氣相色譜法測定藜麥中肌醇的方法研究

張艷紅 彭鐮心 趙鋼

摘要：采用氣相色譜法檢測藜麥中肌醇的含量。樣品用70%乙醇超聲提取30 min，取上清液減壓蒸發(fā)至干，加入4 mL硅烷化試劑80 ℃衍生20 min，經(jīng)正己烷萃取后，經(jīng)HP-5色譜柱分離，F(xiàn)ID檢測器測定，以出峰時間定性，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，肌醇在0～20 μg/mL，肌醇的濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2>0.999，檢出限和定量限分別為0.5 mg/100 g和1.5 mg/100 g，在3個添加水平下回收率為89.5%～102.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%～4.9%。說明該檢測方法靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，適用于藜麥中肌醇含量的測定。

關(guān)鍵詞：藜麥;肌醇;氣相色譜法

中圖分類號： S512.901 ?文獻標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）10-0162-04

藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）屬于莧科藜屬一年生雙子葉植物[1]，是聯(lián)合國國際糧農(nóng)組織（FAO）確認(rèn)的唯一一種能滿足人體基本營養(yǎng)需求的單體植物，被正式推薦為最適宜人類的完美“全營養(yǎng)食品”，具有“超級谷物”之美譽。它含有豐富的蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪、礦物質(zhì)和維生素等常規(guī)營養(yǎng)成分，還含有黃酮、多酚、槲皮素、皂苷、凝集素等生物活性營養(yǎng)成分[2]，在抗氧化、抗癌、抗炎、降糖降脂、減肥等方面有著較為廣泛的應(yīng)用[3]。

肌醇，別稱環(huán)己六醇，廣泛存在于各種動植物和微生物體內(nèi)，在蕎麥、南瓜、長角豆和柑橘等農(nóng)作物中均含有豐富的肌醇[4-7]。肌醇是動物和微生物的生長因子，其化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于葡萄糖，因此具有多羥基化合物所具有的化學(xué)性質(zhì)[8-9]，且具有類似維生素B1和生物素的作用，它能促進脂肪代謝，降低體內(nèi)膽固醇和甘油三酯水平，對脂肪肝、肝硬化和糖尿病等疾病有免疫、預(yù)防和治療的作用[10-11]。根據(jù)GB 14880―2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品營養(yǎng)強化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》要求，肌醇被允許在調(diào)制乳粉（僅限兒童用乳粉）、果蔬汁（肉）飲料（包括發(fā)酵型產(chǎn)品等）和風(fēng)味飲料中限量添加[12]。

目前尚未發(fā)現(xiàn)專門針對藜麥中肌醇含量測定的相關(guān)報道和研究。有關(guān)文獻報道的肌醇檢測方法多適用于嬰幼兒食品、乳品、飲料和保健食品等，常用的檢測方法有高碘酸鉀氧化法[13-14]、微生物法[15-16]、液相色譜法[4，17]、液相色譜-質(zhì)譜法[18]、氣相色譜法[19-21]、氣相色譜-質(zhì)譜法[22-23]、毛細(xì)管電泳法[24]、離子色譜法[25]等。本試驗在國家標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上[15，21]，采用硅烷化衍生法對肌醇進行衍生后，采用氣相色譜法對藜麥中肌醇的衍生物進行定性定量分析，通過對前處理及衍生方法進行考察，并進行系統(tǒng)性的方法學(xué)驗證，建立了一種準(zhǔn)確可行的藜麥中肌醇的氣相色譜測定方法，以期為藜麥中肌醇的檢測提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器、試劑和材料

7890B氣相色譜儀：帶FID檢測器，美國Agilent公司;CP224S電子天平：德國Sartorius公司;Allegra 64R離心機：美國Beckman Coulter公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠;KQ5200B型超聲波儀：昆山市超聲儀器有限公司;恒溫?zé)崴〔郏罕本┲信d偉業(yè)儀器有限公司。

肌醇標(biāo)準(zhǔn)品（≥99%）：美國Sigma-Aldrich公司;正己烷：美國Fisher公司;無水乙醇、N，N-二甲基甲酰胺：北京迪馬科技有限公司;三甲基氯硅烷：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司;六甲基二硅胺烷：瑞士Fluka公司。

