早期激素性股骨頭壞死動物模型制備的實驗研究*

石包圣，閆國珍，李愛華，李志遠，何俊峰，劉 揚

(1.內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院研究生學院2018級研究生，內(nèi)蒙古包頭 014060；2.內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病房超聲科)

股骨頭壞死為常見的骨科疾病，股骨頭壞死致病機制尚未研究清楚，構(gòu)建合適的動物模型可為治療提供新的選擇方案，研究致病過程中機體的變化。目前制備早期股骨頭壞死的方法有單激素制備法、激素聯(lián)合其他因子制備法、酒精制備法。Yamamoto等[1]首先對實驗兔注射大劑量甲潑尼龍，43 %的實驗動物發(fā)生血小板減少癥、低纖維蛋白原血癥及嚴重的股骨頭壞死。Bai等[2]研究發(fā)現(xiàn)單激素制備股骨頭壞死動物模型需要長期持續(xù)給予大劑量激素，制備時間長，且多次注射僅增加股骨頭壞死率，但病灶范圍及嚴重程度無明顯變化。在研究激素聯(lián)合異體物質(zhì)過程中，內(nèi)毒素可造成血管內(nèi)皮損傷、炎癥反應增加，股骨頭壞死發(fā)生率、血液微循環(huán)發(fā)生障礙率增加。Yamamoto等[3]注射內(nèi)毒素聯(lián)合大劑量激素改良股骨頭壞死制備方案，成模率升至85 %，但死亡率隨之升至50 %，證明減少內(nèi)毒素使用劑量降低實驗動物死亡率。因此，添加異體物質(zhì)可使實驗動物骨內(nèi)外血管處于高凝狀態(tài)，縮短制備時間，但會增加引起過度免疫反應幾率，造成實驗動物死亡。

本實驗用內(nèi)毒素聯(lián)合不同劑量激素制備早期股骨頭壞死。在實驗動物選擇方面，兔子體型中等，動物資源較易獲得，飼養(yǎng)難度低，且可通過頂端給水使實驗動物長期處于站立狀態(tài)，使實驗兔的受力方式更接近人類，故本實驗選用兔為實驗動物[4]。骨陷窩中骨細胞消失情況的發(fā)生是股骨頭壞死發(fā)生病理診斷標志，因此本實驗通過比較各組空骨陷窩陽性率明確早期股骨頭壞死制備情況[5]。本實驗首先使用小劑量內(nèi)毒素聯(lián)合臀部肌肉注射不同劑量激素構(gòu)建早期股骨頭壞死，明確激素最佳使用時間，其次在超聲引導下向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射激素，觀察制備早期股骨頭壞死動物模型，觀察是否可以減少構(gòu)建動物模型的時間，以便為快速簡便制備股骨頭壞死提供新的研究方法及思路。

1 材料與方法

1.1材料 新西蘭白兔(包頭醫(yī)學院動物實驗中心提供)；甲基強的松龍(天津金耀藥業(yè)有限公司)；內(nèi)毒素(北京寰宇科創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司)；青霉素鈉(濟南允誠生物科技有限公司)；生理鹽水(石家莊四藥有限公司)；戊巴比妥鈉(上海榕柏生物技術(shù)有限公司)；靶向藥物微泡造影劑(上海博萊科信誼藥業(yè)有限責任公司)。

1.2動物模型制備方法 將35只實驗動物隨機分為7組，頂端供水、供食，分籠適應性飼養(yǎng)2周后進行分組：(1)A組：空白對照組；(2)傳統(tǒng)組：傳統(tǒng)制備法為內(nèi)毒素聯(lián)合臀部肌肉注射20 mg/kg甲基強的松，根據(jù)注射激素時間分為B組(3 d)、C組(5 d)、D組(7 d)；(3)改良組：超聲制備改良法為內(nèi)毒素聯(lián)合超聲下關(guān)節(jié)腔注射激素，根據(jù)激素注射時間分為E組(3 d)、F組(5 d)、G組(7 d)。首先傳統(tǒng)制備法和超聲制備改良法均經(jīng)耳緣靜脈注射10 μg/kg內(nèi)毒素，隨后注射激素，制備早期股骨頭壞死動物模型。用戊巴比妥鈉(0.7 mL/kg)麻醉動物，將其仰臥位固定四肢于實驗臺，碘伏消毒，下肢外展，超聲引導下將22 G穿刺針送入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，拔出針芯注射0.2 mL生理鹽水，明確穿刺針位置，更換注射器向關(guān)節(jié)囊內(nèi)注射等劑量激素；空白對照組注射等量生理鹽水。

