利用R基因RRS1/RPS4探索水稻原生質(zhì)體瞬時表達(dá)轉(zhuǎn)化體系的研究

李 麗，趙彥豐，吳琪琦，黃 燕

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 雅安 625014）

植物歷經(jīng)漫長歲月，在與病原微生物的協(xié)同進(jìn)化過程中逐漸形成了復(fù)雜的免疫系統(tǒng)，包括PTI（PAMP-triggered immunity）和 ETI（effector-triggered immunity）兩大類[1]。其中，介導(dǎo)ETI反應(yīng)的胞內(nèi)受體被命名為抗性R（resistance）蛋白，根據(jù)其結(jié)構(gòu)域的不同可以分為5大類，NLR（nucleotide bindingleucine rich repeat）類R蛋白數(shù)量最多且研究最為深入[2]。這類R蛋白因包含中心核苷酸結(jié)合位點(diǎn)和C端富含亮氨酸的重復(fù)序列而得名，根據(jù)N末端結(jié)構(gòu)域的差異又可細(xì)分為TIR（toll-interleukin-1 receptor）NLR 即 TNL 型和 CC（coiled-coil）NLR 即 CNL型[3]。單個NLR R蛋白在多數(shù)情況下已經(jīng)足以用于某一效應(yīng)因子的識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的活化[4-6]，但近年來的研究也鑒定出了多個需要配對才能正確行使功能的NLR蛋白對，例如CSA1/CHS3（constitutive shadeavoidance1/Chilling sensitive3）和 RRS1/RPS4（resistance toRalstoniaSolanacearum1/resistant toPseudomonas Syringae4）就需要相互結(jié)合后才能對多個不同效應(yīng)因子進(jìn)行正確識別，進(jìn)而提高植物對不同病原菌的抵抗能力[7-11]。識別發(fā)生后，TNL型和CNL型R蛋白介導(dǎo)的通路分別依賴于EDS1（enhanced disease susceptibility 1）和 NDR1（non-race specific disease resistance 1）蛋白去激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起包括水楊酸積累、活性氧爆發(fā)、促病程相關(guān)基因表達(dá)等一系列免疫反應(yīng)，最終誘發(fā)受侵染部位的細(xì)胞發(fā)生程序性死亡來有效地抑制病原菌生長和繁殖[12-13]。

以擬南芥（Arabidopsisthaliana）為代表的雙子葉植物基因組中存在編碼上述兩種R蛋白類型的基因，而以水稻（OryzasativaL.）為代表的單子葉植物則僅存CNL型編碼基因。有趣的是，盡管缺失了TNL型R蛋白，但其下游信號通路中的必須元件EDS1在單子葉植物中依然存在，且與雙子葉植物的EDS1具有較高的序列同源性。在擬南芥中，EDS1蛋白作為植物免疫信號網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)，既正調(diào)控植物對病原微生物的基礎(chǔ)抗性，也是TNL介導(dǎo)ETI免疫應(yīng)答不可或缺的組成部分，在基礎(chǔ)免疫和ETI反應(yīng)中都扮演著重要角色[14]。最新的研究揭示，與AtEDS1功能相似，OsEDS1也可能參與了水稻的基礎(chǔ)抗病免疫反應(yīng)[15-16]。那么，OsEDS1是否也參與ETI反應(yīng)呢？為解答這一疑問，可利用水稻系統(tǒng)表達(dá)擬南芥中編碼TNL的R基因，并檢測這些R基因能否依賴水稻內(nèi)源的EDS1去激活下游信號通路從而誘導(dǎo)與擬南芥相同或相似的抗病免疫反應(yīng)。要實(shí)現(xiàn)將擬南芥基因?qū)胨局羞M(jìn)行功能研究，方法一般有兩種：一是構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的水稻轉(zhuǎn)基因株系，該方法涉及組織培養(yǎng)技術(shù)，存在操作復(fù)雜、易染菌、篩選困難且周期長等問題；二是利用水稻原生質(zhì)體對目標(biāo)基因進(jìn)行瞬時表達(dá)，該方法通過水稻自身的合成、修飾以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白機(jī)制，短時間內(nèi)可完成目的基因的高水平表達(dá)，得到的結(jié)果較可靠、具有一定的參考價值[17]。因此，利用水稻原生質(zhì)體瞬時表達(dá)體系開展功能基因表達(dá)水平研究是一個可行且快捷有效的辦法[16，18]。

