納米木聚糖處理對木腐菌的抑菌效果研究?

趙 艷 程澤琦 羅來朋 龐久寅

（北華大學，吉林省吉林市 132013）

木聚糖具有抑菌性強、綠色無毒等特點［1-3］，是一種天然生物防腐劑，主要存在于自然界植物細胞的半纖維素中，占植物細胞干重的35%，是由木糖經β-1,4糖苷件連接而成的高分子物質。通過前期研究發(fā)現(xiàn)，納米木聚糖的粒徑較小，更容易滲入到木材孔隙中，抗流失性好，在木材中可以更好地分散和滲透，在常壓下浸泡木材就能獲得較好的防腐效果［4-6］。相比傳統(tǒng)木材防腐劑，其原料范圍廣，可從玉米芯、麩皮、甘蔗渣、玉米秸稈、花生殼、棉籽殼等農林廢棄物提取獲得，無毒無害，并可自然降解，不會對人體及環(huán)境產生不利影響。目前，木聚糖主要應用于制藥、污水處理、造紙助劑、熱塑性材料、食品添加劑等領域，在木質材料防腐中的應用還鮮有研究［7-8］。本文主要以彩絨革蓋菌和密粘褶菌為供試菌種，從呼吸作用、電導率、蛋白質滲出率等方面入手，研究納米木聚糖對木腐菌生理生化機制的影響，探討其對木腐菌的抑菌效果，為開發(fā)新型高效木材天然生物防腐劑提供參考［9-13］。

1 材料與方法

1.1 材料

麥芽糖馬鈴薯培養(yǎng)基；考馬斯亮藍試劑盒，分析純，Solarbio；BSA標準蛋白（5 mg/mL），分析純，考馬斯亮藍試劑盒中配備；葡萄糖，食品級，汕頭市未來食品有限公司；乙醇、硫酸、氫氧化鈉，分析純，天津市大茂化學試劑廠；彩絨革蓋菌（Coriolus versicolor）、密粘褶菌（Gloeophyllum trabeum）,阿壩州分部研究所。

1.2 設備

TP200精密微差壓差計，北京昶信科技發(fā)展有限公司；BBS-V800超凈工作臺，山東博科生物產業(yè)有限公司；電熱恒溫浴鍋，電動攪拌器，ET-60恒溫孵育器，金壇市富華儀器有限公司；TG328A分析天平，上海天平儀器廠；高速離心機，立式蒸汽滅菌器，細菌培養(yǎng)箱，安徽中科中佳科學儀器有限公司；3173R電導率儀，南京海納儀器設備有限公司；LP-5118多功能酶標分析儀，山東桑澤儀器儀表有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 木聚糖提取工藝

選擇干燥、無蟲蛀、無霉變的玉米芯，先用錘子敲碎成小塊，然后置于粉碎機中粉碎，過40 目篩，備用［8-9］。準確稱取玉米芯 10 g，在電爐上煮沸，4 h后濾去多余水分后裝入三口瓶中，加入 250 mL 濃度為25%的NaOH溶液，94 ℃攪拌浸提 3 h，離心，取上清液、過濾，并向過濾液體中加入體積比為1∶3 的95%的乙醇，濾去液體，并利用高速離心機在8 000 r/min下離心10 min即可得到木聚糖粗制品［14-16］。

1.3.2 納米木聚糖提取工藝

將1 g木聚糖加入100 mL 的2% NaOH溶液，在60 ℃溫度下溶解，用稀酸調節(jié)pH值至5.5，加入3倍體積的乙醇進行沉淀，抽慮后進行冷凍干燥，制得納米木聚糖。

1.3.3 麥芽糖馬鈴薯培養(yǎng)基的配制

稱取100 g新鮮馬鈴薯，去皮，切成小塊，放在500 mL細口錐形瓶內，加水后煮沸。待煮沸30 min后，濾去土豆塊，加水補足至300 mL，并向其中加入6 g葡萄糖，即為麥芽糖馬鈴薯培養(yǎng)基。

