鈣磷涂層的JDBM 鎂合金多孔支架促進(jìn)血管新生及骨缺損修復(fù)的效果評估

王 青，王 偉，姜達(dá)君，賈偉濤

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院骨科，上海200233

隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的快速發(fā)展，由高能量損傷、骨腫瘤切除、人工關(guān)節(jié)周圍骨溶解等引起的骨缺損患者越來越多。而大塊骨缺損常造成骨折延遲愈合或不愈合，最終導(dǎo)致肢體功能障礙，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。目前骨缺損的治療以植骨術(shù)為主，植骨來源包括自體骨、異體骨及人工骨等。在臨床上，自體骨移植是修復(fù)骨缺損的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但自體骨移植來源有限。異體骨雖然來源較廣，但易導(dǎo)致免疫排斥反應(yīng)并有疾病傳播等風(fēng)險(xiǎn)，因而應(yīng)用受限［1-3］。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，可降解并且可塑性大的人工生物修復(fù)材料越來越受到臨床醫(yī)師的關(guān)注。組織工程支架植入體內(nèi)之后的成骨效果取決于移植物早期血管化的程度，新生血管除了可以為成骨活動(dòng)提供各種必需的營養(yǎng)物質(zhì)外，還在骨與鄰近組織器官相互作用中發(fā)揮不可或缺的作用［4］。在骨生長過程中，內(nèi)皮細(xì)胞侵入生長板區(qū)域的軟骨，形成營養(yǎng)供應(yīng)的血管通道，并作為新骨的支架促進(jìn)生長［5］；而在骨重塑過程中，毛細(xì)血管進(jìn)一步促進(jìn)成骨和破骨活動(dòng)，加速骨重塑［6］。但目前常見的組織工程支架在物質(zhì)傳遞交換方面仍然受到很大的限制［7-9］，新生血管主要集中在支架周圍，而在支架內(nèi)部缺失，使得營養(yǎng)物質(zhì)與氧氣難以運(yùn)輸?shù)街Ъ軆?nèi)部，從而導(dǎo)致支架內(nèi)部的細(xì)胞難以生長、遷移和擴(kuò)增，出現(xiàn)支架內(nèi)部空化區(qū)或壞死區(qū)［10］。

近些年鎂合金作為一種新型可植入性生物材料，具有良好的生物相容性、機(jī)械性能、生物降解性而開始廣泛用于骨外科材料的研發(fā)［11］。鎂是一種活潑金屬，質(zhì)量很輕，密度在1.74～2.00 g/cm3，與人體骨密度（1.80～2.10 g/cm3）較為接近［12］，并且鎂的彈性模量較?。?1～45 GPa），相比于鈦合金（110～117 GPa） 更接近人骨（3～20 GPa），可以有效降低應(yīng)力遮擋，在骨折愈合期間提供穩(wěn)定的力學(xué)環(huán)境［13］。此外，鎂在人體內(nèi)存在吸收和排泄的動(dòng)態(tài)平衡，生物安全性較高［14］。近年來JDBM（Mg-Nd-Zn-Zr）鎂合金系列生物材料被廣泛研究。本課題組前期研究［15-17］結(jié)果表明，該合金生物相容性較好，具備優(yōu)良的強(qiáng)度和延展性以及獨(dú)特的均勻降解行為，同時(shí)具備良好的成骨功能。在JDBM 合金表面復(fù)合可生物降解的鈣磷（CaHPO4·2H2O，DCPD）涂層，提高生物相容性和生物安全性的同時(shí)，還具備優(yōu)良的誘導(dǎo)成骨以及成血管能力，可以進(jìn)一步地促進(jìn)骨與血管再生；此外，通過調(diào)整DCPD涂層厚度，可以控制其降解速度［17-20］。