測試樣品藜麥購買于成都家樂福超市，分別為晨億、眾恬、尚貢、倉天然和 CASA VERDE GOURMET共5個品牌的藜麥米。

1.2 肌醇含量測定方法

1.2.1 色譜條件和系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 色譜柱：HP-5（30 m×0.32 mm，0.25 μm）;氮氣流速：1.0 mL/min;進樣口溫度：280 ℃;檢測器溫度：300 ℃;進樣體積：1.0 μL;進樣模式：分流;分流比：10 ∶ 1;溫度程序：120 ℃，保持2 min，以10 ℃/min 升溫至280 ℃，保持5 min。檢測器：氫火焰離子化檢測器（FID）。在上述色譜條件下，肌醇保留時間為11 min左右，且達到峰形對稱，分離良好，標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜和藜麥樣品中肌醇代表性圖譜見圖1和圖2。

1.2.2 溶液配制 肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取100 mg（精確到0.1 mg）經(jīng)過105 ℃烘干2 h的肌醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于100 mL容量瓶中，用70%乙醇溶解并定容至刻度，混勻，配制成 1.0 mg/mL肌醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4 ℃ 條件下保存。取1 mL肌醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液用70%乙醇定容至100 mL，得到濃度為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。硅烷化試劑：分別吸取體積比為 1 ∶ 2 ∶ 8的三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷、N，N-二甲基甲酰胺，混勻，臨用現(xiàn)配。

1.2.3 樣品前處理 （1）試驗處理。稱取試樣2 g于25 mL容量瓶中，加入2/3體積70%乙醇溶液，超聲提取30 min，用70%乙醇定容至刻度，混勻，過濾。取過濾后溶液5 mL于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中。（2）衍生。向濃縮瓶中加入10 mL無水乙醇，在 80 ℃ 水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至近干時再加入5 mL無水乙醇繼續(xù)濃縮至徹底干燥。向濃縮瓶中加入4 mL硅烷化試劑，溶解后轉(zhuǎn)移至有螺紋蓋的離心管中，放置于（80±2） ℃水浴鍋中進行衍生反應(yīng)20 min，反應(yīng)后取出冷卻至室溫，加入10 mL水，混勻后再加入 5 mL正己烷，渦旋 2 min，離心分層后，取上層清液供氣相色譜儀測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲時間對肌醇含量的影響

設(shè)置超聲時間為10、20、30、40、50、60 min進行含量測定試驗，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，超聲時間對藜麥中肌醇含量的影響較為明顯，肌醇含量隨超聲時間的延長而升高，當(dāng)超聲時間到達30 min時，肌醇含量達到最大，當(dāng)超聲時間大于30 min時，肌醇含量基本持平。因此，確定超聲時間為30 min。

2.2 不同濃度的乙醇提取對肌醇含量的影響

試驗以純水、10%～100%乙醇（共11個濃度梯度）作為提取溶劑進行考察，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，不同濃度乙醇對藜麥中肌醇含量的影響較小，總體看來，隨著乙醇濃度的升高肌醇的含量隨之增加，當(dāng)乙醇濃度達到70%時，從藜麥中提取的肌醇含量達到最大，當(dāng)乙醇濃度高于70%時，肌醇的含量有明顯的下降。因此，選擇70%乙醇作為提取溶劑。

2.3 硅烷化條件的考察

選擇“1.2.2”節(jié)中的硅烷化試劑作為衍生化試劑，按照“1.2.3”節(jié)的方法對藜麥進行前處理，比較肌醇衍生物在氣相色譜儀測得的峰面積，考察硅烷化試劑用量、 衍生溫度和時間對藜麥中肌醇含量測

定的影響。

2.3.1 衍生劑用量的考察 選取硅烷化試劑用量分別為2、4、6、8、10 mL肌醇進行衍生反應(yīng)，于80 ℃水浴中反應(yīng)20 min，再加入5 mL正己烷萃取肌醇衍生物后，上機測定，得到不同條件肌醇衍生物的峰面積響應(yīng)，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，當(dāng)硅烷化試劑用量為4 mL時，試樣中的肌醇已經(jīng)完全被衍生化，因此，選擇衍生劑的用量為4 mL。

