ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的中醫(yī)證型

白云綺 李慧 宋珂 王淑琪 高照 孫克寒 金秋碩 婁利霞 吳愛明 吳圣賢 聶波

摘要 目的：探討長期高脂飼養(yǎng)ApoE-/-小鼠中醫(yī)的證型，為抗動(dòng)脈粥樣硬化證候中藥的研究提供證型動(dòng)物模型。方法：將20只雄性ApoE-/-小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為四妙勇安湯組（SM組）和模型組（M組），每組10只，采用高脂飼料喂養(yǎng)14周建立動(dòng)脈粥樣硬化模型，SM組于造模開始進(jìn)行預(yù)防性給藥。同時(shí)以C57BL/6小鼠10只作為正常對照組（N組）。檢測血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，觀察主動(dòng)脈和肝臟病理，評價(jià)是否為血瘀痰濕證型;通過IL-6、核因子-κB免疫組織化學(xué)變化評價(jià)是否為毒損證型。結(jié)果：與N組比較，M組小鼠血清TC、TG、LDL-C顯著提高，HDL-C顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;肝臟病理出現(xiàn)球形脂滴及炎性細(xì)胞浸潤;主動(dòng)脈出現(xiàn)明顯斑塊，血管內(nèi)膜厚度（IT）、中膜厚度（MT）、斑塊面積（PA）及IT/MT明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），血管管腔面積（LA）明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;免疫組織化學(xué)顯示IL-6、核因子-κB在主動(dòng)脈的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，SM組能夠明顯降低ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈PA、IT及IT/MT，明顯降低IL-6及核因子-κB表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;減輕肝臟病變;但對血脂水平無明顯作用。結(jié)論：長期高脂飼料飼養(yǎng)ApoE-/-小鼠制備的動(dòng)脈粥樣硬化模型為痰濕血瘀毒損型病證結(jié)合動(dòng)物模型。

關(guān)鍵詞 動(dòng)脈粥樣硬化;ApoE-/-小鼠;病證結(jié)合動(dòng)物模型;痰濕血瘀毒損;四妙勇安湯

Preliminary Study on TCM Syndromes of ApoE-/-Mouse Atherosclerosis Model

BAI Yunqi1，LI Hui2，SONG Ke1，WANG Shuqi2，GAO Zhao1，SUN Kehan2，JIN Qiushuo1，LOU Lixia1，WU Aiming1，WU Shengxian1，NIE Bo1，2

（1 Key Laboratory of Chinese Internal Medicine of Ministry of Education and Beijing，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China; 2 School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To explore the long-term high-fat feeding of ApoE-/-mice with TCM syndrome types，and provide animal models for the research of anti-atherosclerosis syndromes in traditional Chinese medicine.Methods：A total of 20 male ApoE-/-mice were divided into Simiao Yongan Decoction group （SM group） and model group （M group） according to the random number table method.10 mice in each group were fed with high-fat diet for 14 weeks to establish atherosclerosis model.Meanwhile，the SM group started preventive administration at the time of modeling.At the same time，10 mice of C57BL / 6 were used as the normal control group （group N）.By measuring serum total cholesterol （TC），triglyceride （TG），high-density lipoprotein cholesterol （HDL-C），and low-density lipoprotein cholesterol （LDL-C） levels，observing aorta and liver pathology to evaluate whether it was the blood stasis phlegm-dampness syndrome type; evaluating whether it was a poisonous syndrome type by the changes of IL-6 and NF-κB immunohistochemical.Results：Compared with the control group，the serum levels of TC，TG，and LDL-C in the model group were significantly increased （P<0.01），HDL-C was significantly reduced （P<0.01）; spherical lipid droplets and inflammatory cell infiltration appeared in the liver pathology; obvious plaques appeared in the aorta; aortic intima thickness （IT），media thickness （MT），plaque area （PA），and IT / MT significantly increased （P<0.01），and the vascular lumen area （LA） decreased significantly （P<0.01）; immunohistochemistry showed that the expression of IL-6 and NF-κB in the aorta was significantly increased （P<0.05）.com

pared with the model group，the SM group can significantly reduce the aorta PA，IT and IT / MT of ApoE-/-mice （P<0.05），and significantly reduce the expression of IL-6 and NF-κB （P<0.05）; it also reduced liver disease but had no significant effect on blood lipid levels.Conclusion：The atherosclerosis model prepared by the classic long-term high-fat feed ApoE-/-mice was preliminary evaluated as an animal model of phlegm dampness and blood stasis and toxin damage.

