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    禾谷鐮刀菌拮抗菌ZQT-31的分離與鑒定

    2021-07-01 09:41:08張強(qiáng)張艷茹霍云鳳郎劍鋒陸寧海
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年9期
    關(guān)鍵詞:抑菌活性生物防治

    張強(qiáng) 張艷茹 霍云鳳 郎劍鋒 陸寧海

    摘要:從小麥植株殘?bào)w中分離篩選對(duì)禾谷鐮刀菌有拮抗作用的菌株,并對(duì)抑菌活性進(jìn)行初步研究,從而為禾谷鐮刀菌所致病害的生物防治提供參考依據(jù)。采用平板稀釋法和皿內(nèi)對(duì)峙法分離獲得一株禾谷鐮刀菌拮抗菌株 ZQT-31,根據(jù)形態(tài)、生理生化特征以及16S rDNA和gyrA序列分析將其鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)具有明顯抑制作用。在穩(wěn)定性方面,無(wú)菌發(fā)酵液中的活性物質(zhì)對(duì)溫度和酸堿度均具有一定的耐受性。通過(guò)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),菌株ZQT-31可能具有芽孢桿菌溶素及豐原素B合成相關(guān)基因。此外,菌株 ZQT-31 對(duì)鏈格孢菌等6種植物病原真菌均具有明顯的抑制作用。綜上所述,貝萊斯芽孢桿菌ZQT-31對(duì)禾谷鐮刀菌所致病害具有一定的生防潛力。

    關(guān)鍵詞:禾谷鐮刀菌;貝萊斯芽孢桿菌;生物防治;抑菌活性

    中圖分類號(hào): S435.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A ?文章編號(hào):1002-1302(2021)09-0080-06

    禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)作為一種重要的植物病原真菌,能夠在小麥的不同生育階段進(jìn)行侵染,引起小麥赤霉病、莖基腐病等病害的發(fā)生[1-2]。在氣候和耕作制度等多種因素的綜合影響下,小麥赤霉病在我國(guó)的流行頻率顯著增加,并呈現(xiàn)北擴(kuò)西移的趨勢(shì),我國(guó)年均發(fā)病面積超過(guò)小麥種植面積的20%[3-5]。小麥莖基腐病在我國(guó)黃淮小麥主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生,而且出現(xiàn)加重和蔓延的趨勢(shì)[6]。此外,禾谷鐮刀菌還可以侵染玉米,導(dǎo)致玉米穗腐病和玉米莖基腐病的發(fā)生[7-8]。禾谷鐮刀菌不僅會(huì)使作物出現(xiàn)產(chǎn)量損失和品質(zhì)下降,而且能夠分泌脫氧血腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)等多種真菌毒素,致使人畜健康受到威脅[9]。

    生物防治技術(shù)在植物病害綜合治理中具有重要作用,不僅能夠有效保障食品和環(huán)境安全,而且對(duì)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)綠色發(fā)展具有重大意義[10]。研究表明,芽孢桿菌已經(jīng)成為禾谷鐮刀菌生物防治中研究最為廣泛的菌株。例如,枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) AF0907及Zl-2對(duì)禾谷鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)都具有抑制作用[11-12]。解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefacien) WPS4-1及CPLK1314不僅可以抑制禾谷鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā),而且具有良好的DON毒素降解能力[13-14]。巨大芽孢桿菌(B. megaterium) BM1、貝萊斯芽孢桿菌(B. velezensis) RC218都可以有效降低小麥赤霉病的發(fā)生率,并且減少病原菌毒素的合成[15-16]。本研究從田間小麥植株殘?bào)w上分離到1株對(duì)禾谷鐮刀菌具有明顯拮抗作用的芽孢桿菌ZQT-31,通過(guò)對(duì)該菌株的鑒定及拮抗特性等方面進(jìn)行研究,以期為禾谷鐮刀菌的生物防治提供微生物資源,并為后續(xù)生防機(jī)理的研究奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)菌株

    禾谷鐮刀菌(F. graminearum) PH-1,由西北農(nóng)林科技大學(xué)普度大學(xué)聯(lián)合研究中心提供。鏈格孢菌(Alternaria alternata)、膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、甜櫻間座殼菌(Diaporthe eres)、嘴突臍孢(Exserohilum rostratum)、尖孢鐮刀菌(F. oxysporum)、層出鐮刀菌(F. proliferatum)均為實(shí)驗(yàn)室分離保存菌株。貝萊斯芽孢桿菌(B. velezensis)ZQT-31,分離于田間小麥植株殘?bào)w。