血管化是骨組織工程支架實(shí)現(xiàn)骨修復(fù)的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。隨著近些年來成血管與成骨的雙向反饋?zhàn)饔帽唤沂?，組織工程支架血管化也成為了研究人員關(guān)注的重點(diǎn)內(nèi)容。因此，本課題組在前期研究［21］JDBM-DCPD 直接成骨分化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索JDBM-DCPD 支架的體內(nèi)外成血管能力。本研究中，將覆有MgF2涂層的JDBM（JDBM-MgF2）支架作為參照，體外評估JDBM-DCPD 對內(nèi)皮細(xì)胞成血管能力的影響，并通過大鼠股骨髁臨界性骨缺損模型研究JDBM-DCPD 多孔支架植入骨缺損區(qū)域后支架內(nèi)部新生血管長入和成骨情況，為今后多孔JDBM鎂合金支架的研發(fā)應(yīng)用開拓思路、奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 磷酸鹽緩沖液（PBS），α-MEM、DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基（美國Hyclone）；胎牛血清（FBS，以色列BI）；青霉素-鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶消化液（美國Gibco）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）細(xì)胞染色試劑盒（中國Beyotime）；2%茜素紅（ARS）染料（中國Cyagen）；血管造影劑Microfil（MV-122，美國Flow Tech Inc）；CD31 抗體（貨號(hào)ab24590）、骨鈣素（osteocalcin， OCN） 抗體（貨號(hào)ab13420）（英國Abcam）；Transwell 小室（美國Corning）；血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體、Alexa Fluor484 熒光染料（美國Proteintech）；羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（美國Sigma）；細(xì)胞核熒光染料DAPI（中國Solarbio）；CCK-8 試劑盒（日本Dojindo）；Matrigel 膠（美國Corning）。

倒置光學(xué)顯微鏡（DMi3000B，德國Leica），掃描電子 顯 微 鏡 （scanning electron microscope， SEM，SIGMA500，德國Zeiss），數(shù)字X 線攝影系統(tǒng)（Digital Diagnost C50，荷蘭Philips），小動(dòng)物活體CT 成像系統(tǒng)（Skyscan 1176 Micro-CT，德國Bruker），單軸試驗(yàn)機(jī)（AG-100 kN，德國Zwick），火花等離子燒結(jié)系統(tǒng)（HPW100/150-220-50，德國FCT）

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 骨髓干細(xì)胞（bone marrow stem cell，BMSC）取自鼠齡6 周、體質(zhì)量為160～200 g 的雄性SD 大鼠。原代細(xì)胞用α-MEM 完全培養(yǎng)基（α-MEM 培養(yǎng)基+10%FBS+1%青霉素-鏈霉素雙抗）在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2 d 后，半量更換培養(yǎng)基，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，之后至少每3 d 更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)皿底部80%～90%時(shí)用胰酶消化傳代，取第3～5 代細(xì)胞用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。內(nèi)皮細(xì)胞系Ea.hy926 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，細(xì)胞用完全培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS+1%青霉素-鏈霉素雙抗）在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級雄性6 周齡（160～200 g，用于提取原代BMSC）和8 周齡（250～300 g，用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)）SD 大鼠購自上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)營部，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2018-0006。SD 大鼠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院SPF 級動(dòng)物房，使用許可證號(hào)為SYXK（滬）2016-0020。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 JDBM 多孔支架的制備以及結(jié)構(gòu)表征、力學(xué)特征的測定 JDBM 支架的制備采用模板復(fù)制法［21］，通過火花等離子燒結(jié)系統(tǒng)將直徑400～450 μm 的球形純鈦顆粒燒結(jié)成多孔模板，將浸滲鑄造后的胚體浸在40%氫氟酸溶液中溶解模板，同時(shí)形成MgF2涂層。制備60 g/L NaNO3、15 g/L CaHPO4·2H2O 和0.8 mol/L H2O2的混合溶液，采用化學(xué)沉積的方法在多孔支架的表面形成DCPD 涂層。在先前的研究［21］中，DCPD 沉積時(shí)間為24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中浸泡7 d 后出現(xiàn)了支架破碎；為了進(jìn)一步提高支架在培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性，本研究將DCPD 的沉積時(shí)間延長至48 h。采用SEM 觀察支架的多孔結(jié)構(gòu)和涂層的表面形貌。通過Micro-CT 重建大小為Φ10 mm×2 mm（表示直徑10 mm，高度2 mm）的JDBM-DCPD 和JDBM-MgF2三維圖像并計(jì)算支架的孔隙率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用單軸試驗(yàn)機(jī)對支架的力學(xué)性能進(jìn)行測試。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)材料尺寸為Φ10 mm×2 mm，大鼠骨缺損模型中材料尺寸為Φ3 mm×5 mm。