Keywords Atherosclerosis; ApoE-/-mice; Disease combined syndrome animal model; Phlegm dampness blood stasis toxin damage; Simiao Yongan Decoction

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.01.011

心腦血管疾病發(fā)展的主要病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）。AS屬于中醫(yī)的“脈痹”“胸痹”“眩暈”“中風(fēng)”等病證，既往醫(yī)家將AS概括為“虛”“瘀”“痰”“毒”四證[1-3]，并將AS辨證分型暫分為氣滯血瘀證、痰瘀互結(jié)證、氣虛血瘀證、氣陰兩虛證4種[3]。痰濕、血瘀、毒損始終貫穿動(dòng)脈粥樣硬化整個(gè)病程[4-6]。研究痰濕血瘀毒損型AS模型對于AS的中醫(yī)治療具有重要意義。長期高脂飼料飼養(yǎng)喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠是建立AS動(dòng)物模型的經(jīng)典方法，已經(jīng)被廣泛研究并應(yīng)用于AS的發(fā)病機(jī)制、藥物防治等方面[7]，但尚未見有關(guān)該經(jīng)典模型的中醫(yī)證型研究報(bào)道。因此，本研究以長期高脂飼料飼養(yǎng)ApoE-/-小鼠制備AS模型為研究對象，根據(jù)長期飼養(yǎng)高脂飲食造模的特點(diǎn)，建立主要證候量表，選擇與痰濕、血瘀、毒損密切相關(guān)的客觀指標(biāo)，并運(yùn)用有效方劑四妙勇安湯進(jìn)行反證，評價(jià)ApoE-/-小鼠AS經(jīng)典模型的中醫(yī)證型——痰濕血瘀毒損證，為抗AS證候類中藥的研究提供痰濕血瘀毒損證候動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

C57BL/6小鼠10只，ApoE-/-小鼠20只，雄性，SPF級體質(zhì)量18～22 g，7周齡，采購于維通利華公司，動(dòng)物合格證編號：SCXK（京）2012-0001，本研究得到北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并在此批準(zhǔn)下進(jìn)行（批號：18-17）。高脂飼料（配方：15%脂肪+0.25%膽固醇+84.75%基礎(chǔ)飼料，許可證號：SCXK（京）2014-0008）;基礎(chǔ)飼料（北京科奧協(xié)力飼料有限公司）飼料均經(jīng)60Coγ照射滅菌處理。

1.1.2 藥物

四妙勇安湯組方：玄參（批號：150181431）、當(dāng)歸（批號：150313061）、甘草（批號：150280731）、金銀花（批號：15051904），藥品購買于東直門醫(yī)院藥房，然后在實(shí)驗(yàn)室水煎濃縮制取，分裝4 ℃保存。

1.1.3 試劑與儀器 蘇木精染色液、伊紅溶液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ZLT-9610，ZLT-9613）;IL-6、核因子-κB抗體（Abcam公司，美國，ab8227，ab208113）;三步法免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，SP-9000）;DAB顯色試劑盒（北京Solarbio有限公司，20170628）。光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS公司，日本，OLYMPUS BX60）;體視鏡（上海勤奮儀器廠，XTT型000037）;低溫多用途離心機(jī)（eppendorf公司，德國，Centrifuge 5424R）;全自動(dòng)生化測定儀（BECKMAN COULTER公司，美國，AU5800）;組織切片機(jī)（Arcadia公司，德國，RM2135）;組織包埋機(jī)（Arcadia公司，德國，EG1150）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

所有動(dòng)物飼養(yǎng)條件：室溫保持22～24 ℃，12 h交替照明，相對濕度50%，飲水不限，自由攝食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，10只C57BL/6J為正常對照組（N組），將20只ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為模型組（M組）、四妙勇安湯組（SM組），每組10只。

1.2.2 干預(yù)方法

M、SM組均給予高脂飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，同時(shí)SM組以四妙勇安湯濃縮液34.9 g/kg灌胃[8]，N組和M組給予等量生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)灌胃14周。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1）一般狀況：對各組小鼠每14天測1次體質(zhì)量、進(jìn)食量。觀察各組小鼠的飲水量、毛發(fā)、精神活動(dòng)、大小便、皮膚瘀點(diǎn)瘀斑等一般情況。

2）血脂測定：灌胃14周后進(jìn)行取材，取材前夜禁食但不禁水，采取摘除眼球取血方式，以4 ℃、2 500×g的條件下離心20 min，分離血清，然后取上清液;最后使用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清的三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）指標(biāo)。

