基于加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析識別抑郁癥的差異表達(dá)基因模塊

耿瑞杰，姚 琳，黃欣欣，禹順英，苑成梅，洪 武，呂欽諭，王慶中，易正輝#，方貽儒，5，6

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心理醫(yī)學(xué)科，上海200032；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心精神科，上海200030；3.上海市浦東新區(qū)南匯精神衛(wèi)生中心精神科，上海201399；4.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所神經(jīng)藥理實驗室，上海201203；5.中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心，上海200031；6.上海市重性精神病重點(diǎn)實驗室，上海201108

抑郁癥（major depressive disorder，MDD）是一種常見的精神疾病，具有高患病率、高致殘率、疾病負(fù)擔(dān)沉重等特點(diǎn)［1-4］。目前其病因及發(fā)病機(jī)制未明，尚無明確的實驗室檢測指標(biāo)可用于診斷及預(yù)后。既往研究［5-8］提示抑郁癥有顯著的遺傳易感性，并且受心理與環(huán)境的影響，遺傳與環(huán)境的交互作用是抑郁癥發(fā)病的主要因素。

雙生子研究［9］顯示抑郁癥的遺傳度約為37%，異卵雙生子的發(fā)病一致率為20%，同卵雙生子的發(fā)病一致率約為40%。家系研究［9］提示抑郁癥在家族中呈聚集現(xiàn)象，患者一級親屬的患病率是正常人的2～3倍。全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome wide association study，GWAS）表明，抑郁癥的遺傳性主要是通過常見的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）來解釋。然而直至目前，在一般人群中鑒定與抑郁癥相關(guān)的基因仍未取得顯著成效［10］。有研究［11］分別在抑郁癥首發(fā)階段分析18 759 例患者的120萬個常染色體和X 染色體的SNP，在抑郁癥復(fù)發(fā)階段分析6 783 個病例及50 695 個健康對照的554 個常染色體SNP，其結(jié)果顯示沒有SNP同時在抑郁癥的2個階段達(dá)到全基因組水平上的顯著性。Hyde 等［12］使用來自75 607 例抑郁癥患者和231 747 個健康對照者的自我報告數(shù)據(jù)，并對這些結(jié)果與已發(fā)表的抑郁癥全基因組關(guān)聯(lián)研究結(jié)果進(jìn)行了meta分析；結(jié)果表明15個區(qū)域的17個獨(dú)立SNP 達(dá)到了全基因組水平上的顯著性。此外，一些針對抑郁癥患者血液基因表達(dá)譜的微陣列的研究和RNA 測序（RNA-seq） 研究也鑒定了許多差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG）［13-16］；然而報道的DEG 在各項研究中差異較大，一項研究中鑒定出的大部分DEG 未能在其他研究中被重復(fù)獲得。雖然抑郁癥遺傳度較高，但是目前研究結(jié)果不甚理想：一方面可能是因為抑郁癥是遺傳與環(huán)境共同作用所致；另一方面，一些復(fù)雜疾病，特別是精神疾病，不是由單一基因起主要作用而是由許多微效基因共同作用的結(jié)果［17］。僅僅對單個基因功能水平的研究已經(jīng)限制了我們探索抑郁癥分子機(jī)制的進(jìn)程，而通過構(gòu)建基因網(wǎng)絡(luò)，從系統(tǒng)層面分析基因之間的相互作用成為下一步的研究熱點(diǎn)。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 （weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）是構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的代表性方法，它基于無尺度拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行相似性度量和設(shè)定閾值，方法更具合理性并且已成功地應(yīng)用到多個研究領(lǐng)域。

1 對象與方法

1.1 研究對象

mRNA微陣列數(shù)據(jù)來自本課題組前期已經(jīng)完成的8例抑郁癥患者及8名健康對照者（對照組）的外周血mRNA微陣列分析實驗［18］。入組病例均為上海市精神衛(wèi)生中心精神科門診和心理咨詢門診的患者，以及心境障礙科住院患者。抑郁癥患者年齡（34.9±9.8）歲，已婚5 例，未婚3 例；對照組年齡（35.4±10.2）歲，已婚5 例，未婚3例。入組時抑郁癥患者漢密爾頓抑郁量表（Hamilton Depression Scale，HAMD）總分平均（22.75±3.54）分；對照組為上海市精神衛(wèi)生中心職工及學(xué)生。病例組及對照組之間無血緣關(guān)系。

1.2 研究方法

1.2.1 DEG 的篩選 應(yīng)用t檢驗統(tǒng)計方法篩選抑郁癥患者與對照組的DEG［19］，其中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）的基因被納入后續(xù)的分析。

1.2.2 WGCNA 通過R 軟件中的WGCNA 包進(jìn)行分析。通過計算每組基因的相似矩陣、鄰接矩陣、拓?fù)渲丿B矩陣，衡量節(jié)點(diǎn)間相異度等步驟繪制層次聚類樹（樹狀圖）。按照WGCNA 原理中無尺度網(wǎng)絡(luò)原則選擇鄰接函數(shù)的加權(quán)參數(shù)β。將關(guān)聯(lián)系數(shù)閾值設(shè)定為0.9（此時參數(shù)β=14）來構(gòu)建基因數(shù)據(jù)集的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（圖1）。應(yīng)用混合動態(tài)樹切割方法來切割分支，完成初步的模塊構(gòu)建后將基因較少的模塊進(jìn)行合并。

