王迎春 王夢 曹文利 田宇柔 康立英 李軍山 牛麗穎

摘要：為了進(jìn)一步完善麻黃-桂枝藥對的質(zhì)量評價方法，利用HPLC法，分別在2種波長條件下，同時測定麻黃-桂枝水煎液中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、香豆素、肉桂酸、桂皮醛5種成分的含量。采用Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，波長分別為210，280 nm。結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、香豆素、肉桂酸和桂皮醛的進(jìn)樣量分別為0.292 6～2.926 0，0.205 6～2.056 0，0.016 2～0.162 0 ，0.021 8～0.218 0，0.052 6～0.526 0 μg時，均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系（r≥0.999 1）;平均加樣回收率為96.24%～104.03%（RSD<3%，n=9）。建立的檢測方法準(zhǔn)確、可靠，可為麻黃-桂枝藥對的質(zhì)量控制及配伍研究提供參考。

關(guān)鍵詞：中藥化學(xué);高效液相色譜;波長切換;含量測定;麻黃;桂枝;藥對

中圖分類號：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：ADOI： 10.7535/hbgykj.2021yx03005

Abstract：In order to further improve the quality evaluation method of Ephedra-Cinnamomi Ramulus drug pair， the contents of ephedrine hydrochloride， pseudoephedrine hydrochloride， coumarin， cinnamic acid and cinnamaldehyde in the decoction of Ephedra-Cinnamomi Ramulus were determined by HPLC at two wavelengths. The analysis was carried out on a Diamonsil C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm） by gradient elution with acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution at a flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was controlled at 35 ℃.The detection wavelength was 210 nm and 280 nm respectively. The results show that it has a good linearity in the ranges of 0.292 6～2.926 0， 0.205 6～2.056 0， 0.016 2～0.162 0， 0.021 8～0.218 0 ?and 0.052 6～0.526 0 μg for ephedrine hydrochloride， pseudoephedrine hydrochloride， coumarin， cinnamic acid and cinnamaldehyde， respectively （r≥0.999 1）. The average recovery rates are 96.24%～104.03% （RSD<3%， n=9）. The established detection method is accurate and reliable， which can provide reference for the quality control and compatibility research of Ephedra-Cinnamomi Ramulus drug pair.

Keywords：chemistry of Chinese material medical; HPLC; wavelength switching; content determination; Ephedra; Cinnamomi Ramulus; drug pair

麻黃-桂枝藥對出自《傷寒論》麻黃湯，為辛溫解表的常用組合[1]。麻黃味辛、微苦，性溫，具有發(fā)汗散寒，宣肺平喘，利水消腫之功效;桂枝味辛、甘，性溫，具有發(fā)汗解肌，溫通經(jīng)脈，助陽化氣，平?jīng)_降氣之功效[2]。麻黃善行肌表衛(wèi)分，乃發(fā)汗之要藥，桂枝透營達(dá)衛(wèi)，助麻黃解表散邪，麻黃、桂枝相須為用[3-5]。麻黃的化學(xué)成分主要包括生物堿類、揮發(fā)油類等[6]，桂枝主要含有揮發(fā)油類、有機酸類等[7-8]。查閱文獻(xiàn)，對麻黃-桂枝藥對的研究多集中在藥理活性等方面[9-12]，對其化學(xué)成分研究較少。徐文杰等[13]研究不同配伍配比對麻黃-桂枝藥對有效成分含量的影響，分別采用GC-MS測定水煎液中麻黃類生物堿含量，采用HPLC測定水煎液中香豆素、桂皮醇、桂皮醛的含量。李曉如等[14]利用氣相色譜-質(zhì)譜對麻黃-桂枝的揮發(fā)油成分進(jìn)行測定。目前未見HPLC法同時測定麻黃-桂枝水煎液中麻黃類生物堿和肉桂酸、桂皮醛等主要成分的報道。本實驗建立HPLC法同時測定麻黃-桂枝藥對水煎液中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、香豆素、肉桂酸和桂皮醛5種成分的含量，為麻黃-桂枝藥對的質(zhì)量控制及配伍的研究提供參考。第3期王迎春，等：HPLC法同時測定麻黃-桂枝藥對水煎液中5種成分的含量河北工業(yè)科技第38卷