    1.2 培養(yǎng)基

    PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、H2O 1 L。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、NaCl 5 g、牛肉膏3 g、瓊脂15 g、H2O 1 L,pH值為7.4~7.6。YEPD培養(yǎng)基:酵母提取物3 g、葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、H2O 1 L。

    1.3 細(xì)菌的分離

    2019年6月于河南科技學(xué)院東區(qū)試驗(yàn)田采集小麥植株殘?bào)w,并帶回資源與環(huán)境學(xué)院植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離及后續(xù)試驗(yàn)。將樣品剪成 2 cm 左右小段,用無(wú)菌水沖洗干凈,放入75%乙醇浸泡3 min,之后用無(wú)菌水沖洗3遍。在無(wú)菌研缽中,放入消毒后的樣品、適量石英砂10 mL無(wú)菌水進(jìn)行研磨。將研磨液置于80 ℃條件下,處理30 min,以殺死絕大部分非芽孢細(xì)菌。取100 μL研磨液涂布于牛肉膏蛋白胨平板,30 ℃下培養(yǎng)2~3 d。根據(jù)菌落特征挑取不同單菌落,劃線純化后保存。

    1.4 禾谷鐮刀菌拮抗細(xì)菌的篩選

    采用皿內(nèi)對(duì)峙法,將直徑5 mm大小的禾谷鐮刀菌菌餅置于PDA平板中央,挑取待測(cè)細(xì)菌菌株接種于4點(diǎn)(距平板中心25 mm處),25 ℃下培養(yǎng) 3 d,計(jì)算抑菌率。抑菌率=(對(duì)照組菌落直徑-試驗(yàn)組菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100%。

    1.5 菌株ZQT-31分類鑒定

    1.5.1 形態(tài)及生理生化鑒定 具體方法參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行[17]。

    1.5.2 分子生物學(xué)鑒定 以菌株ZQT-31基因組DNA為模板,利用通用引物(表1)分別對(duì)16S rDNA和gyrA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,在GenBank網(wǎng)站下載相關(guān)菌株的16S rDNA序列,用ClustalX 1.83軟件進(jìn)行比對(duì),之后利用Mega 7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    1.6 菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液的獲得

    挑取ZQT-31單菌落于10 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,30 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h,之后按照10%接種量轉(zhuǎn)接至新的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,30 ℃、180 r/min培養(yǎng)72 h,從而獲得ZQT-31發(fā)酵液。將發(fā)酵液12000 r/min離心15min,取上清液,并用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,進(jìn)而獲得無(wú)菌發(fā)酵液。

    1.7 菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制作用

    1.7.1 對(duì)菌落生長(zhǎng)的抑制作用 將菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液與融化好的PDA培養(yǎng)基按照體積比為 1 ∶ 9 混合倒板,于平板中心位置接種5 mm大小禾谷鐮刀菌菌餅,25 ℃培養(yǎng)3 d,計(jì)算抑菌率。對(duì)照組以牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基代替無(wú)菌發(fā)酵液,每個(gè)處理重復(fù)3次。

    1.7.2 對(duì)菌絲形態(tài)的抑制作用 將1 mL禾谷鐮刀菌孢子懸浮液加入到9 mL酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基(YEPD)中,25 ℃、150 r/min搖培12 h,以獲得菌絲體。之后按照10%終濃度加入菌株 ZQT-31 無(wú)菌發(fā)酵液,25 ℃、150 r/min 搖培24 h后觀察菌絲的形態(tài)特征。對(duì)照組以牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基代替無(wú)菌發(fā)酵液,每個(gè)處理重復(fù)3次。

    1.8 菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液的穩(wěn)定性

    1.8.1 熱穩(wěn)定性 將菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液分別置于30、50、70、90、110 ℃下處理30 min,計(jì)算不同溫度處理后的無(wú)菌發(fā)酵液抑菌率,每個(gè)處理重復(fù)3次。

    1.8.2 pH值穩(wěn)定性 將菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液的pH值分別調(diào)至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0,室溫靜置4 h后,重新將pH值調(diào)至中性,計(jì)算不同pH值處理后的無(wú)菌發(fā)酵液抑菌率,每個(gè)處理重復(fù)3次。

    1.9 菌株ZQT-31抗菌物質(zhì)的PCR檢測(cè)

    菌株ZQT-31抗菌物質(zhì)的種類采用已報(bào)道抗菌物質(zhì)合成相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)[18],引物序列見(jiàn)表2。

