王琦教授新冠肺炎預防方預防新型冠狀病毒肺炎機制的網絡藥理學探討＊

董思穎，江澤強，孟翔鶴，崔家瑞，王雅琦，王 濟

(北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院/國家中醫(yī)體質與治未病研究院 北京 100029)

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)在全球廣泛流行，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、干咳，少數(shù)患者伴鼻塞、流涕、腹瀉，也有患者通過消化系統(tǒng)、神經系統(tǒng)等其他系統(tǒng)癥狀起病。感染者易出現(xiàn)急性肺損傷[1]，并出現(xiàn)多系統(tǒng)并發(fā)癥。目前國內形勢趨于穩(wěn)定，但仍有散在的輸入性病例，威脅人們的健康。由于COVID-19傳染性強、治療期長，又有復發(fā)的可能，開展復工復課后聚集性傳染隱患的新冠肺炎中醫(yī)藥調體防護研究、調理體質、扶助正氣、未病先防就成為其中發(fā)揮重要作用的第一道屏障。發(fā)揮中醫(yī)體質學“治未病”的特色，在人流密集區(qū)、境外輸入高發(fā)地采用中藥內服、外用多元化手段防疫，可降低傳染風險，將感染幾率降到最低。

基于以上原則，王琦院士根據(jù)新冠肺炎疫情的特點，在廣泛查閱相關資料的基礎上擬定了兩組新冠肺炎預防方(以下簡稱方1和方2)。方1由蘆根15 g，銀花10 g，藿香10 g，紅景天15 g，貫眾15 g，虎杖12 g組成；方2由金銀花10 g，蘆根15 g，白茅根15 g，藿香10 g，白芷6 g，草果6 g組成。兩方已通過臨床研究證明了其具有上調基礎免疫指標的作用。網絡藥理學是一種基于網絡闡明藥物-靶點-疾病的相互關系以及藥物作用機制的現(xiàn)代研究方法[2]，可以通過方劑成分研究出其可能作用的靶點和通路，從而輔助研究方劑對疾病的作用機制[3]。本文就以上2組方劑，通過網絡藥理學的方法探索方1、方2與COVID-19之間的關系，闡釋兩組方劑在預防COVID-19中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 王琦教授新冠肺炎預防方共12味中藥的活性成分與靶點

通過文獻查找[4]及TCMSP數(shù)據(jù)庫(http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)對中藥成分相關的活性成分進行搜索，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為篩選條件進行篩選，最終分別得到預防方1與方2符合條件的候選活性成分，再利用TCMSP數(shù)據(jù)庫中的Related Targets對活性成分相關靶點進行預測。

1.2 COVID-19靶點預測

利用GeneCards(https：//www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫對COVID-19相關靶點進行篩選。使用關鍵詞“Novel coronavirus pneumonia”等相關詞條得到疾病相關靶點。

1.3 藥物-疾病靶點預測

將王琦教授新冠肺炎預防方1與方2相關靶點分別與與疾病相關靶點取交集，并繪制韋恩圖，將結果導出。

1.4 靶點蛋白互作網絡構建

利用String在線數(shù)據(jù)庫對靶點的蛋白間相互作用(protein protein interaction，PPI)進行分析，將靶點信息導入String數(shù)據(jù)庫，物種選擇“Homo sapiens”，導入Cytoscape軟件并進行節(jié)點度(Degree)分析，并運用Cytoscape軟件構建靶點-信號通路網絡圖，進一步說明靶點和信號通路在王琦新冠肺炎預防方中預防COVID-19的作用。

1.5 GO富集和KEGG通路富集分析

將節(jié)點度高于平均值的靶點作為兩組方劑的關鍵靶點，將關鍵靶點輸入至DAVID 6.8，將其結果導出，以P值≤0.01為條件篩選通路。最后通過R語言對KEGG通路富集分析中篩選出來的信號通路構建氣泡圖。

2 結果

2.1 王琦教授新冠肺炎預防方活性成分篩選

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫對兩組方劑中所含的活性成分進行檢索。然后進一步利用參數(shù)OB≥30%，DL≥0.18作為條件篩選兩組方劑中的中藥成分。方1得到55個活性成分，其中蘆根1個，金銀花23個，廣藿香11個，紅景天2個，貫眾7個，虎杖10個。方2得到69個活性成分，其中蘆根1個，金銀花23個，廣藿香11個，白茅根4個，白芷22個，草果8個(表1、表2)。