3）病理學(xué)檢測：摘眼球取血后，取小鼠肝臟及主動(dòng)脈根部，并放置于4%多聚甲醛中固定24 h，脫水后進(jìn)行石蠟包埋，制片的厚度為3 μm，連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色。在光鏡下觀察小鼠主動(dòng)脈、肝臟病理形態(tài)，并在100倍光鏡下，隨機(jī)選擇3個(gè)視野進(jìn)行采集圖像。用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件對主動(dòng)脈HE染色片子進(jìn)行圖像分析，并測量血管內(nèi)膜厚度（IT）、血管管腔面積（LA）、斑塊面積（PA）、中膜厚度（MT）及IT/MT，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。見圖1。4）主動(dòng)脈免疫組織化學(xué)檢測：制片方法同HE染色，按照試劑盒說明書對樣本進(jìn)行染色、觀察及評分。鏡下染色無色為陰性，計(jì)0分;呈淡黃色為弱陽性，計(jì)1分;呈棕黃色則為陽性，計(jì)2分;呈黃褐色視作強(qiáng)陽性細(xì)胞，計(jì)3分。每張切片選取相同位置的5個(gè)視野打分[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布及方差齊性統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析比較多組之間數(shù)據(jù)平均數(shù)，采用LSD法進(jìn)行組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

高脂飼養(yǎng)2周后，與N組比較，M組出現(xiàn)小鼠皮毛不整、無光澤，飲食量增多，其余癥狀未見明顯異常。4周后，SM組小鼠皮毛光澤度較M組稍有改善，其余癥狀未見明顯異常。小鼠體質(zhì)量變化情況見表1。

2.2 各組小鼠血脂比較

與N組比較，模型組小鼠TC、HDL-C、LDL-C均明顯高于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與M組比較，SM組TC、HDL-C、LDL-C均明顯高于M組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 肝臟、主動(dòng)脈病理學(xué)觀察

主動(dòng)脈HE染色顯示，N組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞排列整齊規(guī)則，內(nèi)膜完整，未見斑塊。與N組比較，M組小鼠主動(dòng)脈根部形成明顯AS斑塊，內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂，內(nèi)膜明顯增厚，中膜平滑肌排列紊亂且萎縮變薄，IT、PA、IT/MT、PA/LA明顯增大，LA明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與M組比較，SM組均有所改善。各組小鼠的主動(dòng)脈組織病理結(jié)果見圖2～3。

肝臟HE染色顯示：N組小鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細(xì)胞索排列整齊呈放射狀，無脂肪變性細(xì)胞，無炎性反應(yīng)和壞死的細(xì)胞。與N組小鼠比較，M組小鼠的肝小葉界限不清晰，出現(xiàn)球形脂滴，炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤;與M組比較，SM組肝組織病理形態(tài)改善，炎性細(xì)胞浸潤和球形脂滴相對減少。各組小鼠肝組織病理觀察結(jié)果見圖4。

2.4 小鼠主動(dòng)脈組織IL-6、NF-κB表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：主動(dòng)脈核因-κB陽性表達(dá)主要位于內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞及中膜平滑肌的細(xì)胞核中，同時(shí)胞質(zhì)中也少量分布，可見棕色染色顆粒;IL-6陽性表達(dá)主要位于內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞及中膜平滑肌的胞質(zhì)中，可見棕色染色顆粒。N組未見棕染顆?；蛏倭孔厝绢w粒。M組可見大量胞核、胞質(zhì)被棕染，較正常組陽性表達(dá)多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與M組比較，SM組細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)染色明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖5～6，表3。

3 討論

AS是導(dǎo)致急性心血管病事件發(fā)病的主要病因，《中國心血管病報(bào)告2018》發(fā)布人類死亡的首要因素是急性心腦血管疾病，約占總死亡率的70%[10]。目前，防治AS多采用調(diào)控血脂、穩(wěn)定斑塊等方法或采用動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)等手段進(jìn)行治療[11]。因AS發(fā)病原因多樣，病理過程復(fù)雜，因此臨床上常規(guī)治療手段及西醫(yī)藥物均不能有效防控AS的發(fā)生[12]。中醫(yī)基礎(chǔ)理論及思維方法在防控AS方面具有獨(dú)特優(yōu)勢，臨床和實(shí)驗(yàn)研究中有近百種中藥復(fù)方對防治AS有積極作用[13]。辨證論治是中醫(yī)學(xué)的基本原則之一，是中醫(yī)治療疾病的特色，是個(gè)體化治療的基礎(chǔ)，所以在研究AS中醫(yī)防治時(shí)，中醫(yī)證型的診斷就尤為重要。動(dòng)物模型有助于進(jìn)行高效、經(jīng)濟(jì)的發(fā)病機(jī)制研究。AS動(dòng)物模型是研究AS疾病的主要方法之一[14]，因此研究與臨床證型相關(guān)的動(dòng)物模型的病證結(jié)合動(dòng)物模型就十分重要。

