常規(guī)培養(yǎng)與缺氧條件下BCG菌體內(nèi)外sRNA的表達(dá)檢測

韓 雪， 顧 偉， 李 婷， 范云帆， 張文莉， 趙吉子， 付英梅

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)教研室，黑龍江 哈爾濱 150081)

細(xì)菌中長度在50～500 nt的非編碼RNA通常被定義為小RNA(small RNA，sRNA)[1]。細(xì)菌的sRNA的表達(dá)水平受環(huán)境因素誘導(dǎo)而改變，繼而通過對靶基因的調(diào)節(jié)，幫助細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境因素的變化[2-3]。細(xì)菌的sRNA也可通過細(xì)胞外囊泡等方式被分泌到菌體外，在宿主體內(nèi)以細(xì)胞間信號的跨物種傳遞方式，發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控的功能，參與感染與免疫進(jìn)程。例如，細(xì)菌胞外sRNA可激活宿主細(xì)胞的模式識別受體途徑，誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)[4-5]；或模擬宿主的miRNA調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，影響細(xì)胞因子和干擾素水平、誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡[6-7]。高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌的sRNA也可分布到宿主的各種體液和組織器官中[8-9]。因此，細(xì)菌的胞外sRNA，可作為感染性疾病的診斷標(biāo)志物或治療監(jiān)測標(biāo)志物，也可將其作為新型核酸疫苗加以研制。在NCBI數(shù)據(jù)庫的結(jié)核分枝桿菌參考基因組中，注釋了20種sRNA，研究發(fā)現(xiàn)這些sRNA的調(diào)控作用包括影響細(xì)菌的生長與轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)的分泌，在感染時(shí)發(fā)揮一定的作用[2,10-11]。但對結(jié)核分枝桿菌菌體內(nèi)外sRNA譜的情況還不清楚。為了研究結(jié)核分枝桿菌菌體內(nèi)外sRNA的表達(dá)情況，本研究以BCG菌株為研究對象，測定細(xì)菌不同生長時(shí)期菌體內(nèi)外的sRNA譜，并以缺氧為誘導(dǎo)條件，研究BCG菌體外sRNA的變化規(guī)律，為篩選有利于結(jié)核病診斷的sRNA候選標(biāo)志物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株MycobacteriumbovisBacillus Calmette-Guerin Vaccine(BCG,卡介苗) Danish，由哈爾濱市南崗區(qū)結(jié)核病防治所惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基 BCG培養(yǎng)采用含白蛋白-葡萄糖-過氧化物酶(ADC)的Middlebrook 7H9培養(yǎng)基[12]，購自美國BD公司。

1.1.3 試劑與儀器 RNA提取使用TRIzol試劑(美國Thermo Fisher Scientific公司)；cDNA合成試劑盒和RT-qPCR檢測試劑盒(加拿大abm公司)；NanoDrop 2000(美國Thermo Fisher Scientific公司)；熒光定量PCR儀(德國Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組測序分析 離心收集在Middlebrook 7H9中培養(yǎng)至對數(shù)生長期的BCG菌體和上清液，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，140 000 g離心獲得BCG外泌體樣本。分別使用Trizol和Trizol LS試劑提取BCG菌體和外泌體的總RNA，使用2 μg總RNA，去除rRNA后構(gòu)建cDNA文庫，末端修復(fù)加A并連接測序接頭，經(jīng)片段篩選、PCR富集、文庫質(zhì)檢與定量后，經(jīng)Illumina高通量測序平臺(tái)測序。測序得到的原始序列經(jīng)TrimGalore過濾得到Clean reads，使用H37Rv參考基因組(NC_000962.3)進(jìn)行sRNA表達(dá)水平的分析。

1.2.2 BCG培養(yǎng) 采用含10% ADC的Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃，170 r/min進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。ADC配制方法：高壓滅菌后的蒸餾水100 mL，加入BSA胎牛血清白蛋白粉末5 g，葡萄糖2 g，氯化鈉0.85 g，過氧化物酶0.003 g充分溶解，0.22 μm 濾膜過濾除菌。根據(jù)Wayne描述的方法[13]，將培養(yǎng)至對數(shù)期的BCG用新配制的7H9培養(yǎng)基以1∶30的比例稀釋后充滿培養(yǎng)管，旋緊蓋子并用封口膜密封管口，將培養(yǎng)管置于無氧密封袋中，37 ℃，170 r/min進(jìn)行缺氧培養(yǎng)。分別取常規(guī)培養(yǎng)和缺氧培養(yǎng)至0、4、8、10 d的菌體和上清液進(jìn)行檢測。