1.2.2 JDBM-DCPD 支架表面細(xì)胞的黏附與增殖 將約含5×104個(gè)細(xì)胞的1 mL BMSC 懸液分別接種到JDBMMgF2和JDBM-DCPD 支架上。培養(yǎng)7 d 后，利用SEM 對多孔支架表面的細(xì)胞進(jìn)行觀察。同時(shí)，對支架表面培養(yǎng)的細(xì)胞通過CCK8試劑盒檢測細(xì)胞的活力。

1.2.3 支架浸提液作用下內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 首先將尺寸為Φ10 mm×2 mm 的JDBM-MgF2和JDBM-DCPD 2 組支架放入75%乙醇中消毒30 min。然后，將每組多孔支架按照3 mL/個(gè)浸泡在DMEM 培養(yǎng)基中，并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。3 d 后收集每組條件培養(yǎng)基，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后得到支架浸提液，保存于4 ℃冰箱備用。

將約含1×105個(gè)Ea.hy926 細(xì)胞的懸液100 μL 接種于24 孔Transwell 小室的上室，然后將600 μL 不同涂層的JDBM 支架浸提液加到Transwell 小室的下室中，普通DMEM 培養(yǎng)基作為陰性對照。孵育24 h 后，將上室輕輕移開，并用棉簽將膜的上表面細(xì)胞盡量拭去。然后用4%多聚甲醛將遷移至膜下表面的細(xì)胞固定，0.5%結(jié)晶紫染色10 min 后用光學(xué)顯微鏡觀察拍照，并使用Image-J 軟件進(jìn)行定量分析［22］。

1.2.4 支架浸提液作用下內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn) 制備JDBM-MgF2和JDBM-DCPD 的支架浸提液，方法同前。在24 孔板中加入Matrigel 膠100 μL/孔，37 ℃溫箱孵育30 min，然后在每孔中加入約含6×104個(gè)Ea.hy926 細(xì)胞的浸提液繼續(xù)培養(yǎng)，普通DMEM 培養(yǎng)基作為陰性對照，分別于培養(yǎng)3 h 和6 h 時(shí)在光學(xué)顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞體外成管情況，并使用Image-J軟件進(jìn)行定量分析。

1.2.5 支架浸提液作用下內(nèi)皮細(xì)胞VEGF 分泌情況 制備JDBM-MgF2和JDBM-DCPD的支架浸提液，方法同前。將Ea.hy926 細(xì)胞以2×104/mL 的密度接種在24 孔板中，加入JDBM-MgF2和JDBM-DCPD 的支架浸提液培養(yǎng)3 d，普通DMEM 培養(yǎng)基作為陰性對照。然后將細(xì)胞在室溫下用4%多聚甲醛固定15 min，并與VEGF 抗體（1∶200）在4 ℃孵育過夜，之后用Alexa Fluor488 標(biāo)記的二抗（1∶200）孵育1 h，最后分別用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（1∶200）和DAPI（1∶200）處理40 min 和10 min。利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中VEGF的表達(dá)情況。

1.2.6 支架浸提液作用下BMSC 成骨分化實(shí)驗(yàn) 制備JDBM-MgF2和JDBM-DCPD 的支架浸提液，方法同前。將BMSC 按1×104/孔接種于24 孔板中，分別用JDBMMgF2和JDBM-DCPD 2 組支架浸提液培養(yǎng)，普通培養(yǎng)基作為陰性對照，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)7 d 和14 d。根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行ALP 染色和茜素紅染色。實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)3次。

1.2.7 大鼠股骨髁臨界性骨缺損模型制備及支架的植入 本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的規(guī)定，經(jīng)批準(zhǔn)后進(jìn)行。用體質(zhì)量為250～300 g 的雄性SD 大鼠建立股骨髁臨界性骨缺損模型，16 只大鼠隨機(jī)分為JDBM-MgF2組和JDBM-DCPD組，每組8 只。采用0.5%戊巴比妥鈉溶液（9 mL/kg）經(jīng)腹腔注射誘導(dǎo)麻醉成功后，在大鼠雙側(cè)股骨髁的內(nèi)側(cè)分別行1.5 cm 長縱行切口，暴露內(nèi)側(cè)髁，使用牙科高速環(huán)鉆制造直徑3 mm、深度5 mm 的骨缺損模型。然后按分組情況將支架材料植入骨缺損區(qū)域，再逐層縫合肌肉和皮膚，肌肉注射青霉素預(yù)防感染。