1儀器與材料

1.1儀器

LC-15C高效液相色譜儀（SPD-15C型紫外檢測器，日本島津公司提供）;TB-215D電子分析天平（十萬分之一）、BSA224S-CW電子分析天平（萬分之一）（德國賽多利斯集團提供）;KQ-250E型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司提供）。

1.2材料

鹽酸麻黃堿（批號為171241-201508，純度為99.8%）、鹽酸偽麻黃堿（批號為171237-201510，純度為99.8%）、肉桂酸（批號為110786-201604，純度為98.8%），中國食品藥品檢定研究院提供;香豆素（批號為MUST-18040901，純度為99.99%），成都曼思特生物科技有限公司提供;桂皮醛（批號為151119，純度大于等于98.0%），成都普菲德生物技術(shù)有限公司提供。甲醇、乙腈（色譜純），F(xiàn)isher公司提供;磷酸（分析純），天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠提供;水為超純水。實驗所用中藥飲片均為市售中藥飲片，3批麻黃、桂枝飲片分別購自石家莊樂仁堂（麻黃批號為19111001，桂枝批號為20022101）、神威大藥房（麻黃批號為19050101，桂枝批號為19031617）和新興大藥房（麻黃批號為2002121，桂枝批號為190902cp256），經(jīng)河北省藥品檢驗院孫寶惠（主任）鑒定，麻黃為麻黃科植物草麻黃Ephedra sinica Stapf.的干燥草質(zhì)莖，桂枝為樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl.的干燥嫩枝。

2方法與結(jié)果

2.1麻黃-桂枝水煎液制備

稱取麻黃飲片12.0 g，桂枝飲片8.0 g，加10倍量水，麻黃浸泡30 min，先煎煮20 min，加入桂枝繼續(xù)煎煮，煮沸后保持微沸30 min，過濾;藥渣加8倍量水，煮沸后保持微沸20 min，過濾;合并2次濾液，定容至300 mL，得麻黃-桂枝水煎液。

2.2溶液制備

2.2.1對照品溶液

分別精密稱取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、香豆素、肉桂酸、桂皮醛對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.219，0.514，1.017，0.546，0.526 mg/mL的單一對照品儲備液。分別精密量取一定量的上述儲備液，置于同一量瓶中，加甲醇制成每1 mL含鹽酸麻黃堿146.3 μg、鹽酸偽麻黃堿102.8 μg、香豆素8.1 μg、肉桂酸10.9 μg、桂皮醛28.4 μg的混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液

精密吸取2.1項中麻黃-桂枝水煎液4 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）20 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1，檢測波長分別為210 nm（0～20 min）、280 nm（20～60 min），流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL?；旌蠈φ掌泛凸┰嚻啡芤旱腍PLC色譜圖如圖1所示。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對照品溶液2，4，6，10，15，20 μL，按2.3項中色譜條件測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍結(jié)果見表2。

2.4.2精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液10 μL，按2.3項中色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計算各成分峰面積的RSD，依次為0.51%，0.63%，0.78%，0.52%，0.47%。結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液，分別在0，4，8，12，16，24 h按2.3項中色譜條件測定，計算各成分峰面積的RSD，依次為1.23%，0.82%，0.94%，0.59%，1.60%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4重復(fù)性試驗

取同一批麻黃-桂枝水煎液，按2.2.2制備6份供試品溶液，按2.3中色譜條件測定，計算各成分的平均質(zhì)量濃度，分別為0.319 2，0.246 8，0.020 1，0.029 4，0.054 1 mg/mL，RSD分別為2.08%，1.75%，1.83%，1.68%，1.82%。結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.5加樣回收試驗

精密吸取已測得含量的麻黃-桂枝水煎液2.0 mL，平行吸取9份，分別精密加入等同于樣品中各成分含有量50%，100%，150%的各單一對照品儲備液，按照2.2.2項制備供試品溶液，按2.3項中色譜條件測定，計算加樣回收率及RSD，結(jié)果見表3。

