三維多孔支架表面成型二氧化鈦納米管陣列體外促進人牙髓干細胞粘附及成骨分化

于泓川，何懋典，劉 鵑，李軍霞，帥 逸，臧圣奇，金 磊

外傷、感染、先天畸形、原發(fā)性疾病、藥物治療或手術(shù)切除腫瘤均可導致骨缺損的產(chǎn)生。有統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，美國每年單獨治療骨缺損的費用高達50億美金，骨缺損治療配套的腫瘤、骨恢復、愈合不良治療的費用更是不計其數(shù)[1]。成本高昂的自體骨及同種異體骨是骨缺損修復的最佳代用品，但自體骨存在數(shù)量受限、二次創(chuàng)傷及術(shù)后吸收的問題，同種異體骨也往往有免疫排斥、感染傳播的風險。因此，設(shè)計人工骨修復策略的骨組織工程應(yīng)運而生，并在最近幾十年受到了極大關(guān)注。

在過去的60年中，植入物的表面技術(shù)已經(jīng)從生物惰性表面(例如鈦和鉭)發(fā)展到生物活性表面(例如等離子噴涂的羥基磷灰石和其他陶瓷)，再到最新的下一代仿生工程納米技術(shù)[2]。其中關(guān)于二氧化鈦(TiO2)納米管的研究展示了巨大潛力。TiO2納米管一般通過陽極氧化法生成于純鈦表面，直徑為納米級，它將平坦表面變成微觀立體，極大地增加了接觸面積，并可調(diào)控細胞行為。成型的TiO2納米管比Ti表面更能促進細胞粘附、成骨分化、礦化，并有更強的抗菌性能[3-4]，有人在兔體內(nèi)的實驗發(fā)現(xiàn)TiO2納米管使骨結(jié)合強度提高了9倍[5]。

雖然陽極氧化法可以對納米管的長度、直徑和陣列進行調(diào)控，但這種方法產(chǎn)生的最終產(chǎn)品受到鈦金屬機械性能和各類成本的限制，同時產(chǎn)品外觀多為平板和柱狀，無法適應(yīng)骨組織工程的多元化仿生需求，例如模擬骨小梁的三維結(jié)構(gòu)和機械性能。不可吸收骨骼支架需要良好連通的微米級孔隙網(wǎng)絡(luò)，以便物質(zhì)運輸、血管化和組織滲透生長，為功能性活骨形成提供足夠的條件[6]。不過，多數(shù)不可吸收多孔支架的機械性能尚未令人滿意，可吸收支架應(yīng)用時更要額外考慮降解速率對成骨產(chǎn)生的影響[7]。

二氧化鋯(ZrO2)是一種不可吸收的生物相容陶瓷材料，具備優(yōu)異的機械強度和韌性。課題組前期通過模板法制作了多孔ZrO2支架[8]，很好地模擬了骨小梁的多孔結(jié)構(gòu)和機械性能。

人牙髓干細胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)是一種間充質(zhì)干細胞，廣泛地存在于人牙齒內(nèi)的活體牙髓中，可多向分化、自我更新，同時具備取材便捷、免疫原性低的特征，是再生組織工程的潛力細胞[9]。本課題組對hDPSCs的取材、培養(yǎng)、分化已經(jīng)積累了一定的經(jīng)驗，并曾通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)對其部分成骨基因完成了轉(zhuǎn)染[10-11]。

因此，本實驗利用水熱合成將TiO2納米管成型于ZrO2三維多孔支架表面并形成陣列，使兩者的生物學和機械性能優(yōu)勢結(jié)合，制造出毫米級、微米級、納米級分層滿足骨修復多層次需求的骨組織工程材料，并結(jié)合使用hDPSCs探究其對于干細胞粘附和增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 納米ZrO2支架的制備

