基于GEO數(shù)據(jù)庫篩選狼瘡性腎炎的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路

劉 音，楊 濤，謝裕賽，王玉柱

1.北京市海淀醫(yī)院腎內(nèi)科，北京100080；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，沈陽110122

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其特征是自身抗體產(chǎn)生、補(bǔ)體激活和免疫復(fù)合物沉積。每年全球范圍內(nèi)SLE 的發(fā)生率在0.003%～0.232%［1］。狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是SLE患者中最常見、最嚴(yán)重的器官表現(xiàn)之一，其特征通常是血尿、蛋白尿和腎小球?yàn)V過率受損［2］。約50%的SLE 患者會(huì)發(fā)展為臨床特征明顯的腎臟疾病，其中11%的患者在病程5年時(shí)會(huì)發(fā)展為終末期腎臟疾?。╡nd-stage renal disease，ESRD）［3-4］。LN 是導(dǎo)致SLE 患者發(fā)展至ESRD 和死亡的重要原因。LN 的初始和后續(xù)治療主要由免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素組成，這意味著幾乎沒有有效且特異性的療法。因此，研究LN 涉及的分子機(jī)制對(duì)于LN的臨床治療具有重要意義。

LN 的病理生理機(jī)制復(fù)雜。在LN 患者的不同腎小球區(qū)室中，免疫復(fù)合物的形成、先天性免疫信號(hào)途徑的激活、免疫細(xì)胞的滲透和促炎癥介質(zhì)可通過多種途徑損害腎小球細(xì)胞［5］。盡管許多研究已經(jīng)確定了LN 的某些病理機(jī)制，但其發(fā)病機(jī)制仍不清楚。

在基因組水平上追蹤LN 的生物學(xué)變化是一種值得關(guān)注的策略。近年來，許多學(xué)者已經(jīng)進(jìn)行了基因測(cè)序技術(shù)與生物信息學(xué)分析相結(jié)合的研究，以鑒定可能與預(yù)后生物標(biāo)志物有關(guān)的疾病相關(guān)基因，并在未來將其開發(fā)為治療靶標(biāo)。生物信息學(xué)分析可以在極短的時(shí)間內(nèi)處理大量的樣品，并提供有關(guān)疾病的有價(jià)值的信息，而且與SLE密切相關(guān)的幾個(gè)基因已經(jīng)確定，可以驅(qū)動(dòng)研究的創(chuàng)新［6-7］。但是，很少有研究利用生物信息學(xué)分析來鑒定和分析LN背景下的腎臟組織。

盡管LN 會(huì)影響腎臟的所有組成部分，但腎小球是最適合研究的組織，并且與疾病的發(fā)病機(jī)制和治療密切相關(guān)。本研究選擇GEO 數(shù)據(jù)庫中的腎小球組織數(shù)據(jù)集GSE32591 研究LN。應(yīng)用R 語言limma 包獲取GSE32591數(shù)據(jù)集中的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）。使用DAVID 數(shù)據(jù)庫來分析這些DEGs 的GO（Gene Ontology）注釋信息，包括生物過程、細(xì)胞組分、分子功能和KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes） 通路。構(gòu)建了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction， PPI） 網(wǎng)絡(luò)， 并應(yīng)用Cytoscape 中MCODE 及Cytohubba 插件分析DEGs，鑒定并驗(yàn)證了與LN 相關(guān)的10 個(gè)樞紐基因（hub genes）。最終應(yīng)用GSE99339 數(shù)據(jù)集驗(yàn)證了樞紐基因的顯著差異表達(dá)，以期為L(zhǎng)N的診斷和治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及篩選

在GEO 公共數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）［8］中以“l(fā)upus nephritis”及“glomeruli”作為關(guān)鍵詞檢索，選擇GSE32591 數(shù)據(jù)集作為分析數(shù)據(jù)集，GSE99339 數(shù)據(jù)集作為樞紐基因驗(yàn)證數(shù)據(jù)集。下載GSE32591和GSE99339數(shù)據(jù)集矩陣數(shù)據(jù)及平臺(tái)注釋信息。GSE32591 數(shù)據(jù)集基于GPL14663 平臺(tái)，其中包含32 例LN 患者和14 例正常供體對(duì)照的腎小球組織基因表達(dá)信息；GSE99339 數(shù)據(jù)集基于GPL19184 平臺(tái)，含有30 例LN 患者和8 例腎臟腫瘤切除對(duì)照的腎小球組織基因表達(dá)信息。