目前，對于水稻細(xì)胞原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化的研究主要集中在PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法上，采用該法的水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率從40%～80%不等[19]。與電穿孔和顯微注射相比，PEG介導(dǎo)法在植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用較為廣泛與成熟[20]。水稻因其木質(zhì)部靠近表皮、厚壁細(xì)胞存在于維管束鞘與表皮之間等細(xì)胞結(jié)構(gòu)的原因，原生質(zhì)體提取比較困難，在相關(guān)報(bào)道中有通過水稻葉鞘、葉片、幼莖、懸浮細(xì)胞系等探索不同的提取、轉(zhuǎn)化途徑，但是尚沒有最佳的水稻瞬時表達(dá)體系[17-18，21-22]。

本研究以日本晴野生型水稻的幼苗為試驗(yàn)材料，通過酶解法提取原生質(zhì)體，并利用Box-Benhnken設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化PEG濃度、質(zhì)粒濃度和PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化溫度，分析各變量相互作用對原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響，從而獲得最佳的轉(zhuǎn)化體系組合。再利用本研究構(gòu)建的水稻原生質(zhì)體瞬時表達(dá)體系對擬南芥TNL型R基因—RRS1/RPS4能否誘導(dǎo)水稻下游抗病免疫的發(fā)生進(jìn)行一個初步、快速的檢測，為以水稻原生質(zhì)體為實(shí)驗(yàn)平臺的研究提供技術(shù)支持和數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.2 試驗(yàn)試劑

1/2 MS固體培養(yǎng)基；酶解液（0.6 mol/L甘露醇，10 mmol/L MES pH 5.7，1.5%Cellulase RS1，0.75%Macerozyme R10，0.1%BSA，1 mmol/L CaC12）；W5（154 mmol/L NaCl，125mmol/LCaC12，5mmol/L KC1，2 mmol/L MES pH 5.7）；MMG（0.6 mol/L 甘露醇，15 mmol/L MgC12，4 mmol/L MES pH 5.7）；培養(yǎng)液（0.6 mol/L mannitol，4 mmol/L MES pH 5.7，4 mmol/L KC1）；PEG 轉(zhuǎn)化液（0.6 mol/L甘露醇，100 mmol/L CaC12，PEG-4000：30%、35%、40%）。RNA 提取試劑盒（EASYspin植物RNA快速提取試劑盒）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit）、實(shí)時熒光定量PCR試劑盒（SYBR?Green Realtime PCR Master Mix）。

上述試劑，纖維素酶Cellulose RS和離析酶Macerozyme R10購自日本YAKULT公司，甘露醇、CaCl2、MgCl2購自美國 Segma 公司、MES 購自索萊寶科技有限公司，其余試劑均為分析純試劑、RNA提取試劑盒購自博邁德基因技術(shù)有限公司、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司、實(shí)時熒光定量PCR試劑盒購自索萊寶科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)備