將定形好的聚氨酯模版(1 cm×1 cm×0.5 cm，60 ppi)浸泡于2 mol/L的NaOH中8 h后取出，生理鹽水沖洗，烘箱(精宏，中國)40 ℃干燥。超聲水浴條件下，按照粉液質(zhì)量比2∶3將釔穩(wěn)定納米ZrO2粉(Tosoh，日本，粒徑29 nm，純度94.46%)少量多次加入混合溶液(250 μL 質(zhì)量分數(shù)5%PVB乙醇溶液∶1 mL 95%乙醇溶液∶1 mL去離子水)中得到質(zhì)量濃度60%的納米ZrO2均勻液態(tài)漿料。聚氨酯模板在ZrO2漿料中浸潤后離心機離心3 s去除多余漿料，40 ℃烘箱中干燥24 h后放入燒結(jié)爐(科晶，中國)，2 ℃/min升溫至660 ℃并保持30 min，10 ℃/min升溫至1 360 ℃后持續(xù)180 min，再0.5 ℃/min降溫至1 060 ℃后自然降溫。進行再次燒結(jié)(重復4次)：支架浸入漿料、吹堵孔、干燥后燒結(jié)，10 ℃/min升溫至1 360 ℃，再1 ℃/min升溫至1 400 ℃并保持180 min，5 ℃/min降溫至800 ℃后自然降溫。

1.2 納米TiO2漿料涂層及支架的燒結(jié)

整個過程與ZrO2漿料類似，只是溶質(zhì)為TiO2納米粉末(阿拉丁，中國，粒徑25 nm，純度99.8%，金紅石)，配制得到質(zhì)量分數(shù)5%、15%、30%的TiO2均勻液態(tài)漿料。同樣的燒結(jié)前準備后燒結(jié)，5 ℃/min升溫至500 ℃并保持120 min后自然降溫。

1.3 TiO2納米管的形成

將冷卻后的支架浸泡在水熱反應(yīng)釜聚四氟乙烯內(nèi)膽中的NaOH溶液(10 mol/L)，密封反應(yīng)釜后放入高溫爐以5 ℃/min加熱至110 ℃并保持12、24、36 h，自然冷卻至室溫，去離子水反復沖洗至沖洗液pH=7。烘箱40 ℃干燥24 h。

1.4 收縮率

使用數(shù)顯卡尺(廣陸，中國)測量待測支架長、寬、高，計算其體積。使用成型支架平均體積V1除以聚氨酯模版平均體積V2得到其收縮率。

1.5 孔隙率

利用比重瓶法測定支架孔隙率。加滿三蒸水的比重瓶稱重W1，待測支架干重W2。將支架浸入比重瓶的水中，靜置24 h使氣泡排出。使用三蒸水加滿比重瓶測重W3，取出飽含三蒸水的支架，稱取比重瓶剩余重量W4。孔隙率計算公式如下。

1.6 壓縮強度

測量每個樣品的尺寸，輸入程序；將待測樣品放入電子萬能材料試驗(Instron3365，美國)樣品臺，上下墊紙，設(shè)定機頭加載速度為0.5 mm/min，施加負荷直至試樣破壞。記錄最大強度數(shù)值。

1.7 掃描電子顯微鏡(SEM)和能譜儀(EDS)

支架表面噴金至少40 s后置于電鏡托盤上，使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(Quanta 250FEG，美國)觀察表面形態(tài)，并通過配套能譜儀(Oxford Instruments，英國)分析成分。

1.8 拉曼光譜(LRS)

通過拉曼光譜儀(Horiba，法國)，利用 100～800 cm-1的拉曼譜掃描各組樣品表面。

1.9 細胞培養(yǎng)

將支架放入48孔板中，每個樣品使用普通培養(yǎng)基浸泡12 h之后，吸出培養(yǎng)基，滴入約5×105個培養(yǎng)3代的hDPSCs。放入培養(yǎng)箱(力申，中國)6 h之后，每孔加入含10%比例胎牛血清的培養(yǎng)基0.5 mL，每2 d換液。hDPSCs由臨床患者拔除的第三磨牙中獲取，已通過患者知情同意。

1.10 SEM和鬼筆環(huán)肽觀察粘附細胞形態(tài)

接種6 h后，使用PBS洗滌3次后，細胞固定液(碧云天，中國)常溫下固定30 min，細胞洗滌液(碧云天，中國)洗滌3次，每次配合搖床晃動5 min。a. 使用 10%、30%、50%、80%、95%、100%(2次)的乙醇層級脫水各10 min，冷凍干燥機干燥12 h。常規(guī)SEM處理及觀察。b. 將1∶100的二抗稀釋液(碧云天，中國)每孔滴入300 μL，室溫避光孵育 30 min后，PBS配合搖床洗滌3次，每次5 min，共聚焦顯微鏡(Zeiss，德國)下觀察細胞形態(tài)。