1.2.8 影像學(xué)檢查 術(shù)后8 周，每組取4 只進(jìn)行血管灌注。采用0.5%戊巴比妥鈉溶液（9 mL/kg）經(jīng)腹腔注射誘導(dǎo)麻醉成功后，打開胸腔，將含有肝素鈉的生理鹽水溶液沿左心室注入，同時(shí)剪開右心耳，待右心耳流出澄清生理鹽水后，使用20 mL 的Microfil 灌注液灌注血管，待雙下肢皮膚變黃表示灌注成功，絲線結(jié)扎腹主動(dòng)脈。然后將死亡的大鼠標(biāo)記后置于4 ℃冰箱過夜血管塑化。次日將大鼠股骨髁標(biāo)本取下并放入10%中性甲醛固定液中固定48 h以上，最后將標(biāo)本在10%EDTA 脫鈣溶液中持續(xù)脫鈣4 周。脫鈣成功的樣本放在Micro-CT 卡槽并固定，設(shè)置分辨率為9 μm 進(jìn)行掃描，使用配套軟件重建缺損區(qū)血管三維影像。

另外，術(shù)后8 周，對每組余下4 只SD 大鼠使用過量的0.5%戊巴比妥鈉溶液處死，股骨髁部位首先采用X 射線觀察缺損區(qū)修復(fù)情況，然后將股骨髁標(biāo)本取下并在10%中性甲醛固定液中固定48 h，固定后的標(biāo)本再使用micro-CT（18 μm分辨率）掃描并重建三維影像觀察缺損修復(fù)以及支架降解情況

1.2.9 缺損區(qū)的組織學(xué)觀察 將未經(jīng)Microfil灌注的股骨髁標(biāo)本經(jīng)Micro-CT 掃描后分組標(biāo)記并在10%EDTA 溶液中脫鈣4 周，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚度4 μm。通過蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H-E）染色和免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）染色（OCN 和CD31）評估成骨和血管生成情況［23］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 JDBM-DCPD多孔支架的表征

從JDBM-MgF2和JDBM-DCPD 2 組支架的三維重建影像可以看到支架具有多孔互連結(jié)構(gòu)（圖1A）。低倍SEM下可看到多孔互連結(jié)構(gòu)高度規(guī)則，2組支架的球形主孔徑在400～450 μm，主孔之間有8～11 個(gè)大小不等的小孔相互連接；并且在高倍SEM 鏡下觀察到MgF2涂層表面光滑，而DCPD涂層表面粗糙，在DCPD涂層支架中，鈣磷顆粒均勻分布在孔壁上，大小為15～25 μm（圖1B）。通過micro-CT 掃描及相關(guān)軟件計(jì)算JDBM-MgF2支架的孔隙率為（79.40±0.62）%，而JDBM-DCPD 支架的孔隙率為（69.79±0.40）% （圖1C），2 組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。JDBM-MgF2的彈性模量為（0.34±0.07）GPa，屈服強(qiáng)度（5.05±0.30）MPa；JDBM-DCPD 的彈性模量為（0.41±0.09）GPa，屈服強(qiáng)度（6.92±0.17）MPa。2組間支架的彈性模量及屈服強(qiáng)度的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000）。

2.2 JDBM-DCPD支架的生物相容性

本研究中，支架在培養(yǎng)基中浸泡7 d 后仍然結(jié)構(gòu)完整，可見DCPD 沉積48 h 相較24 h 可以提高支架在溶液中的穩(wěn)定性。如圖2A 所示，細(xì)胞接種于支架上7 d 后，CCK-8試劑盒檢測結(jié)果顯示，JDBM-DCPD組D（450 nm）值顯著高于JDBM-MgF2組（P=0.000）。SEM 觀察發(fā)現(xiàn)，在MgF2涂層的支架表面僅有少量舒展以及較多死亡的BMSC；而在DCPD 涂層的支架上培養(yǎng)的BMSC具有良好的舒展?fàn)顟B(tài)，基本完全覆蓋孔壁表面（圖2B）。