RDN型人工氣候箱（東南儀器260B-4）；超凈工作臺（AIRTECH SW-CJ-ZFD）；超低溫冰箱（Thermo UXF30086V）；恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒THZ-300C）；電動分液器（Eppendorf SNP43151D）；高壓蒸汽滅菌鍋（SANYO MLS-3780）；臺式冷凍離心機(jī)（Thermo SORVALL ST8R，Eppendorf Centrifuge 5804R）；生物熒光顯微鏡（OLYMPUS BX53）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州智博瑞儀器制造有限公司）；Kp-1型手提式真空泵（科億隆實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；超微量分光光度計(jì)（Thermo NanoDrop 2000）；實(shí)時熒光定量PCR儀（BIO-RAD CFX Connect）、型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀（BIORAD DYY-Ⅲ-6B）、型垂直板電泳槽（BIO-RAD DYY-Ⅲ）、凝膠成像儀（BIO-RAD Universal HoodⅡ）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 水稻日本晴幼苗的培養(yǎng)

取健康的水稻日本晴種子剝?nèi)シf殼，75%乙醇消毒1 min，滅菌蒸餾水沖洗2次；加入5%的次氯酸消毒30 min，其間放入搖床中震蕩。用滅菌蒸餾水在超凈工作臺中沖洗10次。接種于1/2 MS培養(yǎng)基中，在溫度（25±3）℃、濕度40%、光照5 500 lx、12 h光照/12 h黑暗條件下培養(yǎng)10～14 d后，用于幼莖原生質(zhì)體制備。

1.4.2 原生質(zhì)體的分離

取健康的水稻幼苗，去根和葉，剩下部分切成0.5～1 mm的片段。將片段置于裝有酶解液（需要過濾滅菌）的錐形瓶中，黑暗條件下，25℃，50 r/min的搖床上，酶解5 h，酶解期間，用顯微鏡檢查酶解情況，酶解完全的原生質(zhì)體呈現(xiàn)獨(dú)立的、大而飽滿的圓球狀。

1.4.3 原生質(zhì)體的純化

酶解液中加入等體積的W5溶液，輕輕混勻，300目尼龍布過濾，收集濾液于50 mL離心管中，重復(fù)操作上述，直至濾液澄清。4℃，1 200 r/min離心5min收集原生質(zhì)體。用真空泵吸去上清，加入W5重懸，離心，收集原生質(zhì)體。將收集到的原生質(zhì)體，利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器定量細(xì)胞計(jì)數(shù)，用MMG重懸稀釋至2×106個/mL備用。

1.4.4 原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化

1.4.5 原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化率單因素優(yōu)化

以原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化效率為指標(biāo)，研究PEG濃度（30%、35%、40%），質(zhì)粒濃度（0.5、1、2 μg/μL）和轉(zhuǎn)化時溫度（0、18、37℃）條件下對原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化率的影響。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.4.6 原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化效率計(jì)算

以單獨(dú)轉(zhuǎn)入HBT95啟動子驅(qū)動的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）瞬時表達(dá)載體檢測轉(zhuǎn)化效率。按照公式計(jì)算轉(zhuǎn)化率：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率=（激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光的原生質(zhì)體數(shù)/明場下所有原生質(zhì)體數(shù)）×100%。

1.4.7 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

根據(jù)1.4.5單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以PEG濃度（A）、質(zhì)粒濃度（B）和轉(zhuǎn)化時溫度（C）3個因素為自變量，以原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)，采用Minitab 17.1.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.4.8 預(yù)測轉(zhuǎn)化條件的驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面分析，得到最佳轉(zhuǎn)化條件組合為PEG 濃度 36.16%、質(zhì)粒濃度 1.72 μg/μL、轉(zhuǎn)化溫度37℃。通過試驗(yàn)對此條件組合進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4.9 水稻原生質(zhì)體RNA的提取

使用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒進(jìn)行原生質(zhì)體RNA的提取。為了富集足夠多的原生質(zhì)體用于RNA的提取，每個樣品做6組平行，最后合成一管用于RNA提取，提取方法按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.10 逆轉(zhuǎn)錄

使用TaKaRa PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit對提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板，逆轉(zhuǎn)錄方法按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.11 實(shí)時定量PCR檢測目的基因表達(dá)