實驗兔繼續(xù)飼養(yǎng)4周后，經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞法處死動物，取出雙側(cè)股骨頭及干垢端，用福爾馬林液固定3 d后，每周更換脫鈣液脫鈣，直至穿刺針輕易穿刺插入脫鈣組織，終止脫鈣；取材脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，病理切片行病理形態(tài)學觀察。

1.3觀察指標

1.3.1一般情況 給藥后3組動物食量、脫毛情況、體重及步態(tài)變化。記錄實驗動物死亡時間，并立即解剖分析死因，統(tǒng)計各組死亡數(shù)量。

1.3.2影像學觀察 (1)二維彩超檢查方法：術(shù)前使用脫毛劑對耳緣靜脈、股骨頭觀察區(qū)域備皮，耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉麻醉，實驗兔取仰臥位，四肢固定于實驗臺，碘伏消毒，下肢外展，使用9 MHz淺表探頭掃查兔股骨頭長軸，觀察骨皮質(zhì)及關(guān)節(jié)腔形態(tài)。(2)超聲造影檢查：用5 mL生理鹽水溶解造影劑，用力振搖直至凍干粉末完全分散。經(jīng)耳緣靜脈注入聲諾維造影劑0.4 mL，同時啟動計時器，檢查時保持探頭不動，連續(xù)觀察2 min，并存儲動態(tài)影像。觀察股骨頭周圍血供情況，有無血管數(shù)目減少。(3)X射線平片觀察觀察股骨頭骨皮質(zhì)是否連續(xù)完整，有無骨質(zhì)缺損，有無出現(xiàn)新月征(crescent sign)或壞死灶被硬化骨包繞及節(jié)段性塌陷。

1.3.3病理學檢查 光鏡下觀察組織學切片，觀察股骨頭形態(tài)學變化及病理學改變，任選5個400倍視野，記數(shù)視野內(nèi)的全部骨陷窩數(shù)和空骨陷窩數(shù)，計算空骨陷窩陽性率=(空骨陷窩數(shù)/全部骨陷窩數(shù))×100 %。

2 結(jié)果

2.1一般情況 傳統(tǒng)組注射激素7 d后進食量增大，14 d時開始出現(xiàn)飲食差，活動度減低，臀部激素注射區(qū)域出現(xiàn)區(qū)域性脫毛，21 d時出現(xiàn)精神萎靡，稀便。改良組注射后出現(xiàn)上述情況早于傳統(tǒng)組3 d，關(guān)節(jié)腔注射激素后，2只兔穿刺部位滲血，下肢腫脹，給予穿刺部位紗布包扎及白眉蛇毒凝血針1 kU皮下注射后，下肢腫脹好轉(zhuǎn)。

2.2影像學觀察

2.2.1二維超聲及造影表現(xiàn) 對照組股骨頭骨皮質(zhì)完整，表面光滑，未見骨贅形成，關(guān)節(jié)囊無積液，周圍軟組織未見水腫，彩色多普勒(CDFI)可見周邊可見豐富血流信號，傳統(tǒng)組、改良組股骨頭形態(tài)結(jié)構(gòu)及超聲表現(xiàn)未見明顯異常。超聲造影顯示對照組圍血管顯影良好，未見局部充盈缺損，傳統(tǒng)組及改良組股骨頭周圍血管顯影數(shù)目減少。見圖1。

圖1 股骨頭二維超聲及造影圖

2.2.2X線影像學表現(xiàn) 對照組、傳統(tǒng)組及改良組股骨頭骨皮質(zhì)連續(xù)完整，改良組少部分股骨頭可見骨密度不均，但無特異性表現(xiàn)，未見骨質(zhì)彌漫性病變、囊性病變，未見微骨折及股骨頭壞死特征性表現(xiàn)“新月征”或壞死灶被硬化骨包繞及節(jié)段性塌陷。見圖2。

圖2 股骨頭X線顯像比較

2.3病理學檢查及相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 空白對照組股骨頭顏色潤白，股骨頭及軟骨形態(tài)完整，無缺損，骨質(zhì)硬，切割阻力大，軟骨表面光滑、骨細胞、軟骨細胞排列整齊，骨小梁排列規(guī)則整齊，空骨陷窩細胞少見，可見正常脂肪細胞分布。傳統(tǒng)組及改良組病理：部分骨細胞排列紊亂，間質(zhì)血管擴張、淤血，隨激素注射時間延長，脂肪細胞數(shù)量增多，骨小梁數(shù)目減少，分布稀疏，兩組動物模型均未見骨小梁斷裂。