2.3.2 衍生溫度的考察 選擇硅烷化試劑用量為4 mL，選取衍生溫度為50、60、70、80、90 ℃，衍生反應(yīng)時間為20 min，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，衍生溫度在50、60 ℃時，肌醇衍生物的峰面積低于其他溫度，70～90 ℃肌醇衍生物峰面積響應(yīng)較高且無明顯差別。有文獻報道，肌醇衍生溫度高于80 ℃時，才可生成化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的六（三甲硅氧基）環(huán)己烷[26]，因此選擇80 ℃作為肌醇硅烷化衍生溫度。

2.3.3 衍生時間的考察 選擇衍生劑用量為 4 mL，衍生溫度為80 ℃，選取衍生時間為5、10、20、30、40 min，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，隨著衍生時間不斷的增加，衍生物峰面積變化趨勢不明顯。綜合考慮，確定衍生化試劑用量為4 mL，衍生溫度為 80 ℃，衍生時間為20 min，該條件能滿足藜麥中肌醇測定的衍生化反應(yīng)。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限（LOD）和定量限（LOQ） 分別吸取0.0、0.2、0.5、2.0、5.0、8.0、10.0 mL肌醇標(biāo)準(zhǔn)工作溶液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，按照“1.2.2”步驟操作，獲得0～20 μg/mL肌醇標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在氣相色譜條件下分析測定。以肌醇的濃度為橫坐標(biāo)（x），對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（y），進行線性回歸，以信號噪音比值（S/N）計算方法檢出限（LOD）和方法定量限（LOQ），其中3倍S/N作為LOD，10倍 S/N 作為LOQ，結(jié)果見表1。

2.4.2 精密度試驗 稱取8份藜麥樣品，按本試驗方法進行前處理和上機測定，結(jié)果見表2。平均值為13.2 mg/100 g，RSD為2.10%。

2.4.3 加標(biāo)回收試驗 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在樣品中添加100、250、500 μg 3個濃度梯度的肌醇進行加標(biāo)回收試驗，每次各濃度進行3個平行試驗，并重復(fù)3次，計算加標(biāo)回收率和批內(nèi)、批間的RSD值，結(jié)果見表3。由表3可知，方法回收率為89.5%～102.3%，批內(nèi)和批間RSD值均小于10%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

2.4.4 實際樣品測定 采用本方法對超市購買的5種不同品牌藜麥的肌醇進行含量測定，肌醇的含量分別為16.3、13.6、20.8、12.4、15.2 mg/100 g，采用該方法測定藜麥中的肌醇，能較好地進行目標(biāo)物的定性和定量測定，可準(zhǔn)確測定藜麥中的肌醇含量。

3 結(jié)論與討論

3.1 樣品前處理方法的選擇

本研究分別比較了不同超聲時間、不同濃度乙醇提取和不同硅烷化衍生條件，結(jié)果以70%乙醇超聲提取30 min，衍生劑用量為4 mL在80 ℃條件下衍生20 min，肌醇的提取效率最高，衍生后上機測定的峰面積最大。

3.2 測定方法的選擇

目前，有關(guān)文獻報道的肌醇檢測方法中，高碘酸鉀氧化法適用于肌醇含量較高樣品的檢測，微生物法步驟繁瑣，檢測周期長，液相色譜法一般采用示差折光檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器，該方法靈敏度低，且檢測器類型不太常見，應(yīng)用受到一定限制，液相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法靈敏度高，選擇性好，但儀器價格昂貴，很多實驗室不具備檢測條件。

本研究建立了藜麥中肌醇的氣相色譜測定方法，該方法檢出限低、定量準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可消除雜質(zhì)對目標(biāo)物的影響，各項技術(shù)指標(biāo)均能滿足日常藜麥分析檢測要求，可為藜麥中肌醇測定提供可靠的檢測方法依據(jù)。

參考文獻：

[1]任貴興，楊修仕，么 楊.中國藜麥產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀[J]. 作物雜志，2015（5）：1-5.

[2]陳樹俊，胡 潔，龐震鵬，等. 藜麥營養(yǎng)成分及多酚抗氧化活性的研究進展[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（1）：110-114，122.