使用上述cDNA進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)，以水稻肌動蛋白基因（ACTIN1）為內(nèi)參基因，檢測水稻ETI下游抗病相關(guān)基因的表達(dá)水平。基因引物序列見表1，實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系見表2。

表1 基因引物序列Table 1 Gene and primer sequences

表2 實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系Table 2 Realtime PCR reaction system

實(shí)時定量PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃，1 min，變性 95 ℃，15 s，退火 55 ℃，15 s，延伸 72 ℃，30 s，返回第二步循環(huán)（39次）熔解曲線65℃→95℃，每5 s升溫0.5℃

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率

表3 在不同條件處理下水稻原生質(zhì)體中GFP的瞬時表達(dá)比較Table 3 Comparison of transient expression of GFP in rice protoplasts in different conditions

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

為進(jìn)一步闡明水稻日本晴莖部原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率究竟如何受PEG濃度、質(zhì)粒濃度和轉(zhuǎn)化溫度3種轉(zhuǎn)化條件的影響，本研究采用Minitab 17.1.0對試驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率為響應(yīng)值（Y），考察 PEG 濃度（A）、質(zhì)粒濃度（B）和轉(zhuǎn)化溫度（C）3個因素及因素間交互作用對響應(yīng)值的影響（表4）。運(yùn)用ANOVA分析，對表4中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得出水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率（Y）與 PEG 濃度（A）、質(zhì)粒濃度（B）和轉(zhuǎn)化溫度（C）之間的二次多項(xiàng)回歸方程模型：

Y=-6.560+40.59A+0.211B-0.017 30C-59.35A2-0.133 5B2+0.000 032C2+0.448AB+0.042 1AC+0.002 32BC

對上述擬合模型進(jìn)行回歸分析，可知PEG濃度、質(zhì)粒濃度和轉(zhuǎn)化溫度以及它們之間的交互作用影響原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的情況，分析結(jié)果如表5所示?？梢钥闯觯耗Ｐ蚉＜0.01，表明該模型影響極顯著；模型中失擬項(xiàng)P＜0.01，表明模型能充分反映試驗(yàn)真實(shí)情況，回歸模型合理；R-sq值為96.73%，說明二次多項(xiàng)式回歸效果良好，可以用來預(yù)測原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的最優(yōu)條件組合。

從各單因素對原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的顯著性分析可以看出，單因素中質(zhì)粒濃度（B）和轉(zhuǎn)化溫度（C）的P值分別為0.001和0.025，表明二者對原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率具有顯著影響；而PEG濃度（A）對應(yīng)的P值為0.103，說明該因素對原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響不顯著。因素間交互效應(yīng)中，AB、AC和BC的P值分別為0.278、0.030和0.059，表明AC交互效應(yīng)顯著，而AB和BC的交互效應(yīng)不顯著。而F值用于評估各因素對原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響程度，根據(jù)該值大小我們得出結(jié)論：各因素對原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率影響程度從大到小排序分別為質(zhì)粒濃度、轉(zhuǎn)化溫度以及PEG濃度。