圖2 JDBM-DCPD與JDBM-MgF2支架生物相容性的比較Fig 2 Comparison of JDBM-DCPD and JDBM-MgF2 in biocompatibility

2.3 JDBM-DCPD浸提液在體外對內(nèi)皮細(xì)胞成管的影響

Transwell 內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ea.hy926 細(xì)胞在含有2種不同涂層的JDBM 支架浸提液中的遷移能力均好于對照組，而在JDBM-DCPD 浸提液中的遷移能力又強(qiáng)于其在JDBM-MgF2浸提液中的遷移能力（圖3A、B）。不同涂層的JDBM 浸提液作用下的Ea.hy926 細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在3 h和6 h這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，Ea.hy926細(xì)胞在含不同涂層JDBM 浸提液中的成管能力（伸展的管狀結(jié)構(gòu)）要好于其在普通培養(yǎng)液中的成管能力（不完全的和零星的管狀結(jié)構(gòu)）；而與JDBM-MgF2浸提液相比，JDBM-DCPD浸提液作用下的Ea.hy926細(xì)胞形成完整伸展的管狀結(jié)構(gòu)的數(shù)量更多，證明相較于JDBM-MgF2，JDBM-DCPD 浸提液促內(nèi)皮細(xì)胞的成管能力更強(qiáng)（圖3C、D）。

此外，免疫熒光成像進(jìn)一步證實(shí)了不同涂層的JDBM支架組和對照組Ea.hy926 細(xì)胞均有VEGF 的表達(dá)（圖4A）。熒光半定量分析顯示，在含有JDBM 涂層浸提液2個(gè)組中Ea.hy926 細(xì)胞的VEGF 水平表達(dá)均高于對照組，而JDBM-DCPD 組的VEGF 表達(dá)量又高于JDBM-MgF2組（圖4B），而且從細(xì)胞骨架（肌動(dòng)蛋白）染色中可以看到3 組內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)相似。上述結(jié)果表明JDBM-DCPD 在體外具有良好促內(nèi)皮細(xì)胞成血管能力，而支架的浸提液對內(nèi)皮細(xì)胞沒有明顯細(xì)胞毒性。

2.4 JDBM-DCPD對BMSC成骨分化的影響

圖5A 顯示BMSC 中ALP 的表達(dá)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增多，在7 d 和14 d 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)JDBM-DCPD 組ALP染色最深，而對照組只有少量的ALP 表達(dá)。同時(shí)，茜素紅染色結(jié)果也顯示，BMSC培養(yǎng)14 d后JDBM-DCPD組礦化水平更高，有更多的鈣結(jié)節(jié)被染成紅色（圖5B）。

2.5 影像學(xué)分析JDBM-DCPD 支架對大鼠骨缺損模型新骨再生的作用以及支架在體內(nèi)的降解情況

建模后，大鼠均未出現(xiàn)感染或死亡等并發(fā)癥。X射線檢查（圖6A）觀察到JDBM-DCPD組缺損區(qū)呈高密度影，而JDBM-MgF2組缺損區(qū)的密度較周圍宿主骨明顯降低，這一結(jié)果說明JDBM-DCPD 組骨缺損區(qū)有更多的新骨再生。三維重建影像顯示，JDBM-DCPD支架表面被大量新骨覆蓋，而在JDBM-MgF2組仍可觀察到支架的輪廓；矢狀面影像中觀察到JDBM-DCPD 組顯示出良好的界面結(jié)合，而JDBM-MgF2組骨界面有部分空腔形成（圖6B）。

Microfil 血管灌注檢測觀察到JDBM-DCPD 組的骨缺損區(qū)較JDBM-MgF2組有更多、更密集的血管網(wǎng)形成（圖6C），良好的血管網(wǎng)有利于營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸從而有效地促進(jìn)缺損區(qū)骨組織的再生。通過micro-CT掃描計(jì)算，術(shù)后8周JDBM-MgF2組支架降解了（23.95±2.74）% ， 而JDBM-DCPD組支架降解了（14.53±2.23）%，2組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。