1.2.3 模塊-表型關(guān)聯(lián)和樞紐基因的鑒定 通過Pearson相關(guān)性分析評估上一步檢測到的模塊與抑郁癥之間的相關(guān)性。模塊eigengene（module eigengene，ME）是指給定模塊的第一主成分，代表整個模塊的基因表達(dá)譜。分別選取ME與抑郁癥正相關(guān)性和負(fù)相關(guān)性最強(qiáng)（相關(guān)系數(shù)絕對值最大）的2個模塊作為后續(xù)研究的候選模塊。這一步計算基于基因顯著性（gene significance，GS）、模塊身份（module membership， MM） 和模塊內(nèi)連接性（intramodular connectivity）。本研究中，GS的定義為基因和抑郁癥之間相關(guān)系數(shù)的絕對值；MM 的定義為ME與基因表達(dá)譜的相關(guān)性。每個基因的模塊內(nèi)連接性（連接值之和除以模塊內(nèi)基因的數(shù)量）用kWithin 值表示。具有高GS、高M(jìn)M，且模塊內(nèi)連接性從高到低排名前3 位的基因被定義為模塊的樞紐基因［20］，然后利用R 軟件中的igraph和qgraph包繪制模塊內(nèi)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.2.4 基因功能富集和網(wǎng)絡(luò)分析 利用metascape在線網(wǎng)站對候選模塊進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路分析（http：//metascape.org/gp/index.html），計算出與富集基因功能相關(guān)生物學(xué)過程和信號通路。P值的計算基于超幾何分布檢驗，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理和DEG篩選

mRNA 微陣列數(shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理后，從16 個樣品中獲得54 675 個基因的表達(dá)矩陣，比較抑郁癥患者和正常對照組，按P＜0.05 的條件共得到4 125 個DEG 用于下一步研究。

2.1.1 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 按照WGCNA 原理中無尺度網(wǎng)絡(luò)原則選擇鄰接函數(shù)的加權(quán)參數(shù)β，采用WGCNA 中的step-by-step 法，完成基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建（圖1）。共識別出9 個mRNA 基因模塊，每個基因模塊包含195～696個基因，每個模塊用不同的顏色代替，用灰色表示無法合并到任何模塊的基因。

圖1 基因聚類樹Fig 1 Dendrogram of gene clustering

2.1.2 基因模塊與抑郁癥的相關(guān)性 計算9 個模塊的ME與抑郁癥的相關(guān)性（圖2），結(jié)果可見這9 個模塊均與抑郁癥呈顯著關(guān)聯(lián)。其中綠色（green）、紅色（red）、黃色（yellow）、粉色（pink）、青色（cyan）模塊與抑郁癥之間呈負(fù)相關(guān)；cyan 模塊的負(fù)相關(guān)性最高，相關(guān)系數(shù)為-0.91（P=0.000）。藍(lán)綠色（turquoise）、棕色（brown）、黑色（black）、藍(lán)色（blue）這4 個模塊與抑郁癥呈正相關(guān)；blue 模塊正相關(guān)性最強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)為0.76 （P=0.000）。因此，選取cyan 模塊和blue 模塊作為候選模塊進(jìn)行下一步研究。

2.2 從候選模塊中識別樞紐基因并構(gòu)建基因網(wǎng)絡(luò)

計算每個基因的模塊內(nèi)連接性（kWithin 值），選取2個模塊中kWithin值最高的前50個基因，繪制基因相互作用圖。將2 個模塊中kWithin 值最高的前3 個基因認(rèn)定為樞紐基因。Blue 模塊的樞紐基因為JAM2（junctional adhesion molecule 2）、SCRN2（secernin 2）和IGHV7-81（immunoglobulin heavy variable 7-81）；cyan 模塊的樞紐基因為SCFD2（Sec1 family domain containing 2）、NR5A2（nuclear receptor subfamily 5 group A member 2） 和KCNMA1（potassium calcium-activated channel subfamily M alpha 1）。如圖3 和圖4 所示，所有的樞紐基因具有網(wǎng)絡(luò)中相鄰基因的緊密連接性。

圖2 9個基因模塊的ME與抑郁癥的關(guān)聯(lián)圖Fig 2 The association between 9 MEs of gene modules and depression

圖3 Blue模塊的基因相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig 3 Gene interaction network of the blue module

圖4 Cyan模塊基因相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig 4 Gene interaction network of the cyan module

