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    高效液相色譜法測定豬凝血酶中蔗糖含量

    2021-07-01 11:44:22張理火何麗娟劉璐
    上海醫(yī)藥 2021年7期
    關鍵詞:高效液相色譜法蔗糖

    張理火 何麗娟 劉璐

    摘 要 目的:建立高效液相色譜法測定豬凝血酶中蔗糖含量,并進行方法學驗證。方法:根據分子排阻色譜法,以親水硅膠高效體積排阻色譜柱進行分離,采用示差折光檢測器測定蔗糖含量。結果:該方法專屬性強,線性范圍為0.518~1.658 mg/ml;低、中、高3組濃度蔗糖的平均回收率分別為98.74%、99.35%、100.22%,總平均回收率為99.44%(n=9),相對標準偏差(RSD)為0.82%(n=9);中間精密度RSD為1.65%(n=12)。結論:該方法專屬性強,準確度、精密度、耐用性良好,適用于豬凝血酶中蔗糖含量測定。

    關鍵詞 高效液相色譜法 豬凝血酶 蔗糖

    中圖分類號:R973.1; O657.72 文獻標志碼:A 文章編號:1006-1533(2021)07-0072-04

    Determination of sucrose content in porcine thrombin by HPLC

    ZHANG Lihuo1,2*, HE Lijuan2, LIU Lu1,2**

    (1. Shanghai Haohai Biotechnology Co., Ltd., Shanghai 201613, China; 2. Shanghai Li Kang Rui Biological Engineering Co., Ltd., Shanghai 201707, China)

    ABSTRACT Objective: To establish a method for the determination of sucrose content in porcine thrombin by HPLC. Methods: Based on molecular exclusion chromatography and hydrophilic silica gel column with high efficiency volume exclusion chromatography, the content of sucrose in porcine thrombin was determined by refractive index detector (RID). Results: The method had strong specificity and the linear range was 0.518-1.658 mg/ml. The average recoveries at low, medium and high concentrations of sucrose were 98.74%, 99.35% and 100.22%, respectively and the overall average recovery was 99.44% (n=9), and the overall relative standard deviation (RSD) was 0.82% (n=9). The RSD obtained from the intermediate precision was 1.65%(n=12). Conclusion: This method with good specificity, accuracy, precision and durability is suitable for the determination of sucrose content in porcine thrombin.

    KEy WORDS HPLC; porcine thrombin; sucrose

    豬源纖維蛋白黏合劑由豬纖維蛋白原、豬凝血酶及相應溶解液組成,是臨床常用的輔助止血藥[1]。豬凝血酶由健康豬混合血漿,經分離、提純、病毒滅活(S/D滅活和干熱滅活)、凍干等制成,其中干熱病毒滅活和凍干過程易致使蛋白變性,需加入蛋白保護劑。目前國內使用的保護劑包括單獨使用蔗糖、使用一種或多種氨基酸或者蔗糖和氨基酸聯(lián)合使用等[2]。蔗糖是生物制品中常用的保護劑,具有賦形和抗氧化的作用,其含量與制品的穩(wěn)定性息息相關[3-4]。2015年版《中國藥典》四部通則<3120>人血液制品中糖及糖醇含量測定方法采用離子色譜法[5],但蔗糖在高溫干熱滅活過程中易發(fā)生碳化或水解,表現為非單一的色譜峰,且與制品中常用的抗凝劑-枸櫞酸離子峰存在干擾,導致無法準確測定[2]。另外,藥典方法中供試品溶液的處理過程需加入磺基水楊酸除蛋白,但蔗糖在此酸性條件下易緩慢水解成果糖和葡萄糖,致使主峰下降、定量不準確[2]。因此,蔗糖含量的準確測定對生物制品的質量控制具有重要意義。本研究根據分子排阻色譜法,采用示差折光檢測器測定豬凝血酶中蔗糖含量,并對方法進行驗證。

    1 材料與方法

    1.1 樣品與試劑

    豬凝血酶(批號20191109、20191213、20200108)由本公司生產;蔗糖(HPLC級別,批號D1527058)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲醇(HPLC級,批號110268)購自Hipure Chem公司;自制純化水。

    1.2 主要儀器

    1260高效液相色譜儀和示差折光檢測器購自美國安捷倫科技公司;XSE電子分析天平、ME104電子天平購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;H1650臺式高速離心機(轉子型號:NO.3)購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

    1.3 色譜條件

    色譜柱:PL aquagel-OH 20色譜柱(7.5 mm ×30 cm,5 mm)+ 保護柱(7.5 mm×50 mm,5 mm);柱溫35 ℃;流速0.7 ml/min;示差折光檢測器溫度35 ℃;進樣量20 ml;流動相:甲醇-水=46∶54(v/v)。

    1.4 溶液配制

    1)流動相 量取460 ml甲醇和540 ml純水混合均勻。

    2)對照品溶液 準確稱取蔗糖對照品250 mg至50 ml容量瓶中,加水溶解,定容混勻,即得對照品儲備液。精密量取對照品儲備液1 ml至5 ml容量瓶中,定容混勻,即得對照品溶液。

