼養(yǎng)致體表面積增大有關。給藥后，與空白組、基質組相比，石榴皮多酚乳膏組同側皮脂腺斑面積明顯縮小，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(表3)。

表3 治療前后各組金黃地鼠雙側皮脂腺斑面積的比較(±s；n=6)

表3 治療前后各組金黃地鼠雙側皮脂腺斑面積的比較(±s；n=6)

注：與空白組比較，*P＜0.05；與基質組比較，#P＜0.05。

組別空白組基質組石榴皮多酚乳膏組給藥前左側/mm2 35.67±3.87 35.34±2.72 36.20±2.43右側/mm2 36.94±3.11 37.03±2.64 37.87±2.98給藥后左側/mm2 48.05±2.62 46.20±4.88 41.43±3.39*#右側/mm2 48.34±3.68 47.88±5.45 41.40±4.43*#

2.7 各組金黃地鼠皮脂腺斑PI3K蛋白的表達

免疫組化顯示，PI3K主要分布在皮脂腺細胞的細胞漿上(圖6)。與空白組相比，基質組皮脂腺斑PI3K表達無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；與空白組相比，石榴皮多酚乳膏組皮脂腺斑PI3K表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與基質組相比，石榴皮多酚乳膏組皮脂腺斑PI3K表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。以上表明，石榴皮多酚乳膏可使金黃地鼠皮脂腺斑PI3K的表達降低(表4)。

表4 各組金黃地鼠皮脂腺斑PI3K表達情況的平均積分光密度值比較(±s；n=6)

表4 各組金黃地鼠皮脂腺斑PI3K表達情況的平均積分光密度值比較(±s；n=6)

注：與空白組比較，*P＜0.05；與基質組比較，#P＜0.05。

組別空白組基質組石榴皮多酚乳膏組PI3K 0.42±0.03 0.41±0.03 0.37±0.03*#

3 討論

3.1 石榴皮防治痤瘡的理論淵源

中醫(yī)認為痤瘡是由于外受風邪，肺經蘊熱、濕熱蘊結，痰濕互結、毒熱互結，肝腎陰虛、沖任失調而發(fā)病[26]。根據“整體觀念”和“取類比象”思維，中醫(yī)學認為人體皮膚的病變是相應臟腑或局部皮膚病變的結果。皮類藥物取自于動植物器官表皮，與人體皮膚一樣為身體之藩籬、衛(wèi)外之屏障[27]?！吨兴巿D譜》和《食物本草》中記載：石榴皮水煎液可用于治療各種皮膚疥癬?！队耖彼幗狻吩啤笆衿に釢諗?，治下利遺精、脫肛便血、崩中帶下之病，點眼止淚，涂瘡拔毒”。石榴皮提取物中多酚總量與其多種生物活性呈明顯的正相關[28]。顧政一等[29]研究表明，石榴皮多酚可促進大鼠急性皮膚創(chuàng)傷部位傷口愈合。課題組前期研究表明，石榴皮多酚對兔耳粉刺模型具有抗角化、抗炎的作用[30]。同時，Boo YC等[31]認為石榴或石榴皮中的酚類具有抗氧化、抗炎的作用，對尋常痤瘡、特應性皮炎等皮膚病均有改善作用。

圖4 PI3K在皮脂腺斑組織中的分布

3.2 關鍵成分分析

本研究對獲取的31種具有相關生物活性的化學成分進行分析，其中有較多作用靶點的成分主要有槲皮素、山奈酚、木犀草素，其可能是石榴皮發(fā)揮治療作用的重要成分。槲皮素具有抗氧化、調節(jié)脂質代謝、心血管保護等藥理作用。痤瘡發(fā)病與人皮脂腺細胞的脂質分泌、代謝紊亂密切相關。而在人原始脂肪細胞中，槲皮素具有抗炎、改善胰島素抵抗的作用[32]。山奈酚具有良好的抗炎、抗癌、改善胰島素抵抗等作用，抑制腫瘤生長形成等藥理活性。研究表明，槲皮素、山奈酚通過抑制痤瘡丙酸桿菌生長，增強紅霉素的抗炎作用，從而發(fā)揮治療痤瘡的作用[33]。而以木犀草素為主要成分的疤痘霜具有活血清熱解毒的作用，適用于各類尋常痤瘡[34]。由此可見石榴皮防治痤瘡的活性成分主要通過抗炎、調節(jié)脂質代謝、改善胰島素抵抗發(fā)揮作用。