1.2.3 RNA提取 將1 mL對數(shù)期菌液離心，將上清液移入新的離心管中，5 000 r/min離心10 min，用0.22 μm濾膜過濾后，制備好BCG無菌培養(yǎng)上清液。向剩余菌體中加入500 μL溶菌酶(20 mg/mL)，以超聲5 s、停頓 3 s、超聲30個(gè)循環(huán)的程序超聲裂解兩次。使用TRIzol法提取總RNA，NanoDrop 2000測定RNA的濃度和純度。

1.2.4 cDNA的合成 使用1 μg的RNA合成cDNA，采用5x All-In-One RT MasterMix(with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)試劑盒，按試劑盒的操作說明應(yīng)用隨機(jī)引物合成cDNA。

1.2.5 RT-qPCR檢測 使用EvaGreen 2×qPCR MasterMix熒光染料試劑盒進(jìn)行RT-qPCR檢測，引物詳見表1。采用sigA為內(nèi)參基因，以2-Δct法表示sRNA的相對表達(dá)量。

表1 RT-qPCR引物

1.2.6 sRNA啟動(dòng)子區(qū)域DosR結(jié)合基序的分析 DosR結(jié)合位點(diǎn)是其調(diào)控基因上游啟動(dòng)子區(qū)域一段保守的18 bp的簡并回文序列[14]。使用Clustal 1.2.4在線分析軟件搜索sRNA上游啟動(dòng)子區(qū)域中符合這一特征的序列，并分析序列的回文特征，篩選sRNA啟動(dòng)子區(qū)域中可能存在的DosR結(jié)合基序。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用t檢驗(yàn)方法分析BCG菌體和上清中sRNA的表達(dá)量，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)中所用sRNA的篩選

將BCG菌體和BCG外泌體樣本全轉(zhuǎn)錄組測序所得的raw reads過濾后，在BCG菌體中得到18 725 670 Clean reads，在BCG外泌體中得到70 853 63 Clean reads。根據(jù)結(jié)核分枝桿菌的參考基因組(NC_000962.3)中所注釋的sRNA，分析各個(gè)sRNA在菌體和外泌體中的豐度情況，結(jié)果見圖1。為了進(jìn)一步確認(rèn)BCG菌體內(nèi)外的sRNA譜，選擇在BCG外泌體測序中檢測到的5種sRNA，即 MTS2823、G2、Mcr7、AS1890和ASdes(圖1B)，同時(shí)選擇BCG菌體中豐度較高的兩種sRNA(Mcr3和C8)，及豐度較低的兩種sRNA(MTS1338和MTS0997)(圖1A)，共9種結(jié)核分枝桿菌的sRNA進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 RNA測序顯示的20種sRNA在BCG及其外泌體中的豐度Fig.1 The abundance of sRNA in BCG and BCG extracellular vesicles revealed by RNA sequencing

2.2 隨時(shí)間變化的常規(guī)培養(yǎng)下sRNA表達(dá)譜

通過RT-qPCR法檢測不同培養(yǎng)時(shí)期的BCG菌體內(nèi)外sRNA的相對表達(dá)量，整個(gè)培養(yǎng)過程中，所選擇的9種sRNA在BCG菌體內(nèi)和菌體外都可檢測到，但菌體內(nèi)外的sRNA表達(dá)譜存在明顯差異(圖2)。對數(shù)期之前(0～20 d)，MTS2823為BCG菌體內(nèi)豐度最高的sRNA，其次為MTS1338；從第20天對數(shù)期開始，ASdes的豐度逐漸升高，同時(shí)MTS2823與MTS1338仍保持較高含量；其他6種sRNA在菌體內(nèi)一直呈較低的相對表達(dá)量。在BCG菌體外，對數(shù)期之前豐度最高的sRNA為Mcr3，其次為MTS2823；自第20天對數(shù)期開始，AS1890的豐度有所增加，而Mcr3在培養(yǎng)至30 d后，豐度幾乎下降為0(圖2)。

圖2 常規(guī)培養(yǎng)時(shí)sRNA 的表達(dá)譜Fig.2 The sRNA expression profile of in routine culture

2.3 常規(guī)培養(yǎng)時(shí)BCG菌體內(nèi)外sRNA表達(dá)量的比較

對數(shù)生長早期，細(xì)菌生長旺盛，因此無菌培養(yǎng)上清中的sRNA多由菌體釋放或分泌，而非細(xì)菌死亡裂解所產(chǎn)生。測定對數(shù)生長早期(20 d)BCG菌體內(nèi)外sRNA的相對表達(dá)量，將sRNA菌體外與sRNA菌體內(nèi)做比值，以比較某一sRNA在菌體內(nèi)外的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，常規(guī)培養(yǎng)時(shí)，MTS0997、G2、Mcr7、Mcr3和AS1890的比值大于1，說明這些sRNA在BCG菌體外的相對表達(dá)量高于菌體內(nèi)(圖3)。提示這些sRNA可能由細(xì)菌主動(dòng)分泌至菌體外。

