短小芽孢桿菌HR10產(chǎn)孢培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化

王朝恩， 劉婉慧， 陸藍(lán)翔， 付歡歡， 石慧敏， 史紀(jì)武， 葉建仁

(南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

隨著我國(guó)森林綠化面積地不斷擴(kuò)大，人工林栽植面積逐年增加[1]，在人工林的培育過(guò)程中，簡(jiǎn)單追求高產(chǎn)出，長(zhǎng)時(shí)間過(guò)度使用化學(xué)肥料，造成土壤板結(jié)，破壞土壤結(jié)構(gòu)，引起土壤養(yǎng)分失衡，進(jìn)而引發(fā)樹(shù)木生長(zhǎng)不良，病害問(wèn)題突出[2-4]。尋找有效提高土壤肥力、促進(jìn)林木生長(zhǎng)的方法，成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。陳延熙根據(jù)微生態(tài)學(xué)理論(Microecology)提出了“植物微生態(tài)學(xué)”的概念，即任何植物個(gè)體都是其組織細(xì)胞與其體內(nèi)微生物組成的復(fù)合體[5]，其原理是利用菌株搶占生態(tài)位[6]，調(diào)節(jié)植物喜好的酸堿環(huán)境[7]，建立生物屏障阻止有害微生物入侵，并刺激植物或者自身產(chǎn)生有益物質(zhì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)[8]，提高植物抗病能力[6-9]。近些年微生物菌劑的研究逐漸深入，大量有益微生物得到推廣和應(yīng)用并取得了良好效果，如唐旭[10]在一年生黑松、馬尾松和濕地松上施用解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) JK-AH7，促生效果明顯。果樹(shù)作為特種經(jīng)濟(jì)林具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，常年單一樹(shù)種種植，管理不當(dāng)可能導(dǎo)致病原菌積累，在不利的環(huán)境下可能引起病害導(dǎo)致果樹(shù)樹(shù)勢(shì)衰弱，果品質(zhì)量下降，帶來(lái)嚴(yán)重的生態(tài)危害和經(jīng)濟(jì)損失[11-12]，如由葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)引起的蘋(píng)果輪紋病、葉斑病[13]，藍(lán)莓的枯死病和潰瘍病等[14]。楊星[15]在美國(guó)薄殼山核桃上施用多種有益微生物，表明合適的微生物菌劑可以有效提高植物光合作用，促進(jìn)果樹(shù)生長(zhǎng)，增強(qiáng)樹(shù)勢(shì)。竇承陽(yáng)等[16]在梨樹(shù)上施用水拉恩氏菌(Rahnellaaquatilis) JZ-GX1顯著增加了梨樹(shù)的地徑，提升了葉片生理指標(biāo)，增加了土壤有效磷含量，平衡了土壤養(yǎng)分，提升了果實(shí)品質(zhì)。大量研究結(jié)果表明有益微生物可以有效促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高植物抗病能力。傳統(tǒng)的有益微生物的施用形式多為液體[10,15-16]，存在運(yùn)輸成本高、儲(chǔ)存時(shí)間短、存活率低等缺點(diǎn)，而固體菌劑因其體積小、貨期長(zhǎng)、活性高等優(yōu)點(diǎn)受到了廣泛關(guān)注。固體菌劑在制備過(guò)程中過(guò)低的存活率一直是研究的一大難點(diǎn)，芽孢(endospore)因其含水量極低，抗逆性強(qiáng)，能經(jīng)受高溫、紫外線、電離輻射以及多種化學(xué)物質(zhì)滅殺等特性[17-18]，在制備固體菌劑的研究中成為重要的一環(huán)[19]。已經(jīng)有大量學(xué)者使用優(yōu)化的培養(yǎng)基提高產(chǎn)孢率，如吳海霞等[20]對(duì)海洋解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)GM-1-1產(chǎn)孢培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，細(xì)菌總數(shù)和芽孢率分別達(dá)7.40×109cfu/mL和89.42%，芽孢率的提高可以有效提升益生菌的生存能力及產(chǎn)品的穩(wěn)定性，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供廣闊的前景。