1.11 CCK-8檢測細胞增殖能力

使用 CCK-8(諾唯贊，中國)試劑盒檢測3、5、7 d樣品，按照產(chǎn)品說明書每孔加入300 μL檢測液,處理2 h后，吸出100 μL進行酶標儀(Tecan，荷蘭)檢測。

1.12 堿性磷酸酶檢測細胞成骨分化能力

利用成骨誘導液培養(yǎng)細胞，按照產(chǎn)品說明書使用堿性磷酸酶(ALP)檢測盒(碧云天，中國)檢測實驗組和對照組4、7 d ALP活性。

1.13 統(tǒng)計分析

格拉布斯準則去除極端值，Shapiro-Wilk test驗證各組正態(tài)齊性，Bartlett-test檢驗組間方差齊性，使用ANOVA進行方差分析，多組樣本之間使用Tukey test對比差異。每組有效樣本不少于3個，P<0.05計為有統(tǒng)計學差異。統(tǒng)計分析及作圖均使用R(version 3.6.3)進行。

2 結(jié) 果

2.1 成品支架成型

聚氨酯膜版(圖1A)通過一系列處理最終得到了多孔蜂窩狀立方體目標支架，肉眼觀支架為淡黃色，與模板形狀相似且無明顯堵孔(圖1B)。15個樣品支架長、寬、高平均為7.35 mm、7.49 mm、4.42 mm，對比初始模板體積收縮率約為48.4%。場發(fā)射電子顯微鏡低倍觀測到支架孔徑為230～820 μm，且無堵孔、表面光滑、無明顯裂痕(圖1C)。

A：成型的聚氨酯模版；B：15%TiO2涂層支架；C：SEM( ×120)觀察15%TiO2涂層支架

2.2 各組微觀表面及元素分析

掃描電子顯微鏡高倍觀察個組樣品，可發(fā)現(xiàn)NaOH處理時長和涂層TiO2濃度均影響表面形態(tài)，15%TiO2涂層NaOH處理24 h的樣品表面觀測到了成型的TiO2納米管陣列。

NaOH處理12 h僅在緊密連接的ZrO2陶瓷顆粒表面形成分散的指狀凸起，反應(yīng)底物(TiO2)越充足，凸起結(jié)構(gòu)越密集(圖2A、D、G)。即使NaOH處理時間延長，5%組樣品仍是分散的指狀凸起(圖2B、C)。反應(yīng)底物充足的樣品，過長的NaOH處理時長會使表面結(jié)構(gòu)雜亂化(圖2F、I)。預期的管樣陣列結(jié)構(gòu)出現(xiàn)于底物充足、反應(yīng)時長24 h的樣品(圖2E、H)。15%TiO2涂層NaOH處理24 h的樣品表面結(jié)構(gòu)最優(yōu)，類似玫瑰花瓣的管壁組成了不規(guī)則蜂窩樣陣列結(jié)構(gòu)，孔徑100～800 nm不等(圖2E、圖4D)。EDS對表面元素的分析證實了底層支架Zr成分。同時TiO2涂層濃度越高，對Zr元素掩蓋作用越明顯(圖2G、K、L)。

A～I：SEM( ×24 000)觀察各組表面納米形態(tài)；J～L：EDS分析5%、15%、30%TiO2涂層表面的元素比例

2.3 壓縮強度和孔隙率

經(jīng)過萬能試驗機測試，發(fā)現(xiàn)最終支架有兩種典型的壓縮強度-位移關(guān)系曲線(圖3A)。第Ⅰ類出現(xiàn)最大斷裂強度后壓縮強度急劇下降，第Ⅱ類最大壓縮強度較第Ⅰ類低，沒有明顯的強度驟降。復合TiO2后樣品的機械強度與原有ZrO2支架組均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，約為1.5 MPa(圖3B)，但雙因素方差分析發(fā)現(xiàn)5%類樣品與15%類樣品的壓縮強度存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。利用比重瓶法對比各組孔隙率，各組孔隙率值均約80%左右，各組之間均無明顯差異(P>0.05)(圖3C)。

