選擇性頭部亞低溫對缺氧缺血性腦病新生兒血清細(xì)胞焦亡相關(guān)分子的影響

詹 震，林先紅，鄭 洪，張詩海，解啟蓮

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是指圍生期窒息、缺氧、缺血引發(fā)的新生兒腦損傷性疾病。在發(fā)達(dá)國家新生兒HIE的發(fā)生率為活產(chǎn)兒的1‰～8‰，在欠發(fā)達(dá)國家這一數(shù)字高達(dá)26‰[1]。HIE病情進(jìn)展可導(dǎo)致不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，是兒童神經(jīng)系統(tǒng)損傷如智力障礙、癲癇、腦性癱瘓等的常見原因之一。歷史上對于HIE急性期治療主要以全身支持和對癥治療為主，近年來醫(yī)學(xué)研究致力于尋找治療HIE新途徑。亞低溫療法通過物理方法將體溫下降2～5 ℃而達(dá)到疾病治療目的。研究[2]顯示，亞低溫療法可降低HIE新生兒的病死率和18月齡時嚴(yán)重殘疾的發(fā)生率，對于中、重度HIE新生兒，適度的亞低溫治療現(xiàn)已成為標(biāo)準(zhǔn)治療方案的一部分。

細(xì)胞焦亡是一種新發(fā)現(xiàn)的促炎性細(xì)胞程序性死亡方式，廣泛參與許多神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展，如腦損傷、癲癇、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、神經(jīng)退行性疾病等，亦被發(fā)現(xiàn)在HIE病理生理中起著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞焦亡的經(jīng)典途徑依賴于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)的激活，并伴隨釋放大量炎性細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-18，產(chǎn)生促炎信號，從而誘發(fā)強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)[3]。亞低溫具有明確的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，我國選擇性頭部亞低溫治療新生兒缺氧缺血性腦病多中心協(xié)作組[4]證實，選擇性頭部亞低溫(selective head cooling，SHC)治療可降低HIE新生兒嚴(yán)重傷殘率。本研究選取細(xì)胞焦亡特征性的炎性關(guān)鍵酶Caspase-1以及細(xì)胞因子IL-1β、IL-18三項指標(biāo)，觀察SHC治療不同臨床分期HIE新生兒上述三項指標(biāo)的變化，以期了解SHC治療HIE可能的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制?，F(xiàn)作報道。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2018年8月至2020年7月我院新生兒科病區(qū)收治的確診為HIE的新生兒共45例(HIE組)。其中男21例，女24例；出生體質(zhì)量2.50～4.33 kg；出生胎齡37.9～38.7周；輕度HIE 13例，中度HIE 20例，重度HIE 12例。中、重度HIE新生兒共32例按照是否進(jìn)行SHC治療分為常規(guī)治療組(常規(guī)組)15例和SHC治療組(SHC組)17例，常規(guī)組男7例，女8例，出生體質(zhì)量3.09～3.55 kg，出生胎齡37.9～38.4周；SHC組男7例，女10例，出生體質(zhì)量2.88～3.52 kg，出生胎齡38.0～38.3周。同期選取正常足月新生兒10名作為對照組，男5名，女5名，出生體質(zhì)量2.50～3.96 kg，出生胎齡37.6～39.0周。各組新生兒性別、出生體質(zhì)量、出生胎齡均具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會審核及批準(zhǔn)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 HIE組 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2005年8月中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會新生兒學(xué)組制定的《新生兒缺氧缺血性腦病診斷標(biāo)準(zhǔn)》[5]，并按照該標(biāo)準(zhǔn)中臨床分度標(biāo)準(zhǔn)確定HIE患兒臨床分期。排除標(biāo)準(zhǔn)：新生兒母親孕期有妊娠合并癥如高血壓、乙型肝炎、糖尿病、傳染病等。

1.2.2 SHC組 納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷為中、重度HIE，出生胎齡≥36周，且出生體質(zhì)量≥2 500 g的新生兒，同時具有以下情況，(1)存在胎兒宮內(nèi)窘迫的依據(jù)；(2)存在新生兒窒息的依據(jù)；(3)存在新生兒HIE或者振幅整合腦電圖腦功能檢測異常的依據(jù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)出生時間>12 h；(2)初始振幅整合腦電圖檢查無異常；(3)具有復(fù)雜難治性先天性畸形；(4)存在自發(fā)性出血傾向；(5)存在急性顱腦損傷相關(guān)疾病；(6)存在先天性感染相關(guān)疾病。

