紅色諾卡菌固體培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

王 琳， 章朦玥， 薛金艷， 南 寧， 王 丹， 張怡軒*

(1.沈陽藥科大學 生命科學與生物制藥學院，遼寧 沈陽 110016；2.遼寧格瑞仕特生物制藥有限公司，遼寧 本溪 117004)

宮頸癌是全球女性中第四大最常見的癌癥[1]，也是全球女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因[2]。全世界每年被診斷患有宮頸癌的婦女約有50萬人，死亡率為9%，且在發(fā)展中國家宮頸癌的發(fā)病率和死亡率仍居高不下[3]。我國每年新增宮頸鱗狀細胞癌13萬例，占全球新診斷病例的28%[4]。哈拉爾德·楚爾·豪森1972年提出人乳頭瘤病毒(HPV)導致宮頸癌，由此獲得2008年醫(yī)學諾貝爾獎[5]。臨床研究表明，宮頸炎、宮頸癌前病變以及宮頸癌患者發(fā)病多與HPV的感染有關(guān)[6]，機體對HPV感染以局部免疫應答為主，其持續(xù)感染與免疫應答異常密切相關(guān)[7]，在免疫應答過程中，以γ-干擾素(IFN-γ)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-21(IL-21)為代表的細胞因子在細胞免疫、體液免疫和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[8]。外用紅色諾卡氏菌細胞壁骨架(Nocardiarubracell wall skeleton, Nr-CWS，國藥準字S20030009)由紅色諾卡菌經(jīng)過固體擴增發(fā)酵收集、細胞破碎、精細提純、滅菌后獲得，再加入輔料凍干等一系列步驟制得成品。主要成分為胞壁酸、阿拉伯半乳聚糖、粘肽(肽聚糖PGN)，可以有效清除HPV亞型感染，逆轉(zhuǎn)低度宮頸細胞學異常[9], 并增加轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)的表達，促進血管生成，促進皮膚創(chuàng)面愈合[10]，具有免疫活性強、副作用小的特點[11]。已有研究表明，當HPV持續(xù)感染時，巨噬細胞(M?)及朗格漢斯細胞(LC)活性低，當外用紅色諾卡氏菌細胞壁骨架介入后，通過模式識別，與M?和LC的相應的表面表達結(jié)合，促進M?和LC的活化增殖。同時在非特異性免疫及特異性免疫的作用下清除HPV感染[12]。培養(yǎng)基優(yōu)化的常用方法有單因素和正交試驗設計，單因素試驗設計只考慮某一因素的影響，正交試驗設計只能得到最佳因素水平的組合，都沒有研究因子之間的相互作用[13]；響應面優(yōu)化設計法是基于正交試驗的缺陷而產(chǎn)生[14]，是一種處理復雜關(guān)系和優(yōu)化多種因素的實用統(tǒng)計方法[15]，它能擬合因素與響應間的全局函數(shù)關(guān)系，有助于快速建模，對函數(shù)的響應面和等高線進行分析，縮短優(yōu)化時間和提高應用可信度[16-17]，與傳統(tǒng)優(yōu)化方法比較，響應面優(yōu)化設計法更有利[18]。本研究擬采用Plackett-Burman法，從原培養(yǎng)基組分中找出對影響紅色諾卡菌細胞生物量的主要因素[19]，再通過中心組合設計實驗(CCD)，擬合建立描述響應量與自變量關(guān)系的多項式回歸模型，找到最優(yōu)配方組合，以優(yōu)化培養(yǎng)基配方，增加紅色諾卡菌的細胞生物量，提高產(chǎn)能，并將其應用于工廠中進行驗證評估。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 紅色諾卡菌(Nocardiarubra) Nr-8206，由遼寧格瑞仕特生物制藥有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①甘油瓊脂培養(yǎng)基(原固體發(fā)酵培養(yǎng)基)：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，甘油10 mL，NaCl 5 g，Na2HPO4·12H2O 0.3 g，瓊脂20 g，pH 7.2～7.5，蒸餾水1 000 mL，用于菌株活化和培養(yǎng)；②肉湯培養(yǎng)基：甘油瓊脂培養(yǎng)基(原固體發(fā)酵培養(yǎng)基)不加瓊脂，用于種子培養(yǎng)。以上培養(yǎng)基均121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 試劑與儀器 牛肉膏、蛋白胨(北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司)；甘油、NaCl、Na2HPO4·12H2O、瓊脂(國藥集團化學試劑有限公司)。電子天平(上海?？惦娮觾x器廠)； LDZX-40SBI型自動電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；標準型PB-10全自動pH計(德國賽多利斯集團)；SW-CJ-ZD型雙人單面超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；DGG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海森新試驗儀器有限公司)；恒溫振蕩器(北京凱慕生物技術(shù)有限公司)；TGL-16B臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 紅色諾卡菌菌種活化 將菌種進行兩代活化。將菌體均勻涂布在甘油瓊脂培養(yǎng)基的試管斜面培養(yǎng)基表面，33 ℃培養(yǎng)4 d后用1 mL無菌水沖洗斜面上的菌體，吸出菌懸液轉(zhuǎn)接至裝有甘油瓊脂培養(yǎng)基的克氏瓶培養(yǎng)基內(nèi)，再用2 mL無菌水沖洗斜面上的殘菌并轉(zhuǎn)接至克氏瓶培養(yǎng)基內(nèi)，L形棒涂布菌懸液于克氏瓶培養(yǎng)基表面，33 ℃培養(yǎng)4 d。