1.2 篩選DEGs

應(yīng)用R 軟件（4.0.2 版） limma 包標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)及篩選差異基因［9］，以|log FC|＞1 和校正后P＜0.05 為閾值篩選差異基因。分別運(yùn)用R 語言ggpubr 和pheatmap 包對(duì)差異基因繪制火山圖及熱圖。

1.3 DEGs的功能富集分析

使用GO 分析確定樞紐基因的生物過程、細(xì)胞成分和分子功能屬性［10］，通過KEGG 數(shù)據(jù)庫確定其通路功能［11］。DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/） 是進(jìn)行基因富集分析的常用數(shù)據(jù)庫［12］。應(yīng)用DAVID 在線工具對(duì)篩選的差異表達(dá)樞紐基因進(jìn)行GO和KEGG分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，使用R語言ggplot包繪制柱狀圖及氣泡圖。

1.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)及篩選樞紐基因

STRING 數(shù)據(jù)庫常用來構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)［13］。將DEGs 輸入STRING 在線工具中，篩選combined score＞0.9 的互作蛋白。將得到的PPI 結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件中，通過分子復(fù)合物檢測(cè)（molecular complex detection，MCODE），以degree cutoff=2、node score cutoff=0.2、k-core=2 和max.depth = 100 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出PPI 中最顯著模塊［14］。在最顯著模塊中應(yīng)用Cytohubba 插件，按degree 算法計(jì)算出評(píng)分位于前10位的樞紐基因［15］。

1.5 樞紐基因的驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證正常組織和LN 組織中上述樞紐基因的表達(dá)差異，應(yīng)用GEO 數(shù)據(jù)集GSE99339 的數(shù)據(jù)，分析樞紐基因的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 DEGs的篩選

應(yīng)用limma 包對(duì)GSE32591 數(shù)據(jù)集進(jìn)行數(shù)據(jù)矯正及差異分析，以|log FC|＞1 和校正后P＜0.05 為閾值，獲得了367個(gè)DEGs，包括253個(gè)上調(diào)基因及114個(gè)下調(diào)基因。使用ggpubr包繪制DEGs的火山圖，按照校正后P值對(duì)顯著DEGs進(jìn)行排序；應(yīng)用pheatmap包繪制出前20個(gè)DEGs的表達(dá)熱圖。結(jié)果顯示，IFI27、MX1、ISG20等基因在LN中顯著高表達(dá)（圖1）。

圖1 DEGs的鑒定Fig 1 Identification of DEGs

2.2 DEGs的GO分析和KEGG信號(hào)通路分析

應(yīng)用DAVID 軟件對(duì)DEGs 進(jìn)行GO 富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析。GO 富集分析顯示這些DEGs 主要參與病毒反應(yīng)應(yīng)答、對(duì)病毒的防御反應(yīng)，并且參與Ⅰ型干擾素信號(hào)通路、活化中性粒細(xì)胞以及負(fù)調(diào)控病毒生命周期等生物過程；主要細(xì)胞成分位于質(zhì)膜外側(cè)、囊腔及膠原纖維（含細(xì)胞外基質(zhì)）；主要分子功能與Toll 樣受體結(jié)合、有機(jī)酸結(jié)合、補(bǔ)體結(jié)合及免疫受體活性等相關(guān)（圖2A）。KEGG 通路分析顯示，這些差異基因主要參與甲型流感、結(jié)核病、EB 病毒感染、金黃色葡萄球菌感染和補(bǔ)體途徑等信號(hào)通路（圖2B）。

圖2 DEGs的GO分析和KEGG通路分析Fig 2 GO analysis and KEGG pathway analysis of DEGs

2.3 DEGs編碼蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)及樞紐基因的篩選

通過STRING 在線工具和Cytoscape 軟件對(duì)367 個(gè)DEGs 進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，篩選combined score ＞0.9 的互作蛋白對(duì)。在Cytoscape中得到206個(gè)節(jié)點(diǎn)，831條相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖（圖3A）。在PPI 網(wǎng)絡(luò)中，利用Cytoscape 內(nèi)的MCODE 插件， 以 degree cutoff = 2、 node score cutoff = 0.2、k-core = 2 和max.depth = 100 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出最顯著模塊。最顯著模塊包括22 個(gè)重要節(jié)點(diǎn)及227 條相互作用（圖3B）。對(duì)最顯著模塊運(yùn)用cytohubba 插件，以degree 算法計(jì)算出總分排名前10 位的樞紐基因，分別是IFI6、IFI27、IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFITM3、ISG15、ISG20、MX1、SAMHD1（圖3C，表1）。

圖3通過STRING和MCODE方法篩選樞紐基因Fig 3 Identification of hub genes from the DEGs by STRING and MCODE