表1 方1中55個主要活性成分

續(xù)表

表2 方2中69個主要活性成分

2.2 中藥中的活性成分治療疾病相關靶點的篩選

從TCMSP數(shù)據(jù)庫中的Related Targets預測得到方1中共有1223個成分相關靶點，方2中共有981個相關靶點。在Uniprot數(shù)據(jù)庫搜索其對應基因并刪除無效靶點，最終得到方1相關靶點204個，方2的相關靶點196個。從Genecards數(shù)據(jù)庫中篩選得到221個COVID-19相關靶點。將兩方中的靶點與221個COVID-19疾病靶點進行韋恩圖繪制，分別得到35、34個重合靶點，即為中藥活性成分作用于COVID-19的相關靶點(圖1、圖2)，其中包括基質金屬蛋白酶(MMP)、白 細 胞 介 素(IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10等)。

圖1 新冠肺炎預防方1與COVID-19重合的靶點韋恩圖

圖2 新冠肺炎預防方2與COVID-19重合的靶點韋恩圖

續(xù)表

2.3 蛋白互作網絡構建

將得到的疾病-藥物相關靶點導入至STRING數(shù)據(jù)庫的Multiple proteins工具中，獲得蛋白互作網絡，將其導入到Cytoscape軟件中，對網絡進行進一步優(yōu)化并作網絡節(jié)點度分析(圖3、圖4)。圖3中有35個節(jié)點，412條邊，平均度值為23.543，圖4中有34個節(jié)點，390條邊，平均度值為22.941。圖中紫色橢圓形代表節(jié)點度值高于平均值的靶點，藍色菱形代表節(jié)點度值低于平均值的靶點。

圖3 方1蛋白互作用網絡

圖4 方2蛋白互作用網絡

2.4 GO富集以及KEGG富集分析

找到方1中的關鍵作用靶點35個，方2中的關鍵作用靶點34個，導入至DAVID工具中，運用GO和PATHWAY功能對關鍵作用靶點進行分析，在GO富集分析中，根據(jù)P＜0.05分別確定了53、57個GO條目，其中方1與生物過程相關的條目有45個，包括免疫反應、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、宿主共生體生長的負調控、細胞對脂多糖的反應等。方2與生物過程相關的條目有49個。包括免疫反應、炎癥反應、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控等；兩方與細胞成分相關的條目均有3個，分別為細胞外空間、質膜外側面、細胞外基質；方1與分子功能相關的條目有5個，為細胞因子活性、生長因子活性、趨化因子活性、肝素結合、CXCR趨化因子受體結合(表2)。方2與分子功能相關的條目有6個，細胞因子活性、生長因子活性、趨化因子活性、腫瘤壞死因子受體結合(表3、表4)。圖5和圖6為GO富集分析圖，圖中藍色代表基因個數(shù)，藍色條越長表示該條目富集的基因越多；橙色代表P值，橙色條越長代表P值越小。

圖5 方1GO富集結果分析

圖6 方2 GO富集結果分析

表3 新冠肺炎預防方1與COVID-19相關的GO條目

表4 新冠肺炎預防方2與COVID-19相關的GO條目

在KEGG富集分析中，根據(jù)P值(P＜0.001)分別篩選出27、29條信號通路，均包括細胞因子-細胞因子-受體相互作用、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、Toll樣受體信號通路。取前20作氣泡圖(圖7、圖8)，圖中氣泡越大表明通路富集的基因越多，顏色越紅表明P值越小。