短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)HR10是本重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在黑松-黃色須腹菌(Rhizopogenluteous, Rl)菌根根際土壤中分離得到的一株菌根輔助細(xì)菌(Mycorrhiza helper bacteria, MHB)，屬于芽孢桿菌屬，革蘭陽(yáng)性，是一類(lèi)嚴(yán)格需氧或者兼性厭氧、能夠形成內(nèi)生孢子的芽孢桿菌[21]。盛江梅等[22]對(duì)其離體互作試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株HR10的菌體及胞外代謝產(chǎn)物均可有效提高Rl菌絲的生長(zhǎng)，其菌體對(duì)Rl菌絲生長(zhǎng)的增長(zhǎng)率達(dá)到13.1%。盆栽試驗(yàn)表明，HR10菌株與Rl雙接種黑松幼苗后，對(duì)松苗生長(zhǎng)有顯著地促進(jìn)作用，還有效提高了根系的菌根侵染率。單接種HR10實(shí)驗(yàn)表明對(duì)黑松也有良好地促生效果。侯亮亮等[23]在將菌株HR10與苗木猝倒病病原絲核菌(Rhizoctoniasp.)離體平板對(duì)抗培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)其對(duì)病原菌有較為明顯地抑制作用，抑菌率達(dá)85.58%。松苗活體實(shí)驗(yàn)中菌株HR10的發(fā)病率和病死率顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明該菌株是一株優(yōu)良的生防菌，應(yīng)用潛力巨大。本研究通過(guò)對(duì)菌株HR10進(jìn)行碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的篩選并研究其最佳的培養(yǎng)條件，以達(dá)到提高芽孢率，增加產(chǎn)品活性，降低成本的目的，為其日后的工業(yè)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus)HR10菌株由南京林業(yè)大學(xué)森林病理實(shí)驗(yàn)室提供，該菌株同時(shí)也保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，NO. M2010143)。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) ①細(xì)菌活化培養(yǎng)基(NA)：牛肉膏3，NaCl 5，蛋白胨10，瓊脂18，蒸餾水定容至1 L，pH 7.2。②細(xì)菌種子液培養(yǎng)基(液體LB)：酵母膏5，胰蛋白胨10，NaCl 10，蒸餾水定容至1 L，pH 7.2。③計(jì)數(shù)培養(yǎng)基(固體LB)：酵母膏5，胰蛋白胨10，NaCl 10，瓊脂18，蒸餾水定容至1 L，pH 7.2。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 光照恒溫?fù)u床(TS-211GZ，上海儀純實(shí)業(yè)有限公司)；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2D，上海旌派儀器有限公司)；pH計(jì)(JB/T 7815，梅特勒-托利多儀器有限公司)；水浴鍋(JK-WB-20B，上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司)；高壓滅菌鍋(HVE-50，南京博惠科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化 取出保存于-80 ℃的菌種HR10，使用接種環(huán)采用平板劃線法將原種液接種在LB固體平板上，28 ℃培養(yǎng)24 h。然后挑取單菌落接種在裝液量為50/250 mL的NA培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min培養(yǎng)18 h[24]。