    1.10 菌株ZQT-31對(duì)不同植物病原真菌的拮抗作用

    采用皿內(nèi)對(duì)峙法,將5 mm直徑的不同病原真菌菌餅置于PDA平板中央,挑取菌株ZQT-31接種于4點(diǎn)(距平板中心25 mm處),25 ℃下培養(yǎng)5 d,沿細(xì)菌菌落與平板中心方向,測(cè)量細(xì)菌菌落邊緣至真菌菌落邊緣的距離,即抑菌帶寬度。每個(gè)處理重復(fù)3次。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 拮抗菌株的分離與篩選

    從小麥植株殘?bào)w中分離篩選出7株對(duì)禾谷鐮刀菌具有拮抗作用的菌株,其中ZQT-31的拮抗作用較為明顯。皿內(nèi)對(duì)峙結(jié)果表明,菌株ZQT-31對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌率為(55.6±0.5)%(圖1)。

    2.2 菌株ZQT-31的分類鑒定

    2.2.1 形態(tài)特征及生理生化特征 菌株ZQT-31在PDA培養(yǎng)基上形成的菌落不透明,顏色為乳白色,表面有褶皺,邊緣不規(guī)則。菌體桿狀、革蘭氏染色陽(yáng)性。生理生化分析結(jié)果表明,菌株ZQT-31可以利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇,能夠水解淀粉和明膠,氧化酶反應(yīng)、接觸酶反應(yīng)、硝酸鹽還原反應(yīng)及V-P(Voges-Proskauer)反應(yīng)都呈陽(yáng)性,甲基紅反應(yīng)和H2S反應(yīng)呈陰性(表3)。

    2.2.2 16S rDNA及gyrA基因序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 以菌株ZQT-31基因組DNA為模板,對(duì)16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)測(cè)序得到 1 500 bp 左右的序列。GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果表明,拮抗菌株ZQT-31的16S rDNA核酸序列與芽孢桿菌屬的解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens) TPS17(MK130898)、貝萊斯芽孢桿菌(B. velezensis) YEBBR6(MT372157)以及枯草芽孢桿菌(B. subtilis)ZD-16(KF863785)等多個(gè)菌株的同源性達(dá)到100%,由此能夠?qū)QT-31初步鑒定為Bacillus sp.。

    進(jìn)一步對(duì)gyrA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增與測(cè)序,GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果表明,ZQT-31的gyrA序列與貝萊斯芽孢桿菌多個(gè)菌株的序列同源性達(dá)99%以上。采用鄰接法構(gòu)建gyrA序列系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果表明,菌株ZQT-31與貝萊斯芽孢桿菌DSYZ、CGMCC聚類在一起,形成1個(gè)分支(圖2)。結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特征,將菌株ZQT-31鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

    2.3 菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌作用

    在PDA培養(yǎng)基中加入菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液后,禾谷鐮刀菌的菌落生長(zhǎng)受到明顯的抑制,氣生菌絲的形成減少,并且菌落色素加深。經(jīng)計(jì)算抑菌率為(56.1±2.4)%(圖3-A)。用10%終濃度的菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液處理禾谷鐮刀菌的菌絲24 h,導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)出現(xiàn)畸形,頂端囊泡化。對(duì)照組的菌絲生長(zhǎng)正常,且粗細(xì)均勻(圖3-B)。結(jié)果表明,ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液可以明顯抑制禾谷鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)。

    2.4 菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液的穩(wěn)定性

    菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液經(jīng)30~110 ℃的5個(gè)不同溫度處理30 min后,對(duì)禾谷鐮刀菌的菌落生長(zhǎng)都具有一定的抑制作用。30 ℃下,無(wú)菌發(fā)酵液的抑菌率最高。隨著溫度升高,無(wú)菌發(fā)酵液的抑菌率與30 ℃相比均有所降低,但仍保持在40%以上(圖4-A)。菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液經(jīng)5個(gè)pH值條件處理后,都具有抑菌活性。其中pH值為7.0時(shí),抑菌率最高。過(guò)酸或過(guò)堿條件下,無(wú)菌發(fā)酵液的抑菌率有所降低,但都保持在40%左右(圖4-B)。由此說(shuō)明,菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液中的活性物質(zhì)對(duì)溫度及酸堿度都具有一定的耐受性。

    2.5 菌株ZQT-31拮抗物質(zhì)基因的鑒定

    利用6對(duì)拮抗物質(zhì)基因的引物對(duì)菌株ZQT-31的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳結(jié)果(圖5)顯示,bacAB及fenB基因能夠被成功擴(kuò)增。由此推測(cè),菌株ZQT-31基因組中可能存在芽孢桿菌溶素及豐原素B合成基因,并產(chǎn)生相應(yīng)的抗菌物質(zhì)。