    3)樣品溶液 取豬凝血酶1瓶,加2.5 ml熱水(75 ℃)溶解,放冷,8 000 r/min離心10 min收集上清液,即得樣品儲備液。精密量取樣品儲備液1 ml至5 ml容量瓶中,定容混勻,即得樣品溶液。

    4)線性溶液 分別精密量取2.5、4、5、6、8 ml對照品儲備液至25 ml量瓶中,定容混勻,即得50%、80%、100%、120%和160%線性溶液。

    5)準確度溶液 精密量取對照儲備液0.8、1.0、1.2 ml和樣品儲備液0.8、1.0、1.2 ml至10 ml容量瓶中,定容混勻,每組平行配制3份,即得R80%-1~R80%-3、R100%-1~R100%-3和R120%-1~R120%-3準確度溶液。

    2 結果

    2.1 專屬性

    取空白溶液、對照品溶液和樣品溶液進樣分析??瞻兹芤簩φ掌啡芤汉蜆悠啡芤褐姓崽堑谋A魰r間(約14.2 min)沒有干擾(圖1),表明該方法專屬性良好。

    2.2 線性

    取50%、80%、100%、120%和160%的線性溶液進樣分析,以蔗糖峰面積對蔗糖濃度作線性回歸,求得線性方程為y = 234 812.50x-24.61,線性范圍為0.518~1.658 mg/ml,相關系數r=0.999 9,符合接受標準(r≥0.990)。

    2.3 準確度

    取R80%-1~R80%-3、R100%-1~R100%-3和R120%-1~R120%-3 3組準確度溶液進樣分析。3組平均回收率分別為98.74%、99.35%、100.22%,總平均回收率為99.44%,RSD為0.82%,滿足接受標準(RSD≤5.0%)(表1)。

    2.4 精密度(重復性、中間精密度)

    在不同日期,由兩位實驗員平行配制6份樣品溶液進樣分析。兩位實驗員測得6份樣品的RSD分別為0.87%、0.73%,測得12份樣品的RSD為1.65%,均滿足接受標準(RSD≤5.0%)(表2)。

    2.5 耐用性

    在其他方法條件不變的前提下,調整流速至方法規(guī)定的±0.1 ml/min、流動相比例至方法規(guī)定的±2%和檢測器溫度至方法規(guī)定的±2 ℃,取樣品溶液進樣分析。各參數微調后測得含量與正常方法測得含量的比值符合接受標準(95.0%~105.0%)(表3),說明該方法耐用性良好。

    2.6 穩(wěn)定性

    取室溫放置0、6、12、24、36、48 h的樣品溶液和對照溶液進樣分析。對照溶液和樣品溶液在不同時間點測得含量與0時間點測得含量的比值均符合接受標準(95.0%~105.0%)(表4),表明對照溶液和樣品溶液穩(wěn)定性良好。

    2.7 樣品檢測

    取3批豬凝血酶,按1.4項制備樣品溶液和1.3項色譜條件分析,測得蔗糖含量分別為3.721、3.685、3.641 mg/ml。3批結果穩(wěn)定,說明方法的適用性良好。

    3 討論

    本研究參照分子排阻色譜法[5]62-63和相關文獻[2-3, 6-7],建立豬凝血酶中蔗糖含量的測定方法。本法樣品制備過程中,采用熱水溶解豬凝血酶,而由此高溫導致蛋白變性而析出的沉淀,采用離心去除,與文獻方法[2-3]和藥典方法[5]相比,無需加入磺基水楊酸蛋白沉淀劑,解決了蔗糖碳化或水解引起定量不準確等問題,從而提高了方法準確性。豬凝血酶中加入的糖類保護劑不止一種,本法僅建立單一保護劑蔗糖含量的測定方法,后續(xù)將開發(fā)一種能同時測定多種保護劑的測定方法。本研究方法易于操作,快速準確,專屬性強,準確度、精密度、耐用性均良好,適用于豬凝血酶中蔗糖含量測定。

    參考文獻

    [1] 劉璐, 趙瑩瑩, 張軍東. 氣相色譜法測定豬凝血酶凍干粉中磷酸三丁酯殘留量[J]. 上海醫(yī)藥, 2017, 38(21): 76-80.

    [2] 王敏力, 楊鵬云, 王箐舟, 等. 高效液相色譜法定量測定人纖維蛋白原中蔗糖含量[J]. 中國藥學雜志, 2013, 48(7): 569-572.

    [3] 雒麗紅, 高雪軍, 魏然, 等. 高效液相色譜法測定生物制品保護劑中蔗糖和乳糖的含量[J]. 中國生物制品學雜志, 2011, 24(8): 964-967.

    [4] 李婷婷, 李煒, 高登蓮, 等. 生物制品常用輔料及其限量檢測方法研究進展[J]. 中國新藥雜志, 2014, 23(24): 2872-2880.

    [5] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典2015年版四部[M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2015: 233-234.

    [6] 李曉東, 張雅軍. 疫苗制品中蔗糖組分質控方法的研究[J]. 中國藥學雜志, 2010, 45(3): 218-220.

    [7] 田春霞, 石文宏. 高效液相色譜法測定藥用輔料蔗糖的含量[J]. 中國醫(yī)藥指南, 2012, 10(24): 71-71; 164.

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