1.2.2 種子液的制備 取活化后的菌液以1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，LB培養(yǎng)基裝液量50/250 mL，28 ℃，200 r/min培養(yǎng)18 h后備用。

1.2.3 活菌與芽孢的計(jì)數(shù) 采用稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌量。取待測(cè)發(fā)酵液按稀釋10-1～10-8梯度，最后分別吸取10-6、10-7、10-8稀釋液200 μL于已靜置24～48 h的LB固體培養(yǎng)基上，用無(wú)菌刮鏟將稀釋菌液涂抹均勻，為防止在培養(yǎng)過(guò)程中被污染，將培養(yǎng)皿用封口膜密封后，28 ℃培養(yǎng)24～48 h，計(jì)數(shù)各培養(yǎng)皿菌落數(shù)。芽孢計(jì)數(shù)時(shí)，先將待測(cè)菌液80 ℃水浴10 min，只保留存活的芽孢，然后進(jìn)行芽孢計(jì)數(shù)，其計(jì)數(shù)方法與活菌計(jì)數(shù)方法相同，芽孢率(%)=芽孢數(shù)/活菌數(shù)×100%[25]。

1.2.4 發(fā)酵液中不同培養(yǎng)時(shí)期芽孢率變化曲線的測(cè)定 使用初始LB液體培養(yǎng)基，在發(fā)酵培養(yǎng)的0、8、16、28、40、52、64、76、88、100 h分別測(cè)定發(fā)酵液中的活菌數(shù)和芽孢數(shù)。發(fā)酵培養(yǎng)液的接菌量為2%(體積分?jǐn)?shù))，裝液量50/250 mL，培養(yǎng)條件為28 ℃，200 r/min。

1.2.5 培養(yǎng)基優(yōu)化 ①單因素篩選：a.最佳碳源及濃度的篩選：用葡萄糖、糖蜜、玉米粉、麥芽糖、淀粉、蔗糖等相等質(zhì)量分別代替LB培養(yǎng)基中的碳源，250 mL三角瓶裝液量40%(體積分?jǐn)?shù))，接種量2%(體積分?jǐn)?shù))，200 r/min，28 ℃搖床培養(yǎng)64 h計(jì)數(shù)。測(cè)定每毫升活菌數(shù)和芽孢數(shù)并計(jì)算芽孢率。并將糖蜜和葡萄糖分別以0.3%、0.5%、0.8%、1%、2%、3%、4%、5%、8%、10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))混合配制培養(yǎng)基，其他成分及培養(yǎng)條件不變，確定碳源濃度添加范圍。b.最佳氮源及濃度的篩選：生豆粉、豆粕粉、豆餅粉、魚(yú)粉、大豆蛋白胨、尿素含有氨基酸、酰胺和胺等可以被細(xì)菌轉(zhuǎn)化吸收合成蛋白質(zhì),核酸及含氮的代謝產(chǎn)物等可以作為有機(jī)氮源，硫酸銨、硝酸銨中的銨鹽可以直接被利用作為無(wú)機(jī)氮源[26]。將上述氮源等質(zhì)量代替LB培養(yǎng)基中的氮源，確定最佳氮源，并將確定的氮源分別設(shè)置為0.3%、0.5%、0.8%、1%、2%、3%、4%、5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，其他成分不變，培養(yǎng)條件同①a，確定氮源濃度范圍。c.最佳無(wú)機(jī)鹽及濃度的篩選：林司曦等[24]研究結(jié)果表明，KCl對(duì)菌種HR10生長(zhǎng)具有明顯促進(jìn)作用，選用KCl作為其中一種確定的無(wú)機(jī)鹽并探索其最佳濃度，再分別添加0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的K2HPO4·3H2O、MnSO4、NaCl、FeSO4·7H2O、CaCO3、KH2PO4、FePO4·4H2O、ZnSO4、MgSO4·7H2O等無(wú)機(jī)鹽，培養(yǎng)條件同①a，確定最佳無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)，并將確定的無(wú)機(jī)鹽分別設(shè)置為0.3%、0.5%、0.8%、1%、2%、3%、4%、5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，添加①a、①b篩選出的最佳碳氮源，培養(yǎng)條件同①a，確定無(wú)機(jī)鹽濃度添加范圍。以上每個(gè)處理均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。②培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗(yàn)：根據(jù)單因素試驗(yàn)篩選出的培養(yǎng)基最佳碳源組合、氮源和無(wú)機(jī)鹽的種類(lèi)和濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9(33)(表1)配制不同培養(yǎng)基進(jìn)行菌株HR10搖床培養(yǎng)試驗(yàn)，培養(yǎng)條件同①a，每個(gè)處理3次生物學(xué)重復(fù)。

表1 碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化的正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Orthogonal test factors and levels for optimization of carbon source,nitrogen source and salt inorganic salt

1.2.6 培養(yǎng)條件優(yōu)化 選擇正交試驗(yàn)優(yōu)化的培養(yǎng)基，對(duì)溫度、初始pH值、接種量、裝液量、轉(zhuǎn)速5個(gè)因素依次進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵條件。每個(gè)處理均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢生長(zhǎng)曲線的繪制

圖1為在最佳培養(yǎng)基和最佳發(fā)酵條件確定之前進(jìn)行的發(fā)酵試驗(yàn)數(shù)據(jù)，從圖1可以看出，菌株 HR10活菌數(shù)總體都不高，且呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢(shì)，可能因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐步被消耗，活菌數(shù)在發(fā)酵28 h時(shí)，達(dá)到最大值為3.9×109cfu/mL，最高芽孢率出現(xiàn)在76 h，但是，最高芽孢數(shù)量則出現(xiàn)在64 h，為3.9×108cfu/mL，說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)體達(dá)到最大值后隨時(shí)間推移逐步減少，而芽孢則逐漸增多。因此，選取芽孢數(shù)量最大的時(shí)刻即64 h作為后續(xù)試驗(yàn)的芽孢量測(cè)定時(shí)間點(diǎn)。