2.6 免疫組織化學(xué)染色分析大鼠骨缺損區(qū)新血管和新骨的形成

圖3 JDBM-DCPD與JDBM-MgF2支架浸提液對Ea.hy926細(xì)胞遷移能力和成管情況影響的比較Fig 3 Comparison of the effects of JDBM-DCPD and JDBM-MgF2 scaffold extracts on Ea.hy926 cell migration and tube formation

圖4 JDBM-DCPD與JDBM-MgF2支架浸提液對Ea.hy926細(xì)胞VEGF表達(dá)水平影響的比較Fig 4 Comparison of the effects of JDBM-DCPD and JDBM-MgF2 scaffold extracts on the expression of VEGF in Ea.hy926 cells

圖5 JDBM-DCPD與JDBM-MgF2支架浸提液對BMSC成骨分化影響的比較Fig 5 Comparison of effects of JDBM-DCPD and JDBM-MgF2 scaffold extracts on osteogenic differentiation of BMSCs

圖6 植入8周后影像學(xué)檢測JDBM-DCPD與JDBM-MgF2支架的體內(nèi)成骨、成血管作用Fig 6 Osteogenesis and angiogenesis of JDBM-DCPD and JDBM-MgF2 scaffolds in vivo detected by radiography 8 weeks after implantation

2組大鼠股骨髁標(biāo)本在脫鈣4周后分別進(jìn)行H-E染色，以及成骨標(biāo)志物OCN 和成血管標(biāo)志物CD31 的免疫組織化學(xué)染色。H-E染色結(jié)果顯示JDBM-DCPD 組孔壁有更多被染成紅色的骨膠原，并且在放大圖中可以看到明顯的血管形成（圖7A）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示JDBMDCPD 組OCN 染色較JDBM-MgF2組更深（圖7B）；并且在JDBM-DCPD 組球形孔的中間有更多血管生成標(biāo)志物CD31 的表達(dá)，而JDBM-MgF2組僅在球形孔壁周圍可見CD31 的表達(dá)（圖7C），這一結(jié)果與Microfil 血管灌注顯示的結(jié)果一致。

圖7 植入8周后JDBM-DCPD組與JDBM-MgF2組大鼠骨缺損區(qū)的組織學(xué)觀察Fig 7 Histological observation of the bone defect areas in JDBM-DCPD group and JDBM-MgF2 group rats 8 weeks after implantation

3 討論

理想的骨組織工程支架需要具有合適的孔徑。有文獻(xiàn)［24-25］報(bào)道材料孔徑為100～1 000 μm時(shí)，支架的逐漸降解有利于血管和新骨的生成。此外，據(jù)報(bào)道，多孔支架孔徑在300～500 μm的范圍內(nèi)對血管再生、類骨和礦化骨形成最佳［26］。本研究所使用的JDBM鎂合金支架為規(guī)則的高度互連多孔結(jié)構(gòu)，主孔直徑為400～450 μm，相互連接的孔徑為150～250 μm。組織工程支架還需要具有一定的孔隙率才能更好地促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)以及細(xì)胞代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸從而促進(jìn)組織的生長。當(dāng)多孔支架孔隙率約為90%時(shí)更為理想，能夠?yàn)榧?xì)胞外基質(zhì)的合成提供足夠空間，為細(xì)胞與材料的相互作用提供高比表面積。因此，支架的孔隙率和互連性是促進(jìn)組織生長和整合的關(guān)鍵因素［26］。然而，孔隙率越高意味著力學(xué)性能越低。在本研究中，JDBM-DCPD支架的孔隙率約為70%，與人骨小梁的孔隙率相似，并且JDBM-DCPD支架的力學(xué)性能與松質(zhì)骨相匹配。本研究相較于前期研究［21］在涂層制備方面延長了鈣磷沉積的時(shí)間，結(jié)果表明JDBM-DCPD支架在培養(yǎng)基中更加穩(wěn)定，浸泡7 d宏觀結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)明顯改變，但支架的孔隙率以及力學(xué)性能相較前期并未發(fā)生顯著的變化。