目前，國內(nèi)外研究AS的動(dòng)物模型種類較多。采用高脂飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠制備AS的造模方法認(rèn)可度高，被廣泛應(yīng)用到AS的發(fā)病機(jī)制、中醫(yī)藥防治等各領(lǐng)域[15-17]，但尚未見對該動(dòng)物模型開展證型分析研究。因此，本研究采用ApoE-/-小鼠并給予高脂飲食14周，建立AS疾病模型，評價(jià)該模型的中醫(yī)證型。小鼠平素食肥甘厚味，傷及脾胃，脾失健運(yùn)，而致氣機(jī)不暢。氣為血之帥，血為氣之母，氣血失調(diào)是痰瘀互結(jié)形成之本，氣虛而至無力行血，血瘀內(nèi)停?！督饏T要略心典》言：“毒，邪氣蘊(yùn)結(jié)不解之謂”。血瘀內(nèi)停日久、臟腑功能失調(diào)，氣血運(yùn)行紊亂，則至毒邪內(nèi)生。瘀血日久內(nèi)生成毒。因此，本研究從理論上推斷該模型是血瘀痰濕毒損證模型。

研究發(fā)現(xiàn)，血瘀證可以出現(xiàn)全身或局部組織器官的缺血、缺氧、血循環(huán)障礙以及血液流變性和黏滯性異常而導(dǎo)致各組織器官血栓形成、組織變性、結(jié)締組織增生等一系列的病理變化[18-19]。本研究選擇常見血栓多發(fā)部位的主動(dòng)脈進(jìn)行病理檢測，M組出現(xiàn)明顯斑塊，內(nèi)膜可見大量泡沫細(xì)胞和膽固醇結(jié)晶沉積，血瘀癥狀明顯。毒邪在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中可以看成毒性氧自由基、炎性反應(yīng)遞質(zhì)和血管活性物質(zhì)的過度釋放[20-22]。本研究選擇機(jī)體處于炎性反應(yīng)，作為判定毒邪內(nèi)生的臨床標(biāo)準(zhǔn)，并對炎性反應(yīng)遞質(zhì)IL-6、核因子-κB進(jìn)行檢測，N組未見棕染顆粒，M組可見大量胞核、胞質(zhì)被棕染，較正常組陽性表達(dá)多。痰濕證被廣泛認(rèn)可為高脂血癥[23]，并常見于肝臟病理、血脂和肝功能指標(biāo)異常，OGTT和ITT異常[24]。本研究選擇肝臟病理和血脂指標(biāo)作為評價(jià)是否為痰濕證的標(biāo)準(zhǔn)，N組小鼠肝臟病理和血脂正常。M組小鼠肝小葉界限不清晰，出現(xiàn)球形脂滴，炎性細(xì)胞浸潤，血脂明顯增高。從實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，該模型符合血瘀痰濕毒損證模型。

SM具有抗炎、降脂、免疫調(diào)節(jié)等作用[25]，已有研究表明，SM可以降低AS家兔血清中基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9），C反應(yīng)蛋白（CRP）水平，減少AS斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量和巨噬細(xì)胞數(shù)量，且在炎性反應(yīng)遞質(zhì)的刺激下，可抑制內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）的分泌，從而均起到抑制炎性反應(yīng)、降脂的作用[26]，發(fā)揮降低血脂、保護(hù)內(nèi)皮功能，穩(wěn)定斑塊等作用。本研究使用SM對痰濕血瘀毒損證候動(dòng)物模型進(jìn)行藥物反證，小鼠一般客觀指標(biāo)得到改善，主動(dòng)脈斑塊減少、主動(dòng)脈IL-6、核因子-κB表達(dá)降低，肝臟球形脂滴及炎性細(xì)胞浸潤相對減少，說明中醫(yī)藥對AS有改善作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對長期高脂飼料飼養(yǎng)ApoE-/-小鼠制備的AS模型進(jìn)行了證型評價(jià)，為痰濕血瘀毒損型進(jìn)一步驗(yàn)證SM具有抑制炎性反應(yīng)，減輕AS程度的作用，為防治AS中醫(yī)藥研究提供病證動(dòng)物模型。然而，目前捕捉到該模型的痰濕血瘀毒損表征有限，下一步更深入研究可加入血流動(dòng)力學(xué)檢測、肝臟超聲等現(xiàn)代技術(shù)手段以及更嚴(yán)謹(jǐn)、具體的動(dòng)物行為學(xué)觀察量表，以期達(dá)到更好的效果。

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（2020-02-13收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）

基金項(xiàng)目：國家科技重大專項(xiàng)（2017ZX09304019）;國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（81403365）;國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81874446）

作者簡介：白云綺（1994.08—），女，碩士研究生，醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治動(dòng)脈粥樣硬化，E-mail：1723668165@qq.com

通信作者：聶波（1977.12—），女，博士，研究員，研究方向：中醫(yī)藥防治動(dòng)脈粥樣硬化及其作用機(jī)制，中藥藥效物質(zhì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及藥物代謝，E-mail：nieboww_1977@163.com