2.3 交互作用分析

為了進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用，用Minitab 17.1.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制響應(yīng)面圖（圖1），在固定一個因素不變的條件下，分析另外兩個因素之間的交互作用。在圖1B、D、F中，X和Y軸表示兩個因素參數(shù)Z軸表示轉(zhuǎn)化效率。圖1A、C、D為等高線圖，它的密集程度和圖形中心形狀可以直觀地反映出兩變量交互作用的顯著程度。由圖1A和B可知，在轉(zhuǎn)化溫度為37℃條件下，轉(zhuǎn)化效率隨PEG濃度和質(zhì)粒濃度的增加，呈現(xiàn)先增后降的趨勢；由等高線的疏密分布及響應(yīng)面的傾斜程度可知，二者的交互作用對轉(zhuǎn)化效率有一定的影響，隨響應(yīng)曲面沿質(zhì)粒濃度方向的曲面陡峭程度較PEG濃度方向更大，說明質(zhì)粒濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響比PEG濃度更加顯著，但是二者的交互作用對轉(zhuǎn)化效率的影響并不明顯。由圖1C和D可知，當(dāng)質(zhì)粒濃度為1.72 μg/μL時，水稻原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率隨PEG濃度增加，呈現(xiàn)出先增后降趨勢，而隨轉(zhuǎn)化溫度的增加，轉(zhuǎn)化效率呈逐步遞增的趨勢；等高線較密、響應(yīng)面較陡，說明PEG濃度和轉(zhuǎn)化溫度有交互作用，且對轉(zhuǎn)化效率影響顯著，響應(yīng)曲面沿PEG濃度方向的曲面陡峭程度較轉(zhuǎn)化溫度方向更大，說明PEG濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響較轉(zhuǎn)化溫度更為顯著。由圖1E和F可知，當(dāng)PEG濃度為36.16%時，轉(zhuǎn)化效率隨質(zhì)粒濃度增加，呈先增后降的趨勢；隨轉(zhuǎn)化溫度增加，轉(zhuǎn)化效率呈逐步遞增的趨勢；響應(yīng)曲面平緩、等高線稀疏，說明轉(zhuǎn)化溫度與質(zhì)粒濃度之間交互作用對轉(zhuǎn)化效率的影響不顯著，且響應(yīng)曲面沿質(zhì)粒濃度方向的曲面陡峭程度較轉(zhuǎn)化溫度方向更大，說明PEG濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響比轉(zhuǎn)化溫度更顯著。

圖1 PEG濃度、質(zhì)粒濃度和轉(zhuǎn)化時溫度對原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率交互影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Figure 1 Contour and response surface diagrams of the interaction of PEG concentration，plasmid concentration and conversion temperature on protoplast conversion efficiency

根據(jù)響應(yīng)面分析，利用Minitab 17.1.0軟件繪圖以確定水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化最優(yōu)條件組合。如圖2所示，轉(zhuǎn)化效率隨著PEG濃度的增加逐漸升高，但在36.16%時達(dá)到最高，圖像成拋物線型，所以轉(zhuǎn)化的最佳PEG濃度為36.16%。同樣，隨著轉(zhuǎn)入質(zhì)粒濃度的增加轉(zhuǎn)化效率不斷上升，但在質(zhì)粒濃度達(dá)到1.72 μg/μL時，達(dá)到轉(zhuǎn)化效率最高值，且隨著質(zhì)粒濃度繼續(xù)增加，轉(zhuǎn)化效率反而降低，圖像成拋物線型，說明質(zhì)粒濃度的最佳水平為1.72 μg/μL。在0～37℃范圍內(nèi)，最佳轉(zhuǎn)化效率出現(xiàn)在轉(zhuǎn)化溫度為37℃時，隨著溫度的增加轉(zhuǎn)化效率可能會繼續(xù)增加，也可能在37℃時就是峰值，但37℃及以上的溫度對植物細(xì)胞具有脅迫作用。因此，預(yù)測得出水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化最佳條件組合為PEG濃度36.16%、質(zhì)粒濃度1.72 μg/μL、轉(zhuǎn)化溫度37℃時轉(zhuǎn)化效率最高可達(dá)71%。

圖2 水稻原生質(zhì)體最佳轉(zhuǎn)化條件Figure 2 Optimum conditions for rice protoplast transformation

2.4 預(yù)測轉(zhuǎn)化條件的驗(yàn)證

對響應(yīng)面分析得到的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件組合：PEG濃度36.16%、質(zhì)粒濃度1.72 μg/μL、轉(zhuǎn)化溫度37℃進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)化后，明場觀察原生質(zhì)體個數(shù)為33，其中發(fā)光原生質(zhì)體個數(shù)為25，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到75%，與預(yù)測相符。