1.3.4 納米木聚糖對木腐菌有氧呼吸試驗

高濃度的氫氧化鈉溶液可以吸收木腐菌有氧呼吸所產生的CO2，通過精密微差壓差計測定系統(tǒng)中的氣壓變化來判斷木腐菌的呼吸量［17-18］。試驗所用裝置如圖1所示。

圖1 木腐菌有氧呼吸測定裝置Fig.1 Device of respiration determination

在超凈工作臺中進行試驗，首先取容量為100 mL的三口瓶，用無菌槍頭向其中加入20 mL含納米木聚糖的麥芽糖培養(yǎng)基，納米木聚糖的質量分數(shù)分別為1%、5%、10%。然后向錐形瓶內加入2 g菌絲，輕輕打散。將10% NaOH浸濕的紗布加塞在瓶口處，并在瓶塞傳感器的連接處和瓶塞與瓶身連接處均涂抹凡士林，以確保氣密性檢測無問題，將連接好的裝置從超凈工作臺中取出，放入28 ℃恒溫孵育箱中，在錐形瓶底部放置磁力攪拌器，開啟磁力攪拌器輕輕攪拌。每隔10 min，用精密微差壓差計記錄氣壓變化值，測定時長為120 min。

1.3.5 納米木聚糖對木腐菌胞內蛋白滲出量試驗

考馬斯亮藍法是一種測定蛋白質濃度的方法?？捡R斯亮藍G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，吸光值為488 nm，與蛋白質結合后會變?yōu)榍嗌?，吸光值?95 nm。吸光值的大小與蛋白質濃度成正比，具體濃度可通過標準蛋白所繪制的標準曲線計算獲得［19-21］。

首先將5 mg/mL的標準蛋白分別配制為0、20、40、60、80、100、160、200 μg/mL的標準蛋白溶液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。然后稱取2種木腐菌各1 g，并用1%、2%、5%、8%、10%不同質量分數(shù)的納米木聚糖20 mL處理24 h。

試驗用96孔板進行，每項做3個副孔。在分配并標記好96孔板后，用移液槍取20 μL蒸餾水和180 μL考馬斯亮藍，加入到96孔板內，記為對照空白孔。用移液槍分別取20 μL標準蛋白溶液（0、20、40、60、80、100、160、200 μg/mL）和180 μL考馬斯亮藍，加入到96孔板內，記為標準蛋白孔；用移液槍分別取20 μL不同質量分數(shù)納米木聚糖處理過的木腐菌液和180 μL考馬斯亮藍，加入到96孔板內，記為測定孔。

全部孔加完后，在室溫下靜置10 min后，用酶標儀在595 nm下測定各個孔的吸光度，記錄并計算蛋白濃度。用標準蛋白孔的吸光值制作標準曲線，以確定其余孔中的蛋白質濃度，標準曲線如圖2所示。

圖2 BSA蛋白標準曲線Fig.2 Standard curve of BSA protein

1.3.6 納米木聚糖對木腐菌細胞通透性試驗

通過測定溶液電導率的變化確定納米木聚糖對木腐菌細胞膜通透性的影響，電導率增加越快，細胞膜通透性越大［22-24］。

稱取彩絨革蓋菌和密粘褶菌菌絲各3 g，分別放入1%、5%、10%不同質量分數(shù)的納米木聚糖中，使用電導率儀測定其電導率變化，并用含同量吐溫-80的蒸餾水作為對照組。根據(jù)電導率變化判斷納米木聚糖對木腐菌菌絲細胞膜通透性的影響［25］。校正電導率=實際電導率-對照。

2 結果與分析

2.1 納米木聚糖對木腐菌有氧呼吸的影響

根據(jù)木腐菌有氧呼吸程度，分析研究納米木聚糖對2種木腐菌新陳代謝的影響。浸有10% NaOH的紗布條可以吸收木腐菌呼出的CO2，從而使密閉裝置中的氣壓略為下降。通過精密微差壓差計觀測密閉裝置的氣壓變化，結果如圖3所示。