1.2.2 紅色諾卡菌的種子液制備 克氏瓶培養(yǎng)結(jié)束后，用15 mL無菌水沖洗培養(yǎng)基表面的菌體，將菌體接種于肉湯培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，33 ℃、150 r/min培養(yǎng)4 d，培養(yǎng)結(jié)束后離心棄去培養(yǎng)基，加無菌水800 mL分散菌體，種子液制備完成，再將種子液輕輕晃動使菌體均勻分散，每個克氏瓶接種5 mL。

1.2.3 Plackett-Burman(PB)實驗 選取基礎培養(yǎng)基組分甘油、牛肉膏、蛋白胨、Na2HPO4·12H2O、NaCl 5個因素進行考察，每個因素取上限(+1)、下限(-1)兩個水平(表1)，以Nr-8206的細胞生物量為響應值，得到5因素12組實驗組合(表2)，33 ℃培養(yǎng)5 d后，將克氏瓶內(nèi)培養(yǎng)基上的菌苔用無菌水洗下，分別離心棄去上清液，稱量菌體重量，得出最終細胞生物量。通過分析實驗結(jié)果找出影響細胞生物量的影響因素。

表1 Plackett-Burman試驗變量的取值范圍

表2 Plackett-Burman實驗設計及結(jié)果

1.2.4 最陡爬坡實驗 將通過Plackett-Burman獲得的重要因素，以實驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據(jù)因素的效應值大小確定變化步長，逼近最大響應區(qū)域。

1.2.5 CCD試驗設計和響應曲面分析 以菌株Nr-8206的細胞生物量為主要目標，根據(jù)最陡爬坡實驗結(jié)果，進行CCD實驗，設計3個因素及5個水平，分別以(-1.682、-1、0、1、1.682)編碼，如表3所示，擬合建立描述響應量與自變量關(guān)系的多項式回歸模型，找出重要因素的最佳配方水平。

表3 CCD試驗設計因素及水平

1.2.6 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果驗證 將優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方應用于工廠的生產(chǎn)發(fā)酵，進行生產(chǎn)放大實驗驗證。生產(chǎn)步驟和其后各工藝步驟不變，用以比較細胞生物量。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman實驗結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman(PB)實驗組合的結(jié)果，方差分析見表4，多元回歸方程：

細胞生物量(g/L)=10.36-0.107 5A+0.299 2B+1.03C-0.069 2D-0.519 2E

表4 Plackett-Burman實驗設計方差分析

方程中A、B、C、D、E為編碼值。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.867 7，說明回歸有效， F=7.87，說明模型顯著。模型中因素的P值越小說明影響越顯著，即培養(yǎng)基配方對菌株細胞生物量影響大小排序為蛋白胨(P=0.001 7)>NaCl(P=0.034 4)>牛肉膏(P=0.167 3)>甘油(P=0.592 9)>Na2HPO4·12H2O(P=0.728 9)。后續(xù)實驗選擇蛋白胨、NaCl、牛肉膏作為顯著性影響因素。

方差分析模型的P=0.013 0，證明回歸方程是顯著的，即模型回歸區(qū)域擬合較好，模型相關(guān)系數(shù)R2=0.867 7，說明相關(guān)性較好。調(diào)整后R2=0.757 5，說明75.75%實驗數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來解釋。通常變異系數(shù)(C.V.)越低，則實驗的可信度和精確度越高，該PB實驗的變化系數(shù)值=6.37%，說明可信度和精確度較好。

2.2 CCD設計及實驗結(jié)果

2.2.1 最陡爬坡實驗結(jié)果 將PB實驗得到的重要因素(蛋白胨、牛肉膏、NaCl)的濃度進行最陡爬坡實驗。設蛋白胨變化步長為△X1=4，NaCl變化步長為△X2=0.8，牛肉膏變化步長為△X3=1，依據(jù)T值(表4)蛋白胨和牛肉膏為正效應，濃度依次增加；NaCl為負效應，濃度依次減少逼近最大響應區(qū)域，實驗設計及結(jié)果見表5。菌株Nr-8206的細胞生物量在第5組(蛋白胨、NaCl、牛肉膏的質(zhì)量濃度分別為24、0.8、8 g/L)水平附近最高，以該組配方值為CCD實驗起始值進行后續(xù)優(yōu)化。