2.5樣品測定

取3批次麻黃、桂枝飲片，按2.1項中制備麻黃-桂枝水煎液，按2.2.2項制備供試品溶液，按2.3項中色譜條件測定，平行3次，計算3批水煎液樣品中各成分的含量，結(jié)果見表4。

3討論

麻黃-桂枝為臨床上常用的藥對，是《傷寒論》中辛溫發(fā)汗的常用組合?！秱摗分猩婕奥辄S-桂枝配伍的方劑有9方，分別是麻黃湯（3∶2）、葛根湯（3∶2）、葛根加半夏湯（3∶2）、大青龍湯（3∶1）、小青龍湯（1∶1）、桂枝二越婢一湯（1∶1）、桂枝麻黃各半湯（8∶13）、桂枝二麻黃一湯（5∶13）、麻黃升麻湯（10∶1），各方中麻黃-桂枝的配伍比例以3∶2居多[15]。本實驗參考《傷寒論》中涉及麻黃-桂枝配伍方劑的煎煮方法，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[16-17]，結(jié)合《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》要求，確定了2.1項中樣品溶液制備方法。

本實驗分別考察了乙腈-1%醋酸、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸3種流動相系統(tǒng)，以各色譜峰的分離度和峰形為指標(biāo)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸作為流動相梯度洗脫時，各色譜峰的分離度及峰形較好，故選擇乙腈-0.1%磷酸為流動相。

采用PDA檢測器在200～400 nm進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，結(jié)果鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、香豆素、肉桂酸、桂皮醛5種化學(xué)成分的最大吸收波長分別為205，205，276，276，288 nm，由此選擇210 nm作為檢測鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的波長，選擇280 nm作為檢測香豆素、肉桂酸、桂皮醛的波長。

4結(jié)語

本實驗通過切換波長，建立了HPLC法同時測定麻黃-桂枝藥對水煎液中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、香豆素、肉桂酸、桂皮醛5種化學(xué)成分含量的分析方法，共測定了3批麻黃-桂枝水煎液中上述5種成分的含量。結(jié)果顯示，不同批次麻黃-桂枝水煎液中上述5種成分的含量波動較大，特別是鹽酸偽麻黃堿和桂皮醛的含量。這可能與實驗用的3批麻黃、桂枝的廠家、采收時間及存放時間不同有關(guān)。本實驗所建立的方法操作簡便，重復(fù)性好，可為麻黃-桂枝藥對的質(zhì)量控制與評價及后續(xù)研究提供參考。

本實驗僅對市售的3批不同廠家的麻黃和桂枝飲片按3∶2配比制備的水煎液進(jìn)行了5種成分的含量測定，后續(xù)將會增加樣本數(shù)目，分別測定麻黃、桂枝單煎液和麻黃-桂枝合煎液中主要成分的含量，考察麻黃、桂枝配伍前后各成分含量變化情況。不同配伍配比的麻黃-桂枝水煎液中各成分的含量變化規(guī)律及藥效學(xué)考察有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)/References：

[1]邵家東，陳萌，都廣伍，等.麻黃湯中桂枝的配伍意義解析[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2018，24（9）：1290-1291.

SHAO Jiadong， CHEN Meng， DU Guangwu， et al. Analysis of the significance of compatibility of Guizhi in Mahuang decoction [J]. Journal of Basic Chinese Medicine， 2018，24（9）：1290-1291.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2015年版 一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[3]蔡鴻彥，武曉璐，王春蘭，等. 仲景發(fā)汗解表方中麻黃配伍規(guī)律及臨證體會[J]. 中醫(yī)藥通報，2018，17（4）：15-17.

[4]趙藝，尹學(xué)華，李敬孝.《金匱要略》中麻黃類藥對配伍規(guī)律淺析[J].中醫(yī)藥信息，2014，31（4）：34-35.

[5]蔡鴻彥.《傷寒雜病論》中有關(guān)麻黃配伍的初步探討[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，26（6）：976-977.

[6]汪映宇.草麻黃化學(xué)成分的研究[J].抗感染藥學(xué)，2014，11（5）：416-418.

WANG Yingyu. Study on chemical constitutents of Ephedrae Herba[J]. Anti-Infection Pharmacy，2014，11（5）：416-418.