表1 10個(gè)樞紐基因的功能Tab 1 Functions of 10 hub genes

Continued Tab

2.4 樞紐基因的驗(yàn)證

在GEO 數(shù)據(jù)庫檢索其他LN 數(shù)據(jù)集。最終選擇GSE99339 數(shù)據(jù)集，分析LN 與正常對(duì)照之間這些樞紐基因的差異表達(dá)水平（圖4）。在GSE99339數(shù)據(jù)集中，除了缺失IFITM3的探針信息，上述樞紐基因均明顯上調(diào)。說明了樞紐基因篩選結(jié)果的可靠性。

圖4 在GSE99339數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證樞紐基因在LN與正常組織之間的表達(dá)差異Fig 4 Differentially expressed levels of the hub genes between LN and normal in GSE99339 datasets

3 討論

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)尋找各種疾病樞紐基因的關(guān)注日益增加，收集到的疾病樞紐基因信息可為治療疾病提供新的手段。我們利用基于GPL14663平臺(tái)的數(shù)據(jù)集GSE32591，對(duì)32 例LN 患者的腎小球組織基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選DEGs。最終篩選出367 個(gè)DEGs，其中包括253 個(gè)上調(diào)基因和114 個(gè)下調(diào)基因；再運(yùn)用ggpubr 和pheatmap 包繪制火山圖及差異表達(dá)顯著的前20個(gè)DEGs 的表達(dá)熱圖。熱圖結(jié)果顯示，IFI27、MX1、ISG20等基因在LN 中顯著高表達(dá)，提示這些基因可能參與LN的疾病進(jìn)展。

對(duì)DEGs的功能富集分析顯示，免疫應(yīng)答、感染和干擾素相關(guān)基因參與了LN 的發(fā)病過程。GO 分析和KEGG途徑富集分析表明，DEGs 在病毒防御反應(yīng)、質(zhì)膜外側(cè)、甲型流感、結(jié)核病、EB 病毒感染和補(bǔ)體途徑等方面顯著富集，提示了LN 疾病進(jìn)展中免疫活動(dòng)的增強(qiáng)。本研究應(yīng)用Cytoscape 中MCODE 及Cytohubba 插件分析這些DEGs，鑒定了與LN 相關(guān)的最顯著模塊及10 個(gè)樞紐基因（IFI6、IFI27、IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFITM3、ISG15、ISG20、MX1和SAMHD1）。最終，應(yīng)用其他GEO 數(shù)據(jù)集（GSE99339）的數(shù)據(jù)信息，驗(yàn)證了上述樞紐基因顯著表達(dá)的可靠性。

在樞紐基因中，干擾素家族蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)，這也驗(yàn)證了之前的研究結(jié)果［16-17］。干擾素是一類信號(hào)蛋白，分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型；其中Ⅰ型干擾素是其最大的家族［18］。GO 分析結(jié)果也表明，Ⅰ型干擾素信號(hào)通路可能與SLE 的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。SLE 的大多數(shù)樞紐基因都是Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)型基因。SLE 患者顯示出較高水平的Ⅰ型干擾素及Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)型基因，這些基因在SLE 發(fā)病機(jī)制中起主要作用［19-20］。干擾素誘導(dǎo)的四肽重復(fù)序列1（IFIT1）蛋白質(zhì)也屬于Ⅰ型干擾素家族，在大多數(shù)SLE 人群中IFIT1mRNA 的表達(dá)明顯上調(diào)［21］。IFIT1是首個(gè)鑒定為主要由干擾素-α/β誘導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)和線粒體干擾素刺激基因［22］。IFIT1可調(diào)節(jié)病毒復(fù)制以及翻譯、增殖、凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等細(xì)胞過程［23］，可能與Rho/Rac鳥嘌呤核苷酸交換因子發(fā)生相互作用，從而參與SLE免疫反應(yīng)。

在本研究中，我們使用系統(tǒng)的生物信息學(xué)方法來分析LN 中腎小球組織表達(dá)信息。研究存在一些局限性，如GEO數(shù)據(jù)庫僅提供了少量LN數(shù)據(jù)集。在后續(xù)研究中，我們將進(jìn)一步收集臨床數(shù)據(jù)，以作更深入的探索。

總之，本研究使用GEO 數(shù)據(jù)庫篩選LN 腎小球組織的367 個(gè)DEGs 及10 個(gè)樞紐基因，其可能是LN 潛在的生物標(biāo)志物。生物標(biāo)志物的揭示，有助于提高臨床診斷水平和開發(fā)個(gè)性化治療方法。

參·考·文·獻(xiàn)

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