傳統(tǒng)組及改良組與對照組行空骨陷窩陽性率比較，三組間比較采用方差分析，其中注射3 d的各組空骨陷窩陽性率，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，注射時長為5 d、7 d的各組空骨陷窩陽性率，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；改良組空骨陷窩陽性率均高于傳統(tǒng)組(P<0.05)。見圖3、表1。

圖3 對照組、傳統(tǒng)組、改良組病理學改變

表1 各組兔股骨頭壞死空骨陷窩細胞率(%)

3 討論

在制備激素性股骨頭壞死中，內(nèi)毒素可增加股骨頭壞死發(fā)生率。喻鈞倫等[6]發(fā)現(xiàn)，單純內(nèi)毒素注射實驗動物死亡率高達80 %，而使用小劑量內(nèi)毒素聯(lián)合激素方法死亡率僅為18 %，注射5 μg/kg內(nèi)毒素聯(lián)合甲強龍第8周成功造模。我們的預實驗發(fā)現(xiàn)，注射10 μg/kg內(nèi)毒素后實驗動物活動差，精神差，出現(xiàn)1只實驗動物死亡，給予青霉素及間隔24 h后給予實驗性激素后，動物一般情況改善。針對于上述情況，后期實驗給予提前12 h預防性注射青霉素，10 min內(nèi)緩慢推注內(nèi)毒素，后期實驗中無動物死亡。頂端給水可使實驗動物站立，使其受力接近人類，但未長期持續(xù)性站立，相關(guān)因素仍未能量化，下一步需設計相關(guān)飼養(yǎng)籠使實驗動物長期站立，使其長時間保持受力與人類相近；而且在食物方面，兔為素食性，是否可改變其食物譜來縮短構(gòu)建股骨頭壞死動物模型時間仍可進行相關(guān)研究。

本實驗行超聲及X線未見到特殊性新月征表現(xiàn)，但目前在嚴重股骨頭壞死中可發(fā)現(xiàn)微骨折，而早期股骨頭壞死僅表現(xiàn)為空骨陷窩細胞異常，在早期及晚期股骨頭壞死的漸變過程中目前無標準，下一步實驗可延長造模時間，觀察出現(xiàn)微骨折時間，為中晚期激素性股骨頭壞死的實驗模型構(gòu)建提供相關(guān)數(shù)據(jù)。田媛媛等[7]研究發(fā)現(xiàn)，注射內(nèi)毒素及激素導致骨質(zhì)內(nèi)微血管數(shù)目減少，行病理學微血管計數(shù)發(fā)現(xiàn)模型組數(shù)目較空白組減少，但本實驗未進行骨質(zhì)微血管相關(guān)研究，下一步可推進相關(guān)骨質(zhì)微循環(huán)MRI表現(xiàn)及病理學表現(xiàn)的相關(guān)研究。

近年來超聲儀器分辨率的提高和超聲介入技術(shù)提升使超聲微創(chuàng)治療及診斷快速發(fā)展。超聲監(jiān)視下制備動物模型具有微創(chuàng)性、安全性、快速性、有效性，避免部分并發(fā)癥發(fā)生等優(yōu)勢，目前在心臟驟停模型，肺部腫瘤、心包積液、關(guān)節(jié)出血、重癥胰腺炎[8-10]的實驗動物制備中發(fā)揮了重要作用。本實驗通過超聲引導下注射激素，可實時明確穿刺部位及周圍有無血管，避免損傷周圍血管造成對于股骨頭供血影響，確保穿刺針進入關(guān)節(jié)囊腔內(nèi)，大幅度提升了目標區(qū)域的藥物濃度，避免了大劑量激素對于實驗動物的全身性損傷，穿刺過程中觀察關(guān)節(jié)周圍出血及滲液情況，必要時給予抗凝對癥治療。根據(jù)本實驗結(jié)果，改良組的空骨陷窩細胞數(shù)目數(shù)量多于傳統(tǒng)組。減少藥物注射時間，可降低因持續(xù)藥物注射導致的實驗動物死亡。但兔關(guān)節(jié)囊腔容積量小，并且術(shù)后兔下肢活動度大，導致關(guān)節(jié)腔內(nèi)藥物因肌肉擠壓而外滲，影響藥物吸收，因此如何修改注射部位及明確最佳藥物濃度可作為下一步研究方向。本實驗為注射激素后繼續(xù)飼養(yǎng)四周，后續(xù)實驗可延長飼養(yǎng)時間觀察延長飼養(yǎng)時間能否增加股骨頭空骨陷窩細胞發(fā)生率。

綜上所述，超聲引導下制備股骨頭壞死可縮短實驗動物制備時間，具體實驗方法可進一步改進，為制備相關(guān)實驗動物模型提供新思路。