圖7 預防方1與COVID-19相關的KEGG氣泡圖

圖8 預防方2與COVID-19相關的KEGG氣泡圖

3 討論

兩方中的主要活性成分為金銀花、虎杖、草果中的槲皮素；金銀花、虎杖中的木犀草素，金銀花、虎杖、白茅根、白芷中的β-谷甾醇；金銀花、紅景天、貫眾中的山奈酚；蘆根、金銀花、白茅根、白芷中的植物甾醇。槲皮素具有神經保護、抗氧化、消炎、抗凋亡作用[5]，可能通過上調SIRT1抑制炎癥因子IL-6的表達，減輕炎癥反應[6]；山奈酚、木犀草素可抑制炎癥介質，調節(jié)免疫力[7]；木犀草素可抑制促炎性細胞因子TNF-α、IL-6的分泌[8]并且具有一定的抗病毒作用[9]；β-谷甾醇有抗炎作用[10]，并對急性肺損傷有較好的保護作用[11]；植物甾醇具有抗炎和免疫調節(jié)等方面的作用[12]。研究表明，病毒感染引發(fā)的炎癥因子主要包括IL-6、IL-1β等[13]，而預防方中的主要活性成分槲皮素、木犀草素對于IL-6有較強的親和性，可以作用于IL-6調節(jié)多條信號通路[14]。MAPK被認為是冠狀病毒潛在靶標[15]，在兩方的蛋白互作網絡圖中也可見其節(jié)點度較高；對于其他受體如ACE2[16]、Spike、TMPRSS2、Cathepsin B/L[17]等則未見預防方對其的作用。

細胞因子與細胞因子受體的相互作用，TNF信號通路，Toll樣受體信號通路都與炎癥密切相關。TNF信號通路在調節(jié)免疫細胞中起重要作用，能夠抑制病毒復制的經由產生IL1和IL6的細胞；Toll樣受體是免疫識別的重要介體，通過識別病原體相關的分子模式來啟動先天性免疫應答以及激活適應性免疫應答[18]。另外，芳香藥如藿香、白芷、草果等，可辟穢化濁、健脾除濕，同時具有一定的抗菌、抗病毒、抗炎作用[19]。

COVID-19對于有慢性基礎性疾病的中老年人影響較大[20,21]，由于治療COVID-19尚無特效藥[22]，因此更應發(fā)揮中醫(yī)藥對病毒的防治作用。鄭文科等[23]認為，此次疫情為濕毒疫，病位主要在肺與脾，具有明顯的濕毒裹挾之癥，因此纏綿難愈且易復發(fā)。金鎮(zhèn)雄等[24]認為在治療疾病的前三階段應以化濕為主，并根據(jù)疾病不同階段選方用藥。因此，在預防階段應著重增強人體衛(wèi)氣，并增加健脾利濕藥，以化濕避穢為主，減少人體中的濕毒伏邪，以降低疾病易感性。藿香芳香化濕和胃辟穢；銀花清熱解毒、蘆根清熱生津，二藥均有抗上呼吸道及肺部感染的功用，曾在非典時期得到廣泛運用，因此作為兩方的基礎中藥。方1根據(jù)病毒“喜濕”的特點，加入虎杖、貫眾抗病毒，并有清熱解毒，芳香辟穢，利濕避瘟的功效；再加入紅景天補氣清肺、益智養(yǎng)心，又能加強抗病毒的作用，清中有補，擴大了該方的適用面；諸藥合用，共奏清熱解毒，芳香化濕辟穢之功。方2中白茅根涼血止血、清熱生津；白芷祛風除濕，配合草果燥濕溫中祛痰，更適宜中焦虛寒的陽虛人群。兩方可根據(jù)人群體質給予不同的預防措施，一祛濕熱，一祛寒濕，更能體現(xiàn)因人制宜、辨體用方的原則。

4 不足與展望

國務院聯(lián)防聯(lián)控機制在2020年2月指出，“Novel coronavirus pneumonia”是“新型冠狀病毒肺炎”的英文全稱。在Genecards使用相關詞條搜索COVID-19相關靶點，幾乎可以覆蓋新冠肺炎癥狀的大部分靶點，但由于搜索時間較早，相關研究較少，不能涵蓋全部COVID-19靶點。對于結果有部分通路和靶點可能對COVID-19產生影響，但不排除其結果中的假陽性，還需進一步臨床試驗。

目前新冠肺炎疫情已基本控制，但在疫苗廣泛使用前，如何在人員密集區(qū)進行防控依舊是需要關注的問題。本研究通過網絡藥理學方法對王琦教授新冠肺炎預防方中活性成分、靶點和通路進行分析，闡釋了該方多成分、多靶標、多通路的作用機制，揭示了預防方對于預防COVID-19的可能活性成分，為中藥內服預防COVID-19提供了一定的理論基礎。