圖3 常規(guī)培養(yǎng)時(shí)BCG菌體外與菌體內(nèi)sRNA相對表達(dá)量的比值Fig.3 The ratio of extracellular to intracellular sRNA expression in conventional culture of BCG

2.4 缺氧應(yīng)激對菌體內(nèi)外sRNA表達(dá)的影響

已有研究發(fā)現(xiàn)，缺氧環(huán)境誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌DosR基因表達(dá)上調(diào)。本研究中BCG在缺氧培養(yǎng)至4 d時(shí)，DosR的相對表達(dá)量由0.187升高到0.967，升高了5倍(P<0.001)，表明此時(shí)缺氧環(huán)境已經(jīng)形成。此時(shí)，在BCG菌體中受缺氧誘導(dǎo)，表達(dá)量比常規(guī)培養(yǎng)時(shí)增多的sRNA有4種，即MTS2823、MTS1338、MTS0997和G2(圖4A)；而在BCG的無菌培養(yǎng)上清中，僅MTS0997表達(dá)量多于常規(guī)培養(yǎng)，增高了2.3倍(P<0.05)(圖4B)。至缺氧8 d時(shí)，菌體內(nèi)表達(dá)量高于常規(guī)培養(yǎng)時(shí)的sRNA，且只剩下G2 一種(圖4C)；但菌體外表達(dá)較常規(guī)培養(yǎng)時(shí)增高的sRNA種類增多，除MTS0997外，G2、C8、MTS1338和MTS2823的含量也增加(圖4D)。

圖4 受缺氧誘導(dǎo)的BCG菌體內(nèi)外sRNA的相對表達(dá)量Fig.4 The relative expression of sRNA in the bacteria and supernatant of BCG induced by hypoxia *P<0.05 ，**P< 0.01 ，***P< 0.001

2.5 缺氧培養(yǎng)時(shí)BCG菌體內(nèi)外sRNA表達(dá)量的比較

比較同一種sRNA在缺氧條件下菌體內(nèi)外的含量差異，將sRNA菌體外與sRNA菌體內(nèi)做比值。結(jié)果顯示，缺氧4 d時(shí)，AS1890的比值大于1，此時(shí)在菌體外的相對表達(dá)量較高；而G2的比值接近1，表明其在菌體內(nèi)外的相對表達(dá)量相近；其他7種sRNA，即MTS2823、MTS1338、MTS0997、C8、Mcr7、Mcr3和ASdes的比值小于1，說明此時(shí)這些sRNA在BCG菌體內(nèi)的相對表達(dá)量高于菌體外。至缺氧8 d時(shí)，除AS1890外，MTS0997、G2、C8和Mcr7的比值均大于1；而MTS2823、MTS1338、Mcr3和ASdes的比值均小于1(圖5)。由此可見，缺氧環(huán)境下AS1890在菌體外的相對表達(dá)量一直高于菌體內(nèi)，而MTS0997、G2、C8、Mcr7在缺氧后期菌體外的相對表達(dá)量較高。

圖5 缺氧培養(yǎng)時(shí)BCG菌體外與菌體內(nèi)sRNA相對表達(dá)量的比值Fig.5 The ratio of extracellular to intracellular sRNA expression in hypoxia culture

2.6 缺氧誘導(dǎo)的sRNA啟動(dòng)子區(qū)DosR結(jié)合基序的分析

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的DosR結(jié)合基序的簡并回文序列[14]，分析受缺氧誘導(dǎo)表達(dá)升高的sRNA 基因上游啟動(dòng)子區(qū)的序列特征，發(fā)現(xiàn)MTS1338和G2基因的上游具有符合這一序列特征的基序(圖6)，提示這些sRNA的轉(zhuǎn)錄可能直接受DosR的調(diào)節(jié)。

圖6 MTS1338和G2啟動(dòng)子區(qū)與DosR的結(jié)合位點(diǎn)Fig.6 Analysis of binding motif with DosR in MTS1338 and G2 Promoter region橫線區(qū)域?yàn)镸TS1338和G2與DosR的結(jié)合區(qū)域，這兩段結(jié)合區(qū)域均為簡并回文序列。以MTS1338和G2的起始位點(diǎn)為1標(biāo)記基序位置The horizontal area is the combination area of MTS1338 and G2 and DosR, and these two binding regions are degenerate palindromes. The motif position is marked with the starting site of MTS1338 and G2 as 1