支架表面的細(xì)胞黏附直接影響細(xì)胞的生長、遷移和分化。因此，細(xì)胞黏附是骨整合的關(guān)鍵和先決條件［13］。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單純MgF2涂層支架不利于BMSC 的黏附，這可能是由于MgF2涂層支架在培養(yǎng)基中降解相對較快并會(huì)產(chǎn)生過多的氫氣，使局部環(huán)境pH 值增高而不利于細(xì)胞的黏附；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，可能同樣由于MgF2涂層支架在降解過程中產(chǎn)生的氫氣過多，氣體聚集在組織周圍，導(dǎo)致支架與宿主骨之間形成空腔，這一現(xiàn)象在MgF2涂層的AZ31 合金多孔支架修復(fù)股骨髁缺損時(shí)也被觀察到［27］。與MgF2涂層支架相比，DCPD 涂層支架在體外明顯更有利于細(xì)胞的黏附和生長；另外，JDBM-DCPD支架也能明顯促進(jìn)BMSC 的成骨分化。這可能是由于DCPD 涂層能延緩鎂合金支架的降解。適量的Mg2+可以調(diào)節(jié)吸附的纖維連接蛋白，增強(qiáng)其與受體結(jié)合親和力，上調(diào)BMSC 整合素α5β1的表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)胞黏附和成骨分化［14］。此外，與骨礦物質(zhì)類似的成分亦賦予DCPD 強(qiáng)大的細(xì)胞生物活性［28-29］。在降解過程中DCPD 涂層向培養(yǎng)基釋放的鈣離子和磷離子能進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化［30］，這與我們之前的研究結(jié)果一致［16-17，31］。

然而骨組織的再生離不開營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，骨組織內(nèi)的血管再生對于骨組織的修復(fù)至關(guān)重要［4］。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為成骨和成血管之間的關(guān)系是單向的，主要表現(xiàn)為血管再生為骨組織的再生和修復(fù)提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)并代謝廢物［32］。但近年的研究［33-34］表明骨組織的再生對骨內(nèi)血管的再生同樣有著極為重要的作用，因而非常有必要在研究骨再生的同時(shí)關(guān)注血管再生情況。一方面血管再生可以促進(jìn)骨再生，另一方面良好的骨再生也可以促進(jìn)骨內(nèi)血管的再生，從而形成良性循環(huán)，更好地達(dá)到骨修復(fù)的目的。我們的體外研究結(jié)果顯示JDBM-DCPD 具有優(yōu)良的促血管再生的作用，可能是JDBM-DCPD 鎂合金支架緩釋出來的適宜的Mg2+濃度促進(jìn)了Src/JAK2 信號(hào)通路上前體破骨細(xì)胞分泌的血小板衍生生長因子BB（Platelet derived growth factor BB，PDGF-BB） 的表達(dá)，使得其成血管的作用增強(qiáng)［35-37］。同時(shí)，鈣磷涂層釋放的鈣離子和磷離子同樣具有促進(jìn)血管再生的作用［38］，因而相較于MgF2涂層的JDBM 鎂合金支架，JDBM-DCPD 鎂合金支架浸提液展現(xiàn)出更加優(yōu)越的成血管能力。

在本研究中，雖然JDBM-DCPD多孔互連支架顯示出合適的Mg2+釋放、細(xì)胞相容性以及體內(nèi)外優(yōu)良的成血管性能，然而仍需要進(jìn)行大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測JDBM-DCPD的成血管能力，并進(jìn)一步研究JDBM-DCPD支架在促進(jìn)成骨-成血管交聯(lián)方面的內(nèi)在機(jī)制。另外也有多項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)，動(dòng)物體內(nèi)使用的模擬環(huán)境與人體不同，實(shí)驗(yàn)難以完美再現(xiàn)人體微環(huán)境，實(shí)際應(yīng)用于人體時(shí)支架降解速率還是會(huì)受到一定影響［39-41］。因此，如何控制鎂合金的降解，抑制氫氣的產(chǎn)生，也是進(jìn)一步擴(kuò)大可生物降解鎂合金應(yīng)用的關(guān)鍵。

致謝衷心感謝上海交通大學(xué)材料學(xué)院袁廣銀教授和賈高智博士在JDBM 合金多孔支架制備和表征檢測過程中提供的大力幫助及指導(dǎo)。

參·考·文·獻(xiàn)

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