表5 最陡爬坡試驗設計及試驗結(jié)果

2.2.2 CCD實驗 根據(jù)Design-Expert軟件計算設計20組配方組成，實驗組及結(jié)果見表6，其中第1、4、6、11、14、18組為重復，依據(jù)實驗結(jié)果擬合建立響應量與自變量的多項式回歸模型，應用Design-Expert軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到的回歸方程：

菌株Nr-8206細胞生物量(g/L)=14.110+0.439C+0.416B-0.513E-0.525CB+0.269CE-0.150BE-0.322C2+0.081B2+0.421E2+0.006CBE-0.085C2B+0.575C2E+0.549CB2

表6 CCD響應面試驗及結(jié)果

方差分析中(表7)，模型的P=0.022 0，說明該模型顯著。失擬項的P=0.657 2，模型失擬不顯著，所以模型正確，且多元相關(guān)系數(shù)R2=0.924 1，說明模型擬合較好。變異系數(shù)(C.V.)為3.66%，說明模型方程可信度、精確度較好。

表7 CCD實驗設計方差分析表

經(jīng)Design-Expert軟件分析，依據(jù)回歸方程繪制相應的響應面分析圖見圖1～3，因素NaCl、牛肉膏、蛋白胨和牛肉膏立體分析圖走勢較陡，表明NaCl和牛肉膏交互作用、蛋白胨和牛肉膏交互作用對菌株Nr-8206細胞生物量影響顯著。

圖1 蛋白胨和NaCl對細胞生物量影響的立體分析圖Fig.1 Response surface plot of the effects of peptone and sodium chloride on cells biomass

圖2 蛋白胨和牛肉膏對細胞生物量影響的立體分析圖Fig.2 Response surface plot of the effects of peptone and beef extract on cells biomass

圖3 牛肉膏和氯化鈉對細胞生物量影響的立體分析圖Fig.3 Response surface plot of the effects of beef extract and sodium chloride on cells biomass

理論極值編碼水平(1，-1，1)的響應值為15.941 g/L，通過實驗驗證(見表6，CCD設計實驗編號第20組),理論極值編碼水平的實際細胞生物量為16.0 g/L，不是此次設計組中最高細胞生物量組(見表6，第12組細胞生物量為16.075 g/L)，故結(jié)合預測配方和實驗結(jié)果進行優(yōu)化，編碼水平中E(NaCl)的編碼定為-1=0.8 g/L，即最陡爬坡試驗的最佳組合(見表4，第5組)的NaCl取值，得出新配方(1，-1，0)帶入擬合方程：

預測最高值點(Z1,Z2,Z3)=(1.000，-1.000, 1.000)

優(yōu)化后配方：蛋白胨42 g/L，牛肉膏8 g/L，NaCL 1.2 g/L，Na2HPO4·12H2O 0.3 g/L，甘油 10 mL/L，pH 7.2～7.5。再次進行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)此次優(yōu)化配方的細胞生物量比原始配方的生物量高231%。

2.2.3 最佳培養(yǎng)基配方的驗證 為了確定實驗結(jié)果的可靠性，按最佳優(yōu)化配方進行企業(yè)驗證。實驗證明，原發(fā)酵培養(yǎng)基配方獲得的細胞生物量平均為141.21 g/批次；優(yōu)化后的配方獲得的細胞生物量平均為287.8 g/批次提高了104%。

3 討 論

對紅色諾卡菌培養(yǎng)基配方進行了優(yōu)化試驗，在原培養(yǎng)基組分中，影響細胞生物量的主要因素為蛋白胨、NaCl，其次為牛肉膏,甘油和Na2HPO4·12H2O影響微弱。通過響應面優(yōu)化設計法獲得的最佳固體培養(yǎng)基配方為蛋白胨42 g/L、牛肉膏8 g/L、NaCl 1.2 g/L、甘油10 mL/L、Na2HPO4·12H2O 0.3 g/L、瓊脂20 g/L；經(jīng)過CCD實驗，優(yōu)化配方的細胞生物量為16.075 g/L，原始配方的細胞生物量為4.85 g/L，優(yōu)化配方的細胞生物量比原始配方的細胞生物量高231%。在工廠驗證中，采用優(yōu)化配方培養(yǎng)菌株Nr-8206的平均細胞生物量達287.8 g/批次，比原配方的平均細胞生物量(141.21 g/批次)高104%。企業(yè)生產(chǎn)的外用紅色諾卡氏菌細胞壁骨架為HPV感染的真正的對癥治療藥品，其固體發(fā)酵周期長、工作量大。優(yōu)化后的配方使紅色諾卡菌固體發(fā)酵的細胞生物量提高了104%，解決了目前固體發(fā)酵產(chǎn)能低的短板，提高企業(yè)的經(jīng)濟效益和減少員工的工作強度作用明顯。經(jīng)過固體培養(yǎng)基配方的優(yōu)化實驗，證明響應面優(yōu)化設計應用在提高紅色諾卡菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化方面是可行的，為紅色諾卡菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化、液體發(fā)酵的優(yōu)化研究提供依據(jù)。