[7]蔡芷辰，李振麟，徐謙，等.桂枝的化學(xué)成分分析[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20（22）：57-60.

CAI Zhichen， LI Zhenlin， XU Qian， et al. Chemical contituents from Ramulus of Cinnamomum cassia[J]. Chinese Journal of Experimental ?Traditional Medical Formulae， 2014，20（22）：57-60.

[8]徐鋒，王德健，曾南.桂枝揮發(fā)油化學(xué)成分的研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2017，29（3）：532-541.

XU Feng， WANG Dejian， ZENG Nan. Review on chemical components of Rimulus cinnamon essential oil[J]. Natural Product Research and Development，2017，29（3）：532-541.

[9]李向平. 不同環(huán)境溫度刺激下麻黃-桂枝藥對效應(yīng)成分發(fā)汗作用的研究[J].臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)雜志，2014，1（5）：655-657.

LI Xiangping. Different environment temperature stimulation of Ephedra Guizhi medicine research on the effect of component-transpiration effect[J].Journal of Clinical Medical，2014，1（5）：655-657.

[10]鄭芳昊，羅佳波.微透析采樣考察麻黃-桂枝藥對配伍對麻黃堿藥代動力學(xué)的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2016，22（16）：80-83.

ZHENG Fanghao， LUO Jiabo. Pharmacokinetics of ephedrine in rats treated with herb pair of Ephedrae Herba-Cinnamomi Ramulus by microdialysis[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2016，22（16）：80-83.

[11]鄭芳昊，羅佳波.腦透析法考察麻黃-桂枝藥對配伍對麻黃堿在額葉皮層部位藥代動力學(xué)的影響[J].中藥藥理與臨床，2016，32（2）：9-13.

ZHENG Fanghao， LUO Jiabo. Study on pharmacokinetics of ephedrine in rats brain treated with Mahuang-Guizhi pair by microdialysis[J]. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica，2016，32（2）：9-13.

[12]衛(wèi)平，陳飛龍，馬欽海，等.麻黃-桂枝配伍對麻黃類生物堿、桂皮酸及桂皮醇在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)的影響[J].中國藥理學(xué)通報，2016，32（6）：873-880.

WEI Ping， CHEN Feilong， MA Qinhai， et al. Effects of combined administration of Ephedrae-Cinnamomi on pharmacokinetics of ephedra alkaloids， cinnamic acid and cinnamic alcohol in rats[J].Chinese Pharmacological Bulletin，2016，32（6）：873-880.

[13]徐文杰，陳飛龍，謝穎，等.不同配伍配比對麻黃-桂枝藥對有效成分含量的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（10）：84-88.

XU Wenjie， CHEN Feilong， XIE Ying，et al. Content of active compounds in water extracts of Ephedra with Cinnamomi by compatibitity of different ratio[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2012，18（10）：84-88.

[14]李曉如， 梁逸曾， 李曉寧. 氣相色譜-質(zhì)譜和化學(xué)計量學(xué)解析法分析藥對麻黃-桂枝揮發(fā)油成分[J]. 藥學(xué)學(xué)報，2007，42（2）：187-191.

LI Xiaoru， LIANG Yizeng， LI Xiaoning. Analysis of essential oil in Herba Ephendrae-Ramulus Cinnamami by GC-MS and chemometric resolution method[J]. Acta Pharmaceutica Sinica，2007，42（2）：187-191.

[15]隋博文，王浩，張婧，等. 基于“方證相應(yīng)”理論探討麻黃類方中麻黃配伍規(guī)律[J].吉林中醫(yī)藥，2019，39（5）：669-673.

SUI Bowen， WANG Hao， ZHANG Jing， et al. Compatibility rule of Herba Ephedrae in Herba Ephedrae prescription based on correspondence of prescription and syndrome theory [J]. Jilin Journal of Chinese Medicine， 2019，39（5）：669-673.

[16]徐靜，張慧，傅延齡.《傷寒論》《金匱要略》藥物煎煮法中“沸”字探析[J].中醫(yī)雜志，2012，53（19）：1703-1704.

[17]傅延齡，陳非，李東一，等.《傷寒論》方的煮藥時間[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，1998，21（6）：8-11.