1.2.3 對照組 納入標(biāo)準(zhǔn)：新生兒母親孕期均無妊娠合并癥，新生兒無宮內(nèi)生長發(fā)育遲緩史，出生時無窒息史。

1.3 方法 HIE組新生兒確定臨床分期及治療方案后積極予以治療，此過程在新生兒出生12 h內(nèi)完成，常規(guī)組予對癥支持治療，即積極三維持(維持良好的通氣、換氣功能；維持周身和各臟器足夠的血液灌流；維持血糖在正常高值)，三對癥治療(控制驚厥、降低顱內(nèi)壓、消除腦干癥狀)。SHC組在積極常規(guī)治療基礎(chǔ)上進(jìn)行SHC治療，操作過程按照復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院新生兒腦損傷課題組[6]制定的《亞低溫治療新生兒缺氧缺血性腦病方案(2011)》實行。

1.4 觀察指標(biāo) 比較各組新生兒治療前后不同時點(diǎn)血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平。以確定HIE組新生兒臨床分期與治療方案開始治療為0 h，分別采集對照組、HIE組新生兒外周靜脈血2 mL，并于治療24、48、72 h分別采集SHC組、常規(guī)組新生兒外周靜脈血2 mL，均置于采血管中，3 500 r/min離心后分離血清，于-15 ℃冷凍保存。采用ELISA法測定血清標(biāo)本中Caspase-1、IL-1β、IL-18水平，試劑盒由Solarbio公司提供，操作方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t檢驗、方差分析、q檢驗和Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 對照組和不同分期HIE組新生兒血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平比較 不同臨床分期HIE組新生兒血清Caspase-1、IL-1β水平均高于對照組，且Caspase-1、IL-1β水平均隨HIE臨床分期加重而上升(P<0.05)；重度、中度HIE組血清IL-18水平均高于對照組和輕度HIE組，重度HIE組亦高于中度HIE組(P<0.05)，但輕度HIE組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

2.2 血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平與HIE臨床分期相關(guān)性分析 HIE新生兒血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平與HIE臨床分期均呈明顯正相關(guān)關(guān)系(rs=0.820、0.913、0.683，P<0.01)。

2.3 SHC組和常規(guī)組治療前后血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平比較 2組0 h血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，SHC組治療24 h血清Caspase-1和48、72 h時血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平均明顯低于常規(guī)組(P<0.01)。治療48、72 h，SHC組Caspase-1、IL-1β、IL-18水平均明顯低于0、24 h(P<0.05)；而常規(guī)組48 h時血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平均較0 h上升(P<0.05)，72 h時IL-1β、IL-18水平仍明顯高于0 h，而Caspase-1水平與0 h差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 SHC組和常規(guī)組各時點(diǎn)血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平比較

3 討論

新生兒HIE腦損傷發(fā)生機(jī)制有許多因素參與，如線粒體損傷、自由基的產(chǎn)生、氧化亞氮合酶的活化、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等[7]。HIE最突出的特征是神經(jīng)元的死亡引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，這種炎癥反應(yīng)主要由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)，小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)唯一的先天免疫細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞在各種信號刺激下，NLRP3等相關(guān)蛋白形成炎性小體并發(fā)展成活化的Caspase-1，Cpaspase-1會切割I(lǐng)L-1β、IL-18原蛋白并激活GSDMD打孔蛋白，釋放出大量IL-1β、IL-18并誘導(dǎo)細(xì)胞膜穿孔，從而觸發(fā)細(xì)胞焦亡經(jīng)典途徑[8]。研究[9]顯示，HIE患兒外周血細(xì)胞焦亡經(jīng)典途徑的關(guān)鍵分子水平的升高與損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，并通過建立缺血缺氧腦損傷體外模型進(jìn)一步證實NLRP-3/Caspase-1/GSDMD軸介導(dǎo)的經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑參與了HIE的病理生理機(jī)制，導(dǎo)致更高水平的小膠質(zhì)細(xì)胞活化。