2.3 模塊基因的功能注釋和通路分析

利用metascape 對blue 模塊和cyan 模塊進(jìn)行功能注釋和通路分析，結(jié)果提示cyan 模塊沒有富集到有統(tǒng)計學(xué)意義的KEGG 通路，blue 模塊的KEGG 通路則富集到3 條，分別為RNA 轉(zhuǎn)運(yùn)、沙門菌感染和黑色素生成（圖5A）。Cyan 模塊共富集到GO 條目20 條，其中15 條與胚胎發(fā)育及細(xì)胞生長、凋亡有關(guān)，2 條與細(xì)胞周期有關(guān)，1 條與物質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)；值得注意的是有1 條GO 條目為通過質(zhì)膜黏附分子的嗜同性細(xì)胞黏附（GO：0007156），與免疫及炎癥反應(yīng)有關(guān)；另有1條為跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路（GO：0007169），與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。Blue 模塊共富集到15 條GO 條目，其中7 條與物質(zhì)加工轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)（圖5B）。

圖5 Blue模塊和cyan模塊的生物注釋Fig 5 Biological annotation of blue module and cyan module

3 討論

WGCNA 軟件的算法是基于樣本之間表達(dá)譜的相似性來構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，以此對基因表達(dá)信息進(jìn)行系統(tǒng)層面的描述分析。相對于傳統(tǒng)差異表達(dá)分析僅僅對單個基因功能水平進(jìn)行研究，WGCNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)主要基于系統(tǒng)論，充分考慮到生命體的復(fù)雜性以及基因和基因之間的高階交互作用，可以揭示轉(zhuǎn)錄組系統(tǒng)層面的表達(dá)改變。WGCNA 已經(jīng)在多種疾病中廣泛應(yīng)用，如腫瘤、帕金森病、孤獨(dú)癥等。在本研究中，我們利用WGCNA共識別出9個基因模塊，挑選出其中與抑郁癥正相關(guān)性和負(fù)相關(guān)性最強(qiáng)的2 個模塊，這2 個模塊的生物功能注釋提示免疫和炎癥反應(yīng)可能在抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定作用。既往許多研究［21-28］發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)是一種重要的生物學(xué)反應(yīng)，可能會增加重度抑郁發(fā)作的風(fēng)險。最近，Wang 等［29］發(fā)現(xiàn)相比健康對照人群，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）在抑郁癥死亡患者的腦組織背外側(cè)前額葉皮質(zhì)和外周血中的表達(dá)量更高，提示抑郁癥患者體內(nèi)可能存在促炎細(xì)胞因子失調(diào)。此外，已有臨床研究［30-31］報道了TNF-α 特異性單克隆抗體對治療抑郁癥具有良好的效果。因此，炎癥反應(yīng)可能在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。

在blue 模塊和cyan 模塊中共識別出6 個樞紐基因，即JAM2、SCRN2、IGHV7-81（blue 模塊），以及SCFD2、NR5A2、KCNMA1（cyan 模塊）。有證據(jù)提示JAM2、SCFD2、NR5A2和KCNMA1與抑郁癥之間存在一定的相關(guān)性。首先，根據(jù)CTD Gene-Disease Associations 數(shù)據(jù)庫可以檢索到JAM2、NR5A2、KCNMA1和抑郁癥顯著相關(guān)，標(biāo)準(zhǔn)值分別為1.27、1.81 和1.37；GWASdb SNPPhenotype Associations數(shù)據(jù)庫也提示NR5A2、KCNMA1和抑郁癥顯著相關(guān)，標(biāo)準(zhǔn)值分別為0.75 和0.61。Yi等［18］通過全基因組cRNA 微陣列研究發(fā)現(xiàn)SCFD2在抑郁癥患者中的表達(dá)顯著低于健康對照，差異倍數(shù)（fold change）為0.72（P＜0.001）。另有研究［32］發(fā)現(xiàn)，KCNMA1與孤獨(dú)癥譜系障礙（autistic spectrum disorder，ASD）和癲癇綜合征均有一定的關(guān)聯(lián)；而ASD 和癲癇常常與抑郁癥之間存在共病現(xiàn)象，ASD 患者抑郁癥的患病率明顯較高［33］，提示KCNMA1基因也可能在抑郁癥的發(fā)病中起作用。因此，我們認(rèn)為JAM2、SCFD2、NR5A2、KCNMA1與抑郁癥之間存在相關(guān)性的可能性較大，這也從另一方面說明WGCNA 篩選樞紐基因的可靠性。至于另外2 個基因SCRN2和IGHV7-81，我們暫未發(fā)現(xiàn)確切的證據(jù)證明其與抑郁癥的相關(guān)性，但并不能排除這一可能性。

本研究也存在一定的局限性。首先，抑郁癥的臨床表現(xiàn)具有多樣性的，本研究未對抑郁癥的臨床表現(xiàn)進(jìn)行分類并分別分析其與基因模塊之間的相關(guān)性。其次，由于本研究的樣本量較小，WGCNA 分析的統(tǒng)計效能較低。R 軟件的pwr 包分析顯示，當(dāng)效應(yīng)量設(shè)置為0.7 時，統(tǒng)計效能僅為0.74（小于0.8）。后續(xù)研究需要增加樣本量以進(jìn)一步驗證本研究的發(fā)現(xiàn)，并探索這些樞紐基因在抑郁癥的病理生理過程中的潛在作用機(jī)制。

參·考·文·獻(xiàn)

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