圖3 預(yù)測條件下水稻原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化效率檢測Figure 3 Detection of transient transformation efficiency of rice protoplasts under predicted conditions

2.5 實(shí)時定量PCR檢測目的基因表達(dá)水平

為檢測瞬時表達(dá)體系中R基因是否轉(zhuǎn)化成功并誘發(fā)水稻的抗病能力，我們選取具有熒光的原生質(zhì)體細(xì)胞提取總mRNA，以ACTIN1作為內(nèi)參檢測水稻抗病相關(guān)基因PR1a、PBZ1的相對表達(dá)水平。以單轉(zhuǎn)空載質(zhì)粒的原生質(zhì)體為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別瞬時表達(dá)RRS1、RPS4的單基因轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體中OsPR1a的表達(dá)量比對照提高6～7倍左右（圖4），OsPBZ1的表達(dá)水平也提高了3～4倍左右（圖5）；而雙基因共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體中OsPR1a和OsPBZ1的表達(dá)水平則提高至27～28倍左右，差異達(dá)到極顯著水平。該結(jié)果表明水稻原生質(zhì)體中瞬時表達(dá)擬南芥TNL型R基因特別是共表達(dá)RRS1與RPS4時能顯著誘導(dǎo)水稻ETI下游抗病相關(guān)基因PR1a、PBZ1的表達(dá)。

圖4 水稻抗病基因PR1a在不同原生質(zhì)體中的表達(dá)水平比較Figure 4 Comparison of expression levels of rice disease resistance gene PR1a in different protoplasts

圖5 水稻抗病基因PBZ1在不同原生質(zhì)體中的表達(dá)水平比較Figure 5 Comparison of expression levels of rice disease resistance gene RBZ1 in different protoplasts

3 討論與結(jié)論

3.1 水稻原生質(zhì)體培養(yǎng)和瞬時表達(dá)轉(zhuǎn)化體系的最佳條件

本研究選取兩葉一心期日本晴的莖部細(xì)胞進(jìn)行原生質(zhì)體的分離、培養(yǎng)和瞬時轉(zhuǎn)化，成功獲得了單基因和雙基因的轉(zhuǎn)化體。在最佳條件摸索中，我們發(fā)現(xiàn)水稻原生質(zhì)體制備與苗齡和取材部位有較大關(guān)聯(lián)。即種植后10～14 d內(nèi)的植株能夠得到數(shù)量較多、質(zhì)量較佳的原生質(zhì)體。同時由于水稻葉片的表皮與葉肉細(xì)胞木質(zhì)部臨近，維管束鞘和表皮之間具有較多的厚壁細(xì)胞，不利于酶解；而幼莖除了韌皮部、木質(zhì)部及維管束鞘等較為堅(jiān)硬的細(xì)胞外，多由薄壁細(xì)胞組成，以酶解法來制備原生質(zhì)體較為容易。我們在原生質(zhì)體個數(shù)大約為2×106個/mL時，取質(zhì)粒量 10 μL，最終轉(zhuǎn)化體系 210 μL，轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)12 h，得到最佳轉(zhuǎn)化條件：PEG濃度36.16%、質(zhì)粒濃度1.72 μg/μL、轉(zhuǎn)化溫度37℃時轉(zhuǎn)化效率最高可達(dá)71%，且經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證該轉(zhuǎn)化條件下轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到75%左右。在試驗(yàn)過程中，PEG濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響較小，當(dāng)PEG濃度在34%～40%之間時，轉(zhuǎn)化效率都可達(dá)60%～70%，大多數(shù)文獻(xiàn)中水稻轉(zhuǎn)化試驗(yàn)都使用40% PEG[23-24]。而質(zhì)粒濃度對原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率影響較大，質(zhì)粒濃度在1.5～2 μg/μL時轉(zhuǎn)化效率較高，低于了1 μg/μL則顯著降低轉(zhuǎn)化效率。而此前對質(zhì)粒濃度影響的研究發(fā)現(xiàn)，p35S-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻幼莖及葉鞘的原生質(zhì)體，當(dāng)原生質(zhì)體數(shù)1～5×106個/mL時，質(zhì)粒濃度增加到5 μg/μL時，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)60%～70%[25]，達(dá)到相同轉(zhuǎn)化效率較本文所用質(zhì)粒濃度更高，而另有研究在原生質(zhì)體個數(shù)1～5×104個/mL時，取質(zhì)粒 10 μL，僅在質(zhì)粒濃度為 0.7 μg/μL 時，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)60%～70%[24]。這些研究數(shù)據(jù)表明質(zhì)粒的濃度對轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生的影響可能與原生質(zhì)體的個數(shù)相關(guān)，并不是單一的影響。由于前人報(bào)道，通過短暫42℃熱激，室溫5 min轉(zhuǎn)至42℃5 min處理后能略微提高水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率[26]，因此，我們設(shè)置了冰浴和37℃兩個對原生質(zhì)體都有略微刺激性的溫度，并發(fā)現(xiàn)兩種溫度處理與室溫（18℃）相比，轉(zhuǎn)化效率均有所提高，且在37℃熱激下轉(zhuǎn)化效率更高。