圖1 不同時(shí)間的活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率Fig.1 The number of bacteria, spores and spore formation rate at different times柱形圖小寫(xiě)字母表示數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異，下圖同Lowercase letters in the column chart indicate significant differences between the data, the same as in the figure below

2.2 培養(yǎng)基單因素篩選結(jié)果

2.2.1 最佳碳源篩選 由圖2可知，在不同的碳源培養(yǎng)基中，添加葡萄糖和糖蜜的培養(yǎng)基所獲得的活菌數(shù)和芽孢數(shù)均顯著高于其他碳源培養(yǎng)基，活菌數(shù)分別達(dá)9.39×109cfu/mL和9.26×109cfu/mL，芽孢數(shù)分別為6.01×109cfu/mL和61.3×109cfu/mL。雖然蔗糖培養(yǎng)基的芽孢率最高，但因?yàn)槠浠罹鷶?shù)和芽孢數(shù)均較少，所以不宜作為目標(biāo)碳源。玉米粉芽孢率低，也不作為目標(biāo)碳源。葡萄糖和糖蜜兩者差異不明顯，且均具有較高的芽孢率。綜合考慮，本研究將葡萄糖和糖蜜按質(zhì)量比1∶1添加，作為組合碳源。

圖2 不同碳源對(duì)菌株HR10活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率的影響Fig.2 The number of living bacterium, spores and spore formation rate of HR10 strains with different carbon source

2.2.2 最佳氮源篩選 由圖3可知，在不同氮源培養(yǎng)基中，添加無(wú)機(jī)氮源的培養(yǎng)基中活菌數(shù)和芽孢數(shù)顯著低于添加有機(jī)氮源的培養(yǎng)基，說(shuō)明菌株HR10不能有效地利用無(wú)機(jī)氮源。添加豆制氮源的培養(yǎng)基明顯好于其他種類(lèi)氮源的培養(yǎng)基，其中添加豆餅粉的培養(yǎng)基中活菌數(shù)和芽孢數(shù)最高，分別為5.06×109cfu/mL和4.05×109cfu/mL，芽孢率可達(dá)70.94%。因此，選擇豆餅粉作為最佳氮源。

圖3 不同氮源對(duì)菌株HR10活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率的影響Fig.3 Different nitrogen source medium HR10 strain number of living bacterium, the rate of spore number and spore

2.2.3 最佳碳源濃度篩選 由圖4可知，在不同濃度糖蜜和葡萄糖培養(yǎng)基中，濃度1%時(shí)的活菌數(shù)和芽孢數(shù)最高，分別達(dá)到9.89×109cfu/mL和7.68×109cfu/mL，但芽孢率則是在濃度為0.8%時(shí)達(dá)到最大，且隨濃度增加呈現(xiàn)逐步遞減的趨勢(shì)。因此，選取組合碳源濃度0.80%、1.00%、2.00%做三個(gè)水平的正交試驗(yàn)。

圖4 不同濃度碳源對(duì)菌株HR10活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率的影響Fig.4 Viable bacterial count, spore count and spore rate of HR10 strains in different carbon source concentrations

2.2.4 最佳氮源濃度篩選 由圖5可知，菌株 HR10的活菌數(shù)和芽孢數(shù)隨著培養(yǎng)基中豆餅粉濃度的增加逐漸增大，當(dāng)豆餅粉濃度3.00%時(shí)最高，分別為1.12×1010cfu/mL和9.48×109cfu/mL，隨后逐漸下降。芽孢率變化不大，均在80%左右。因此，選取2.00%、3.00%、4.00%作為正交試驗(yàn)的三個(gè)水平。

圖5 不同濃度氮源對(duì)菌株HR10活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率的影響

2.2.5 最佳KCl濃度篩選 由圖6可知，芽孢率隨著KCl濃度升高而逐漸升高，當(dāng)濃度為0.3%時(shí)，活菌數(shù)和芽孢數(shù)達(dá)到最大為1.31×1010cfu/mL和1.05×1010cfu/mL，隨后活菌數(shù)和芽孢數(shù)逐步下降，因此，選擇濃度為0.3%的KCl作為一種固定無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行添加。