[3]申瑞玲，張文杰，董吉林，等. 藜麥的營養(yǎng)成分、健康促進作用及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 中國糧油學(xué)報，2016，31（9）：150-155.

[4]宋 雨，鄒 亮，趙江林，等. 苦蕎萌發(fā)過程中D-手性肌醇含量變化的探究[J]. 食品科技，2016，41（2）：80-83.

[5]李玉丹，黃河勛，周洋洋，等. GC-MS法同時檢測南瓜果實肌醇類和單、雙糖類物質(zhì)的研究[J]. 食品科技，2017，42（5）：279-283.

[6]夏 濤，劉華奇，李玉靈，等. 長角豆中肌醇的提取工藝研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（24）：10112-10114.

[7]肖家欣，彭抒昂，何華平.柑橘果實發(fā)育成熟中果肉游離糖、肌肌醇及鉀含量的變化[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2005，21（6）：255-258，279.

[8]郭會燦，王素娟，郭 英. 肌醇的研究進展[J]. 河北化工，2008，31（7）：5-7.

[9]孫靈霞，陳錦屏. 肌醇生產(chǎn)、應(yīng)用研究及前景展望[J]. 糧食與油脂，2004（11）：6-8.

[10]Bennett M，Onnebo S M，Azevedo C，et al. Inositol pyrophosphates：metabolism and signaling[J]. Cellular and Molecular Life Sciences，2006，63（5）：552-564.

[11]Chakraborty A，Kim S，Snyder S H. Inositol pyrophosphates as mammalian cell signals[J]. Science Signaling，2011，4（188）：re1.

[12]中華人民共和國衛(wèi)生部. 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品營養(yǎng)強化劑使用標(biāo)準(zhǔn)：GB 14880―2012[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

[13]遲云超，張相育，于桂云.高碘酸氧化法測肌醇和甘油含量[J]. 哈爾濱科學(xué)技術(shù)大學(xué)學(xué)報，1994，17（2）：94-98.

[14]張楚富，林清華，粱 會，等. 高碘酸鈉氧化法測定肌醇含量[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），1996，8（2）：255-257.

[15]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中肌醇的測定：GB 5009.270―2016[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[16]范 迪，張夢悅，楊 燕，等. 微生物法測定食品中的肌醇含量[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2018，9（13）：3474-3478.

[17]戴傳波，李建橋，李健秀. 示差折光檢測法檢測肌醇含量[J]. 食品工業(yè)科技，2007，28（4）：222-223.

[18]黃傳峰，張會亮，房子舒，等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定功能飲料中肌醇的含量[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2019，10（4）：1064-1070.

[19]廖燕芝，黃 輝，梁 鋒.氣相色譜法測定嬰幼兒配方食品中肌醇的衍生方法的比較[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2018，9（17）：4639-4644.

[20]安彥新，郭 金，王秀偉，等. 人血漿肌醇?xì)庀嗌V質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法的優(yōu)化及應(yīng)用[J]. 中國優(yōu)生與遺傳雜志，2017，25（10）：28-31，83.

[21]中華人民共和國衛(wèi)生部. 保健食品中肌醇的測定：GB/T 5009.196―2003[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003

[22]招啟文，張可冬，陳 曉，等. 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定固體運動飲料中肌醇的含量[J]. 食品工業(yè)，2017，38（7）：286-288.

[23]曾 靜，時逸吟，張孝剛，等. 固相萃取-氣相色譜法測定嬰幼兒配方奶粉中肌醇含量[J]. 檢驗檢疫學(xué)刊，2014，24（2）：40-43，34.

[24]侯建霞，汪 云，程宏英，等. 毛細(xì)管電泳電化學(xué)檢測分離測定蕎麥中的手性肌醇和肌醇[J]. 分析測試學(xué)報，2007，26（4）：526-529.

[25]王 波，劉阿靜，王彥淳，等. 在線滲析-雙柱串聯(lián)離子色譜法直接檢測嬰幼兒乳粉中的肌醇[J]. 分析試驗室，2015，34（2）：212？215.

[26]黃偉雄，梁富榮. 肌醇硅烷化反應(yīng)的質(zhì)譜研究[J]. 華南預(yù)防醫(yī)學(xué)，2002，28（6）：52-53.