3.2 擬南芥TNL型R基因的導(dǎo)入可以提高水稻內(nèi)源ETI下游抗病基因的表達(dá)水平

水稻作為單子葉植物生物學(xué)研究的模式植物，其在功能基因研究等方面也具有重要的作用。水稻基因組包含900多個病程相關(guān)（PR，Pathogenesisrelated）基因，其編碼的PR蛋白根據(jù)其結(jié)構(gòu)的不同可分為17個亞類。PR1家族的PR1a和PR1b的轉(zhuǎn)錄水平因易受病原菌誘導(dǎo)而常被選作ETI抗病反應(yīng)發(fā)生的分子標(biāo)記；PBZ1蛋白結(jié)構(gòu)保守且功能多樣，研究發(fā)現(xiàn)其在植物ETI免疫中也發(fā)揮著重要的作用[27-28]。因此，本試驗(yàn)選擇PR1a和PBZ1作為水稻ETI途徑的抗病標(biāo)志基因。利用本研究構(gòu)建的水稻原生質(zhì)體瞬時表達(dá)體系，將擬南芥TNL類型R基因RRS1、RPS4分別單轉(zhuǎn)或共轉(zhuǎn)到水稻原生質(zhì)體中，發(fā)現(xiàn)單轉(zhuǎn)、共轉(zhuǎn)均可以提高水稻內(nèi)源PR1a和PBZ1的表達(dá)水平，并且共轉(zhuǎn)的誘導(dǎo)作用更加顯著。該試驗(yàn)結(jié)果表明，盡管水稻基因組缺失了TNL類型編碼基因，但將擬南芥的這類基因在水稻原生質(zhì)體中表達(dá)能夠誘導(dǎo)其內(nèi)源ETI下游抗病相關(guān)基因PR1a和PBZ1的表達(dá)，預(yù)示著OsEDS1也可能參與了ETI反應(yīng)，因而擬南芥TNL類型R基因可以依賴水稻內(nèi)源的EDS1去激活下游信號通路來誘導(dǎo)與擬南芥相同或相似的抗病免疫反應(yīng)。根據(jù)本次瞬轉(zhuǎn)結(jié)果，接下來，一方面我們將在水稻原生質(zhì)體中瞬時表達(dá)其他的TNL類型R基，以測試該誘導(dǎo)作用是否具有特異性；另一方面通過構(gòu)建表達(dá)TNL類型R基因?qū)Φ乃巨D(zhuǎn)基因株系，進(jìn)一步解析其涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及參與元件，以期望鑒定篩選出更多的參與抗病的新基因，并通過對它們功能的解析來豐富禾本科作物抗病免疫的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。