圖6 不同濃度KCl對(duì)菌株HR10活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率的影響

2.2.6 最佳無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)的篩選 由圖7可知，菌株HR10在聚乙烯醇培養(yǎng)基中的芽孢率僅為37.55%，顯著低于添加其他無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基。在添加了不同種類(lèi)無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中，以MnSO4的培養(yǎng)基所產(chǎn)生的活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率均最大，分別為2.71×1010cfu/mL、2.47×1010cfu/mL和91.50%。在添加了K2HPO4·3H2O 的培養(yǎng)基中，雖然其活菌數(shù)量最大，但因其芽孢率較低，僅為4.01%，故不作為備選無(wú)機(jī)鹽。綜合分析，選擇MnSO4作為 菌株HR10的發(fā)酵培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽。

圖7 不同無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)及聚乙烯醇對(duì)菌株HR10活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率的影響Fig.7 Different types of inorganic salt and polyvinyl alcohol medium HR10 strain number of living bacterium, the spore number and the rate of spore

2.2.7 最佳無(wú)機(jī)鹽濃度的篩選 由圖8可知，當(dāng)MnSO4濃度0.2%～0.5%時(shí)，菌株HR10的芽孢數(shù)差異不顯著，但0.4%時(shí)，活菌數(shù)最大，為1.40×1010cfu/mL，所以選擇MnSO4濃度為0.3%、0.4%、0.5%作為后續(xù)正交試驗(yàn)的三個(gè)水平。

圖8 不同濃度MnSO4對(duì)菌株HR10活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率的影響Fig.8 The viable count, spore count and spore rate of HR10 strain in different MnSO4 concentration media

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基基質(zhì)組成的正交試驗(yàn)結(jié)果

由正交試驗(yàn)結(jié)果(表2)可知，對(duì)菌株HR10芽孢產(chǎn)量影響最大的是葡萄糖和糖蜜等質(zhì)量混合添加的組合碳源，其次是MnSO4，最后為豆餅粉，對(duì)應(yīng)的最佳濃度組合為A2B1C2，即葡萄糖1%，糖蜜1%，豆餅粉2%，無(wú)機(jī)鹽MnSO40.4%，芽孢數(shù)可達(dá)1.78×1010cfu/mL。

表2 碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化的L9(33)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 L9(33)orthogonal test results optimized for carbon source,nitrogen source and inorganic salt

2.4 培養(yǎng)條件單因素優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 最佳培養(yǎng)溫度篩選 由圖9可知，隨著溫度的升高，活菌數(shù)和芽孢數(shù)呈現(xiàn)先減少后增多的趨勢(shì)。溫度為37 ℃時(shí)，活菌數(shù)和芽孢數(shù)均達(dá)到最大，分別為1.48×1010cfu/mL和1.43×1010cfu/mL。因此，選擇37 ℃作為菌株HR10搖瓶培養(yǎng)的最佳發(fā)酵溫度。

圖9 不同溫度對(duì)菌株HR10活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率的影響

2.4.2 最佳pH的篩選 由圖10可知，在不同的pH培養(yǎng)基中，菌株HR10產(chǎn)生的菌數(shù)和芽孢數(shù)明顯有不同，pH 7時(shí)，活菌數(shù)和芽孢數(shù)最高，分別為1.74×1010cfu/mL和1.64×1010cfu/mL，芽孢率達(dá)到94.22%。說(shuō)明菌株HR10在中性的環(huán)境下更適合生長(zhǎng)。因此，選用pH 7作為菌株HR10搖瓶培養(yǎng)的最佳pH。

圖10 不同pH對(duì)菌株HR10活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率的影響Fig.10 Viable bacterial count, spore count and spore rate of HR10 strain in different pH media

2.4.3 發(fā)酵容器最佳裝液量篩選 由圖11可知，發(fā)酵容器不同的相對(duì)裝液量對(duì)菌株HR10的活菌數(shù)有較大的影響，30%裝液量時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大，為3.79×1010cfu/mL,50%裝液量時(shí)，芽孢率和芽孢數(shù)分別達(dá)到89.59%和 1.74×1010cfu/mL，說(shuō)明50%裝液量時(shí)的氧氣濃度更有利于芽孢形成。因此，選擇菌株HR10搖瓶培養(yǎng)的最佳裝液量為50%。