3 討 論

細(xì)菌的sRNA可經(jīng)細(xì)胞外囊泡或細(xì)菌裂解的途徑被分泌到菌體外，作為細(xì)胞間信號分子，參與細(xì)菌感染與免疫反應(yīng)的進(jìn)程[4-7,15]。同時(shí)，細(xì)菌的sRNA可分布于宿主的多種體液中[8-9]，之前從結(jié)核患者的血漿中檢測到結(jié)核分枝桿菌的sRNA，其檢出率在患者和對照組間存在差異[16]。為篩選更多用于結(jié)核分枝桿菌感染的候選標(biāo)志物，并進(jìn)一步認(rèn)識其在致病中的作用，本研究檢測并分析了BCG菌體內(nèi)外的sRNA譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，常規(guī)培養(yǎng)時(shí)，BCG菌體內(nèi)外能夠檢測到全部9種sRNA的片段，但在細(xì)菌的整個(gè)生長周期中，這些sRNA在兩種組分中的表達(dá)譜不同且呈動(dòng)態(tài)變化。細(xì)菌生長的前20 d，菌體內(nèi)豐度最高的為MTS2823，其次為MTS1338。在菌體外豐度最高的為Mcr3，其次為MTS2823。而20 d之后，菌體外sRNA變化較大，Mcr3的豐度下降明顯，MTS2823的豐度有所下降，但不明顯，而AS1890的豐度升高。

為適應(yīng)環(huán)境變化，細(xì)菌的sRNA受應(yīng)激因素的刺激而發(fā)生差異表達(dá)。RNA測序研究發(fā)現(xiàn)，在鐵饑餓、氧化應(yīng)激、膜應(yīng)激、酸性pH和營養(yǎng)饑餓條件下，結(jié)核分枝桿菌菌體內(nèi)有82種sRNA在至少一種應(yīng)激條件下具有多于6倍的差異表達(dá)[17]。為進(jìn)一步探究結(jié)核分枝桿菌菌體內(nèi)外sRNA的含量變化規(guī)律，建立了BCG菌株的缺氧應(yīng)激模型，缺氧4 d時(shí)，在BCG菌體內(nèi)，受缺氧誘導(dǎo)表達(dá)量比常規(guī)培養(yǎng)時(shí)增多的sRNA有4種，即MTS2823、MTS1338、MTS0997和G2，至缺氧8 d時(shí)，表達(dá)量高于常規(guī)培養(yǎng)時(shí)的sRNA只剩下G2一種。

DosR(dormancy survival regulator)是結(jié)核分枝桿菌的一種反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，由Rv3133c基因編碼，在細(xì)菌缺氧時(shí)表達(dá)增高，DosR可以誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入休眠狀態(tài)，在結(jié)核分枝桿菌潛伏感染時(shí)起重要作用[18-19]。對受缺氧誘導(dǎo)表達(dá)增加的sRNA，進(jìn)一步分析上游啟動(dòng)子區(qū)域的序列，發(fā)現(xiàn)MTS1338和G2中存在DosR的結(jié)合基序，其轉(zhuǎn)錄可能直接受DosR調(diào)節(jié)。在DosR敲除菌株中，菌體內(nèi)MTS1338的表達(dá)會(huì)顯著降低[2]。MTS1338受缺氧調(diào)控表達(dá)增加，且MTS1338的啟動(dòng)子區(qū)域存在與DosR的結(jié)合序列，進(jìn)一步說明MTS1338的表達(dá)受DosR的調(diào)控。G2也受缺氧應(yīng)激誘導(dǎo)，且也存在DosR的結(jié)合序列，提示G2可能與MTS1338一樣，在缺氧時(shí)也直接受到DosR的調(diào)節(jié)。

對于菌體內(nèi)外sRNA的相對表達(dá)量比較，常規(guī)培養(yǎng)時(shí)，MTS0997、G2、Mcr7、Mcr3和AS1890在菌體外的相對表達(dá)量高于菌體內(nèi)。缺氧培養(yǎng)時(shí)，MTS0997、G2、C8、Mcr7和AS1890在菌體外的相對表達(dá)量高于菌體內(nèi)。說明MTS0997、G2、Mcr7和AS1890在菌體外的含量一直較高，不受缺氧影響；Mcr3只在常規(guī)培養(yǎng)的菌體外含量較高；C8只有在缺氧時(shí)，菌體外水平才增高，表明其受缺氧影響向菌體外釋放。

本研究發(fā)現(xiàn)BCG菌體內(nèi)外sRNA的表達(dá)譜不同，且一部分sRNA在常規(guī)培養(yǎng)和缺氧應(yīng)激時(shí)向菌體外釋放，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌受缺氧誘導(dǎo)的sRNA種類。在菌體外高表達(dá)的sRNA，具有作為感染候選標(biāo)志物的潛能，值得進(jìn)一步研究其在結(jié)核病中的診斷意義。后續(xù)研究將設(shè)計(jì)相應(yīng)sRNA的標(biāo)記探針，應(yīng)用Northern Blot實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)并鑒定胞外sRNA的種類和長度。同時(shí)，采用SecA、EsX等分泌系統(tǒng)缺失突變株，探究這些菌體外sRNA分泌的機(jī)制。