圖3 納米木聚糖對木腐菌有氧呼吸的影響Fig.3 Effects of nano-xylan on aerobic respiration of wood-rot fungi

從圖3中可以看出，納米木聚糖對白腐菌彩絨革蓋菌的有氧呼吸具有一定的抑制作用。隨著時間的增加，精密微差壓差計測得的值逐漸變小，并趨向于穩(wěn)定，說明彩絨革蓋菌的有氧呼吸越來越弱。隨著納米木聚糖質量分數(shù)的增加，對彩絨革蓋菌的有氧呼吸抑制性越強，90 min時，彩絨革蓋菌的呼吸作用趨于穩(wěn)定。對于褐腐菌密粘褶菌的有氧呼吸抑制性則較弱，當時間到達120 min時，密粘褶菌的氣壓仍處于下降趨勢，并未趨于平穩(wěn)，這說明密粘褶菌的有氧呼吸依舊在繼續(xù)。

試驗表明，納米木聚糖對彩絨革蓋菌的有氧呼吸有抑制作用，隨著納米木聚糖質量分數(shù)額提升，對彩絨革蓋菌的有氧呼吸抑制性越強。但納米木聚糖對密粘褶菌的有氧呼吸抑制性有限。

2.2 納米木聚糖對木腐菌胞內蛋白滲出量的影響

從圖4可以看出，隨著納米木聚糖質量分數(shù)的提升，白腐菌彩絨革蓋菌和褐腐菌密粘褶菌的蛋白滲出量均呈上升趨勢，納米木聚糖可以作用于木腐菌的細胞膜，使細胞膜的通透性增加。但相較而言，彩絨革蓋菌的蛋白滲出量要多于密粘褶菌。

圖4 納米木聚糖對木腐菌蛋白滲出量的影響Fig.4 Effect of nano xylan on protein exudation of wood rot fungus

2.3 納米木聚糖對木腐菌細胞通透性的影響

由圖5可知，與對照樣相比，納米木聚糖能夠提升彩絨革蓋菌的菌絲電導率，且質量分數(shù)越高電導率也越高，在10 min時基本趨于穩(wěn)定。這說明納米木聚糖可以增加彩絨革蓋菌的通透性。如圖6所示，與對照樣相比，納米木聚糖使密粘褶菌的電導率上升，并隨著納米木聚糖質量分數(shù)的增加，密粘褶菌的電導率增加，總體上升幅度較小。這說明納米木聚糖可以增加密粘褶菌的通透性，但是效果有限。

圖5 納米木聚糖對彩絨革蓋菌電導率的影響Fig.5 The effect of nanoxylan on the cells conductivityof Coriolus versicolor

圖6 納米木聚糖對密粘褶菌電導率的影響Fig.6 The effect of nanoxylan on the cells conductivity of Gloeophyllum trabeum

3 結論

1）納米木聚糖對白腐菌彩絨革蓋菌的有氧呼吸有抑制作用，隨著納米木聚糖質量分數(shù)的提升，對彩絨革蓋菌有氧呼吸抑制性就越強，在90 min時，彩絨革蓋菌的呼吸作用趨于穩(wěn)定。但納米木聚糖對褐腐菌密粘褶菌的有氧呼吸抑制性有限，在120 min時，其有氧呼吸依舊在繼續(xù)。

2）通過考馬斯亮藍法測定發(fā)現(xiàn)，納米木聚糖處理可以增加木腐菌蛋白質滲出率，彩絨革蓋菌的蛋白滲出率要大于密粘褶菌。

3）納米木聚糖處理木腐菌后，會增加木腐菌所在溶液的電導率，這說明納米木聚糖可以增大木腐菌細胞膜的通透率，使細胞內電解質外泄。

4）納米木聚糖對白腐菌彩絨革蓋菌的抑制性要強于褐腐菌密粘褶菌。