A：本實驗全部支架的兩類特征性壓縮強度-位移曲線圖；B：各組壓縮強度；C：各組孔隙率；*：P<0.05

2.4 微管晶型鑒定

LRS檢查了ZrO2支架組、15%TiO2涂層組(未經(jīng)NaOH處理形成納米管)和納米管組型樣品的晶體結(jié)構(gòu)(圖4A)，并聯(lián)合SEM分析結(jié)果。純ZrO2陶瓷顆粒(圖4B)在145 cm-1、259 cm-1和643 cm-1處顯示拉曼峰。用TiO2覆蓋表面后(圖4C)，僅有金紅石型TiO2的237 cm-1、445 cm-1和609 cm-1特征峰[12]。當納米管形成后(圖4D)，兩個物質(zhì)的拉曼光譜重疊并且金紅石相的TiO2拉曼反射表現(xiàn)較弱。

A：拉曼光譜儀(100～800 cm-1)檢測ZrO2支架組、15%TiO2涂層組、納米管組樣品；B～D：掃描電鏡( ×30 000)觀測ZrO2支架組、15%TiO2涂層組、納米管組樣品

2.5 hDPSCs細胞粘附

將未形成納米管的樣品(圖4C)設(shè)為對照組，納米管成型樣品(圖4D)設(shè)為實驗組，兩者的唯一不同在于是否經(jīng)過NaOH處理形成TiO2微管。hDPSCs接種6 h后，通過SEM看到對照組表面細胞團塊呈無形態(tài)的攤平樣貌(圖5A)，實驗組表面有細胞絲狀偽足散布在納米管陣列的孔中，與表面空隙形成了互鎖的細胞結(jié)構(gòu)(圖5B)。利用鬼筆環(huán)肽可染色細胞肌動纖維骨架[13]，接種后6 h的染色圖片也觀測到了實驗組呈現(xiàn)出更為明顯的紡錐狀骨架伸展(圖5C、D)。

A、B：SEM( ×4 000)觀察對照組及實驗組表面，實驗組附帶局部放大細胞偽足；C、D：鬼筆環(huán)肽染色后共聚焦顯微鏡( ×200)觀察對照組及實驗組

2.6 hDPSCs細胞增殖和成骨活性

CCK-8檢測3、5、7 d的OD值表明兩組之間無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)(圖6)。但是在成骨誘導液的培養(yǎng)條件下，ALP檢測表明實驗組細胞4、7 d的ALP活性較實驗組明顯增高(P<0.05)。

A：CCK-8檢測法對各組進行細胞定量；B：實驗組和對照組的ALP活性；*P<0.05

3 討 論

骨組織工程領(lǐng)域的研究目標是設(shè)計出優(yōu)于自體骨和同種異體骨的外源性骨修復策略，因此必須從疾病損傷和治療的角度，進行材料、制造方法和應(yīng)用途徑的選擇[14]。

從臨床角度考慮，骨組織本身足以愈合小的骨缺損及裂紋，但是超出閾值的缺損往往不能較好地恢復。一般認為這個閾值為直徑2.5 cm，超過閾值則需要骨組織工程材料的幫助[15]。成型的不可吸收骨替代材料能夠在缺損處提供空間支撐、時間維持和應(yīng)力配適，進而幫助機體早期承力、美學恢復和遠期功能行使，同時不會因溶解或吸收而產(chǎn)生代謝物質(zhì)、造成局部微環(huán)境改變，是當下不可替代的一種骨修復策略。