3.2 關鍵靶點分析

石榴皮的31種活性成分共涉及193個靶點。潛在靶點互作網絡結果顯示石榴皮可能通過Akt1、IL-6、VEGFA、PTGS2等靶點實現(xiàn)藥理效應。研究表明白藜蘆醇主要通過抑制Akt表達，降低皮脂生成，從而治療痤瘡[35]。IL-6基因啟動子多態(tài)性可能與痤瘡的易感性有關，但與痤瘡患者的嚴重程度無關[36]。一項臨床研究表明，異維甲酸可顯著升高痤瘡患者血清sVEGFR3水平，并降低血清sVEGFR1水平，而對血清sVEGFR2水平無明顯影響[37]。PTGS2又名環(huán)氧合酶-2(Cyclo-oxygenase 2，COX-2)，其通過調節(jié)皮脂腺細胞增殖、脂質合成，及毛囊皮脂腺單位炎癥反應參與痤瘡的發(fā)生[38]。石榴皮活性成分通過調節(jié)這些靶點起到防治痤瘡的作用。

3.3 關鍵通路分析

通過KEGG通路富集分析及文獻檢索，初步獲得石榴皮治療痤瘡的11條潛在通路：PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、T細胞受體信號通路、FoxO信號通路等。Mastrofrancesco A等[39]的研究表明，激活PI3KAkt信號通路可誘導SZ95人皮脂細胞脂質合成，促進細胞生長、增值，導致痤瘡加重。Mirdamadi Y等[40]發(fā)現(xiàn)IGF-1和胰島素在作用于初始T細胞15 min后，能夠促進其細胞質p-Akt的表達，且將SZ95人皮脂腺細胞與T細胞共培養(yǎng)后p-Akt表達上調，因此猜測IGF-1和胰島素刺激后的SZ95能夠分泌某些因子，減少T細胞增殖，誘導p-Akt的表達，最終導致痤瘡發(fā)生。一項薈萃分析顯示，TNF-α基因的多態(tài)性與不同人種的痤瘡易感性相關[41]。Choi JJ等[42]的研究表明，TNF-α通過作用于PI3K-Akt信號通路促使SZ95細胞脂質合成。Agak GW等[43]的研究表明，與健康皮膚相比，痤瘡患者皮膚表面C.acnes可以誘導產生不同表型的Th17細胞。Shi G等[44]發(fā)現(xiàn)IGF-1可能通過PI3K-Akt-FoxO1信號通路抑制角質形成細胞分化，而異維甲酸對痤瘡的治療作用可能與增強FoxO1表達有關。文獻證明這些信號通路大都涉及皮脂分泌、炎癥反應、氧化應激、免疫應答等環(huán)節(jié)，它們參與了痤瘡基本病理生理過程。

本研究使用的TCMSP數(shù)據庫雖存在局限性，如無法提供藥物體內外成分的變化，但其整合了藥物化學、藥代動力學、網絡靶點預測等信息，構建的中藥化學分子庫較為全面，提供了ADME參數(shù)、成分作用靶點等關鍵信息，準確性和查全性可靠，是目前中藥網絡藥理學領域較為公認的數(shù)據庫[45]?？诜徒浧そo藥藥物的生物利用度不同，但現(xiàn)有網絡藥理學數(shù)據庫無經皮吸收藥物的生物利用度指標，這在一定程度上增加了進行相關藥物網絡藥理學研究的難度。鑒于外治法在中醫(yī)外科學應用的廣泛性，有必要在現(xiàn)有數(shù)據庫中增加經皮吸收藥物的生物利用度評價指標。

結合痤瘡的文獻研究[42,46]：PI3K信號通路參與痤瘡皮脂穩(wěn)態(tài)失衡的發(fā)生與發(fā)展，課題組重點研究了PI3K蛋白在金黃地鼠皮脂腺斑中的表達情況。為了驗證網絡藥理的部分預測，本研究進一步研究了石榴皮多酚對金黃地鼠皮脂腺斑增生、皮脂腺斑組織PI3K表達水平的影響。結果表明：石榴皮多酚乳膏能使金黃地鼠皮脂腺斑面積縮小，降低皮脂腺斑組織中PI3K蛋白的表達，此結果與網絡藥理學的預測結果一致。

綜上所述，石榴皮治療痤瘡的活性成分可能是槲皮素、山奈酚、木犀草素等，上述活性成分主要作用于Akt1、IL-6、VEGFA、PTSG2等靶標基因，參與調節(jié)PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、T細胞受體信號通路、FoxO信號通路等調控皮脂穩(wěn)態(tài)、抑制炎癥反應等，從而發(fā)揮治療痤瘡的作用。本研究從理論預測、整體分析角度，初步揭示了石榴皮治療痤瘡的潛在活性成分及其可能的作用機制，進一步經實驗證實，石榴皮多酚乳膏能夠抑制金黃地鼠皮脂腺斑組織中PI3K蛋白的表達，抗皮脂腺斑增生，進而發(fā)揮治療痤瘡的作用。本研究可為實驗研究石榴皮治療痤瘡的作用機制提供參考，同時為“以皮治皮”理論在中醫(yī)皮膚科的應用提供現(xiàn)代理論依據。