圖11 培養(yǎng)基不同裝液量對(duì)菌株HR10活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率的影響Fig.11 Viable bacterial count, spore count and spore rate of HR10 strains in different media with different liquid volume

2.4.4 最佳接種量篩選 由圖12可知，接種量5%時(shí)，芽孢數(shù)最高，為1.99×1010cfu/mL，但接種量超過(guò)5%時(shí)，芽孢數(shù)顯著下降，活菌數(shù)隨接種量增加而逐漸增高，接種量15%時(shí)，達(dá)到最高為3.59×1010cfu/mL。因?yàn)檠挎邤?shù)是發(fā)酵產(chǎn)品的最重要指標(biāo)，所以確定菌株HR10搖瓶培養(yǎng)的最佳接種量為5%。

圖12 不同接種量對(duì)菌株HR10活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率的影響Fig.12 Viable bacterial count, sporecount and spore rate of HR10 strains in different inoculum media

2.4.5 最佳培養(yǎng)轉(zhuǎn)速篩選 由圖13可知，隨著轉(zhuǎn)速的增加，菌株HR10的活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率均逐漸升高，當(dāng)轉(zhuǎn)速為220 r/min時(shí)，達(dá)到最大，分別為2.47×1010cfu/mL、2.35×1010cfu/mL和94.70%，超過(guò)220 r/min，則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明轉(zhuǎn)速比較高時(shí)，菌體可能發(fā)生細(xì)胞自溶現(xiàn)象。因此，選取220 r/min作為菌株HR10液體發(fā)酵的最佳轉(zhuǎn)速。

圖13 不同轉(zhuǎn)速對(duì)菌株HR10活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率的影響Fig.13 Viable bacterial count, spore number and spore rate of HR10 strain in different speed culture media

2.4.6 最佳發(fā)酵時(shí)間篩選 由圖14可知，發(fā)酵液在培養(yǎng)24 h時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大值，為2.60×1010cfu/mL，隨后出現(xiàn)急劇下降，在40 h時(shí)又開(kāi)始增加，最后在52 h達(dá)到頂峰，之后緩慢下降。芽孢數(shù)隨著時(shí)間推移逐步增加，在52 h時(shí)達(dá)到最大，為2.37×1010cfu/mL，之后開(kāi)始下降，芽孢率在52 h達(dá)到最大，為94.46%，所以選擇最佳培養(yǎng)時(shí)間為52 h。

圖14 最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下不同時(shí)間菌株HR10的活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率Fig.14 The number of viable bacteria, spore number and spore rate of HR10 strain at different time under the optimal medium and culture conditions

3 討 論

本研究表明，短小芽孢桿菌HR10菌株的培養(yǎng)基最佳成分為葡萄糖1%、糖蜜1%、豆餅粉2%、KCl 0.3%、 MnSO40.4%。最佳發(fā)酵條件：溫度37 ℃、pH 7、250 mL三角瓶裝液量50%、接種量5%、轉(zhuǎn)速220 r/min、培養(yǎng)時(shí)間52 h。芽孢因其特殊結(jié)構(gòu)具有極強(qiáng)的抗逆性，在活菌制劑工業(yè)中表現(xiàn)出極高的應(yīng)用價(jià)值[27]。芽孢的形成主要是菌體遇到了惡劣的生存環(huán)境，如營(yíng)養(yǎng)條件、環(huán)境因素等。在培養(yǎng)過(guò)程中合理的碳氮用量可以有效地促進(jìn)芽孢形成，縮短芽孢產(chǎn)生的時(shí)間。劉春紅等[28]對(duì)枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)B201菌株的產(chǎn)孢培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳培養(yǎng)基成分(g/L)：米粉3、糖蜜10、豆粕粉10、魚(yú)粉10、K2HPO42、Na2HPO42、MgSO40.5、MnSO40.5，大幅縮短了產(chǎn)孢培養(yǎng)時(shí)間，從而節(jié)省了能源，降低了成本。所以對(duì)有益微生物快速產(chǎn)孢培養(yǎng)基的研究以及微生物制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用都顯得至關(guān)重要。