    2.6 菌株ZQT-31對(duì)不同植物病原真菌的拮抗作用

    皿內(nèi)對(duì)峙結(jié)果(圖6、表4)表明,菌株ZQT-31對(duì)6種植物病原真菌都具有明顯的抑制作用。其中對(duì)膠孢炭疽菌及鏈格孢菌的抑制作用最為明顯,抑菌帶分別為9.1、8.4 mm左右;其次為鏈格孢菌,抑菌帶為(8.4±0.5) mm;對(duì)嘴突臍孢、尖孢鐮刀菌及層出鐮刀菌的抑菌帶均在5~6 mm之間,而對(duì)甜櫻間座殼菌的抑菌帶小于4 mm。由此說(shuō)明,菌株 ZQT-31 具有一定的抑菌譜。

    3 討論與結(jié)論

    利用微生物及其代謝產(chǎn)物對(duì)植物病害進(jìn)行生物防治具有重要意義,拮抗微生物作為一種主要的生防因子被廣泛使用,其種類十分豐富,主要分為真菌、細(xì)菌、放線菌、病毒等[10]。本研究從小麥植株殘?bào)w上分離到1株對(duì)禾谷鐮刀菌具有明顯抑制作用的拮抗菌株ZQT-31,通過(guò)生理生化特性和系統(tǒng)進(jìn)化分析將其鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。該菌株的無(wú)菌發(fā)酵液能夠影響禾谷鐮刀菌菌落的正常生長(zhǎng),并且導(dǎo)致菌絲出現(xiàn)畸形。并且無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)溫度和酸堿度具有一定耐受性,從而能夠?yàn)楹坦如牭毒虏『Φ纳锓乐翁峁┪⑸镔Y源和理論基礎(chǔ)。此外,菌株ZQT-31對(duì)膠孢炭疽菌等6種植物病原真菌均有較好的抑制效果,說(shuō)明ZQT-31具有防治多種真菌病害的潛力。

    研究表明,貝萊斯芽孢桿菌不僅能夠抵御病原微生物,而且可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)[19]。例如貝萊斯芽孢桿菌G341對(duì)灰霉菌等多種病原真菌都具有較強(qiáng)的抑制作用[20]。孫平平等研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌L-1對(duì)梨灰霉和青霉菌均具有較強(qiáng)的抑制作用,可以導(dǎo)致病原菌菌絲膨大畸形[21]。水稻內(nèi)生菌貝萊斯芽孢桿菌E69可以抑制稻瘟菌分生孢子的萌發(fā)及附著胞的形成,而且在水稻莖部具有較好的定殖能力[22]。本研究發(fā)現(xiàn),貝萊斯芽孢桿菌 ZQT-31 能夠抑制禾谷鐮刀菌的菌落生長(zhǎng),而且無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用也很明顯,從而說(shuō)明該菌株可能具有防治禾谷鐮刀菌所致病害的潛力,但須要進(jìn)一步的生防試驗(yàn)的證實(shí)。

    芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì),如脂肽類、聚酮類及抗菌蛋白等。其中,脂肽類抗生素最為常見(jiàn),包括豐原素、伊枯草菌素、表面活性素等,而且可以在抑制真菌病害的過(guò)程中起到重要作用[23-24]。從貝萊斯芽孢桿菌P9發(fā)酵上清液中提取的脂肽類粗提物在0~50 ℃條件下具有良好的穩(wěn)定性。雖然隨著溫度的升高,其穩(wěn)定性逐漸降低,但是仍然對(duì)尖孢鐮刀菌具有一定的抑制能力[25]。貝萊斯芽孢桿菌504具有豐原素A等多個(gè)基因簇,可用于編碼脂肽和聚酮糖類化合物。在穩(wěn)定性方面,該菌株無(wú)菌發(fā)酵液能夠耐受高溫和蛋白酶的降解[26]。劉雪嬌等研究發(fā)現(xiàn),貝萊斯芽孢桿菌3A3-15具有伊枯草菌素C等多個(gè)抑菌基因,并且可以產(chǎn)生 C14~C15 Surfactin A這一抑菌物質(zhì)[27]。本研究選用6種抗菌合成基因的引物對(duì)菌株ZQT-31的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,最終檢測(cè)到芽孢桿菌溶素及豐原素B合成相關(guān)基因。此外,菌株ZQT-31的無(wú)菌發(fā)酵液中的活性物質(zhì)能夠耐受高溫的處理,具有一定的熱穩(wěn)定性,由此可以推測(cè)該菌株的抗菌活性物質(zhì)可能為脂肽類物質(zhì),但是具體物質(zhì)的種類有待進(jìn)一步分析。

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