本實驗采用的ZrO2及TiO2具備良好的生物安全性，已經(jīng)臨床使用多年[16]。本復合支架的兩類斷裂曲線(圖3A)與小梁結(jié)構(gòu)固有形態(tài)有關(guān)。表面小梁均勻的支架整體受力并在碎裂前形成壓縮強度高點，符合第Ⅰ類曲線。而有些支架表面小梁結(jié)構(gòu)不均勻?qū)е路謮K碎裂，不能呈現(xiàn)整體受力的最大機械強度，表現(xiàn)為第Ⅱ類曲線。TiO2的燒結(jié)溫度約為1 450 ℃，本方法的處理溫度最高為500 ℃，僅去除漿料內(nèi)的有機雜質(zhì)，不能使TiO2顆粒致密化形成陶瓷層，因此無法明顯增強支架強度(圖3B)。15%TiO2涂層NaOH處理24 h的樣品，底物充足、反應(yīng)時長適中，表面觀測到了成型的孔徑100～800 nm的TiO2納米管陣列(圖2E)，其空管樣的結(jié)構(gòu)極大減弱了對拉曼波的反射，并且使底層ZrO2暴露于拉曼波(圖4A)。陣列略微增加原支架壓縮強度至1.76 MPa，接近骨松質(zhì)2～12 MPa的固有性能[17]。而相對過量的NaOH強堿溶液腐蝕了5%TiO2涂層組并降低了其機械強度，因此造成這兩個變量樣品出現(xiàn)統(tǒng)計學差異(P<0.05)(圖3B)。最終支架預期可形成較好的應(yīng)力傳遞，減少骨-修復體結(jié)合界面不良應(yīng)力集中及界面組織損害，優(yōu)化患者體驗和使用年限。滿足機械強度的同時，支架具備相互交聯(lián)的孔網(wǎng)絡(luò)，約80%的孔隙率很好地模擬了骨小梁50%～90%孔隙率的特征[6]。230～820 μm滿足物質(zhì)交換及血管向內(nèi)生長的需求，細胞、神經(jīng)和血管的進入和持續(xù)停留將對于骨組織的重塑產(chǎn)生重要積極影響[18]。

本實驗也證實，此支架方便運輸，并且可通過臨床常見的高溫蒸汽或酒精浸泡消毒處理。在制造成本低的同時，無額外運輸、臨床處理成本，不存在供體感染風險。

機體內(nèi)的細胞行為依賴于它們與細胞外基質(zhì)(ECM)的相互作用[19]。人造底物表面上的納米特征可以與天然ECM相同的方式影響蛋白及細胞粘附、細胞增殖、細胞生化功能甚至細胞分化[20]。蛋白吸附是材料和機體之間的首次交互，影響后續(xù)細胞行為。陽極氧化法生產(chǎn)的TiO2管一般為銳鈦型，有人發(fā)現(xiàn)經(jīng)過特殊處理得到的金紅石型更有利于血清蛋白粘附[21]。同時，細胞表面的整聯(lián)蛋白與早期附著息息相關(guān)，附著過程的關(guān)鍵是力高度敏感的納米管-整聯(lián)蛋白-細胞骨架連鎖反應(yīng)[22]。表面納米結(jié)構(gòu)孔徑?jīng)Q定了細胞表面粘附蛋白的點位和間距，兩者之間的粘附力分散在整聯(lián)蛋白上并傳遞給細胞骨架，細胞骨架上的壓力會進一步觸發(fā)一系列細胞內(nèi)反應(yīng)，從而改變代謝平衡[19]。本實驗通過掃描電鏡及鬼筆環(huán)肽染色細胞肌動蛋白骨架，觀測到了TiO2納米結(jié)構(gòu)陣列產(chǎn)生了類似ECM的作用，促使人牙髓干細胞在接種早期形成絲狀偽足、延伸細胞骨架(圖5B、D)，對細胞早期粘附產(chǎn)生了積極作用，這是骨組織工程希望得到的材料性能[14]。同時，實驗組表面相對不規(guī)則的微觀形態(tài)并未阻滯細胞增殖(圖6A)。細胞內(nèi)ALP在牙本質(zhì)和骨組織成骨礦化的早期出現(xiàn)表達上調(diào)，是干細胞成骨分化的重要指標[10]。成骨誘導液培養(yǎng)條件下，實驗組的表面細胞有更好的成骨分化表現(xiàn)(圖6B)。但是，表面成型TiO2納米管陣列的多孔支架在機體中具體的骨修復表現(xiàn)處于未知狀態(tài)。

綜上所述，本實驗成功提出了一種表面TiO2納米管陣列的成型策略，突破了異類底層材料的限制，成功結(jié)合了具備優(yōu)異宏觀性能的三維多孔ZrO2支架。從毫米級、微米級、納米級分層設(shè)計并制造出一種潛在滿足骨修復多層次需求的骨組織工程材料，并且初步驗證了對于干細胞的早期粘附和成骨分化具有促進作用。

注：所有作者聲明不存在利益沖突