本研究通過(guò)對(duì)短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)HR10菌株的最佳產(chǎn)孢和發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行研究表明，葡萄糖和糖蜜組合碳源可以有效提高菌株HR10的產(chǎn)孢率，葡萄糖作為速效碳源可以使菌體快速生長(zhǎng)，縮短發(fā)酵時(shí)間，糖蜜可以使菌體維持較高的芽孢率并且作為工業(yè)副產(chǎn)品價(jià)格低廉，適合作為培養(yǎng)基成分。不同氮源的篩選結(jié)果表明，無(wú)機(jī)氮源不利于HR10菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)孢，這與王繼雯等[29]的研究結(jié)果相同。相對(duì)于生豆粉和豆粕粉而言，豆餅粉對(duì)菌體產(chǎn)孢促進(jìn)效果最好，可能與發(fā)酵過(guò)程中生豆粉產(chǎn)生大量氣泡從而使環(huán)境改變有關(guān)，而在豆粕粉作為氮源的培養(yǎng)基中，菌株HR10的活菌數(shù)和芽孢數(shù)低很可能是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量低所致。研究表明在培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)臒o(wú)機(jī)鹽離子可以有效促進(jìn)芽孢形成[30]，如Mn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+和一些磷酸鹽類(lèi)等，這主要與芽孢中含有的特殊成分吡啶二羧酸有關(guān)，其可以整合不同的二價(jià)陽(yáng)離子形成螯合物使芽孢核心高度礦化脫水，使其具有抵抗高溫的能力[31]。本研究表明，Mn2+對(duì)菌株HR10產(chǎn)芽孢具有非常顯著的促進(jìn)作用，Mn2+是多種酶的輔助因子[24]，Mn2+可以增加芽孢的產(chǎn)率，使其更加穩(wěn)定，進(jìn)一步改善芽孢的皮層結(jié)構(gòu)，增加耐熱性，在制備微生態(tài)制劑過(guò)程中可以有效提高產(chǎn)品的質(zhì)量，延長(zhǎng)保存時(shí)間。同時(shí)，因本實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用的碳氮源多是工業(yè)副產(chǎn)品，使用成本得以大幅降低，有利于菌株HR10的工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)酵條件也對(duì)細(xì)菌芽孢的產(chǎn)生具有一定的影響[32-33]，本研究在進(jìn)行溫度單因素試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，25 ℃相對(duì)于28 ℃和32 ℃，可使菌株HR10具有更高的活菌數(shù)和芽孢數(shù)，這可能是因?yàn)锽.pumilusHR10是一種植物根際促生細(xì)菌，相對(duì)的低溫更加有利于其生長(zhǎng)。35～37 ℃時(shí)又增高，37 ℃達(dá)到最大，說(shuō)明溫度對(duì)芽孢數(shù)和活菌數(shù)有一定的影響。初始pH在細(xì)菌培養(yǎng)的初始階段則顯得更加重要，合適的pH值可以使菌體在指數(shù)期更加快速的生長(zhǎng)，活菌數(shù)量的峰值更高，如杜冰等[34]研究發(fā)酵培養(yǎng)芽孢乳酸桿菌(Lactobacillussporogenes)D-1表明，pH 7比pH 2時(shí)最終活菌數(shù)高出了6個(gè)數(shù)量級(jí)。過(guò)高的轉(zhuǎn)速使自溶酶(autolysin)釋放，溶解細(xì)菌胞壁質(zhì)，造成細(xì)胞內(nèi)容物釋放，發(fā)生細(xì)胞的自溶現(xiàn)象，pH、溫度也對(duì)細(xì)胞自溶有一定的影響[27]。

固體菌劑常用的干燥方法有噴霧干燥、流化床干燥、真空干燥、真空冷凍干燥、噴霧冷凍干燥法等。由于冷凍干燥的高成本和能量消耗，使噴霧干燥制備固體菌劑的研究更為廣泛[35]。由于培養(yǎng)物在干燥期間存活率低，貯存期間穩(wěn)定性低等缺點(diǎn)[36-38]，而芽孢因其極強(qiáng)的抗逆性，因此，提高培養(yǎng)物芽孢數(shù)量和芽孢率在固體菌劑的制備和儲(chǔ)存過(guò)程中有極其重要的作用，對(duì)生防菌大面積推廣具有深遠(yuǎn)意義。