亞低溫治療HIE的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制與溫度與代謝之間的關(guān)鍵關(guān)系有關(guān)，同時可減少新生兒缺氧缺血再灌注后引起的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡以及抑制炎癥反應(yīng)[10]。細(xì)胞凋亡已被證實是HIE腦損傷中遲發(fā)性級聯(lián)性神經(jīng)細(xì)胞死亡的方式之一[11]，不同于細(xì)胞凋亡，細(xì)胞焦亡需炎性Caspase介導(dǎo)且具有強(qiáng)烈的促炎性特征，是一種新發(fā)現(xiàn)的HIE腦損傷發(fā)生機(jī)制，目前對于亞低溫治療HIE的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制尚未完全清楚，為揭示亞低溫治療HIE的可能保護(hù)機(jī)制，我們假定SHC治療HIE可通過減少細(xì)胞焦亡水平來實現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用，開展本次研究。

細(xì)胞焦亡經(jīng)典途徑依賴于Caspase-1的介導(dǎo)，其具有通過蛋白水解的切割方式作用于大多數(shù)底物的裂解，包括炎性體相關(guān)的細(xì)胞因子IL-1β、IL-18及細(xì)胞焦亡的最終執(zhí)行蛋白GSDMD[12]。XU等[13]利用Caspase-1抑制劑VX765處理CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型，發(fā)現(xiàn)抑制劑顯著下調(diào)了細(xì)胞焦亡水平并減少了炎癥細(xì)胞因子的釋放，保護(hù)了腦的超微結(jié)構(gòu)。Caspase-1是細(xì)胞焦亡經(jīng)典途徑必不可少的關(guān)鍵蛋白。本研究結(jié)果顯示，不同程度HIE組新生兒血清Caspase-1水平均高于對照組，且其水平隨病情嚴(yán)重而增加；接受常規(guī)治療的中、重度HIE新生兒血清Caspase-1濃度水平在48 h前隨治療時間的推移上升，而后緩慢下降，接受SHC治療的新生兒Caspase-1濃度水平隨治療時間的推移呈逐漸下降趨勢，未見高峰。提示Caspase-1與HIE病情發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且與常規(guī)治療比較，SHC治療可有效降低Caspase-1水平，SHC可能通過類似Caspase-1抑制劑的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制減少HIE病程中細(xì)胞焦亡水平以改善病程。

IL-1β、IL-18是在天然免疫防御過程中細(xì)胞焦亡經(jīng)Caspase-1充分切割底物釋放的主要細(xì)胞炎癥因子。研究[14]表明，細(xì)胞焦亡最終導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂的重要執(zhí)行蛋白GSDMD影響著IL-1β的分泌過程。本研究發(fā)現(xiàn)，HIE新生兒血清IL-1β、IL-18與Caspase-1水平同時隨病情嚴(yán)重程度升高，這或說明它們之間可能存在上下游作用的關(guān)系，相關(guān)分析結(jié)果顯示，Caspase-1、IL-1β、IL-18與HIE臨床分期具有相關(guān)關(guān)系。HUANG等[15]利用IRE1α抑制劑STF083010作用于新生HIE大鼠模型，導(dǎo)致了IL-1β、IL-18表達(dá)降低，證明抑制劑在新生HIE大鼠模型中通過逆轉(zhuǎn)HIE細(xì)胞焦亡的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，HIE新生兒血清IL-1β、IL-18水平均高于對照組，且隨病情嚴(yán)重程度而升高；常規(guī)組IL-1β、IL-18水平治療后呈上升趨勢，而SHC組IL-1β、IL-18水平治療后各時點(diǎn)均呈下降趨勢。提示IL-1β、IL-18在HIE病情發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮誘發(fā)炎癥反應(yīng)的作用，SHC治療HIE可通過類似IRE1α抑制劑減少細(xì)胞焦亡水平而抑制缺氧缺血后炎癥反應(yīng)的機(jī)制發(fā)揮作用。

綜上，細(xì)胞焦亡可能在HIE發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，而SHC治療可能通過減少缺氧缺血性腦損傷后的細(xì)胞焦亡水平而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用，由此可為新的HIE亞低溫治療方案設(shè)計及神經(jīng)保護(hù)藥物開發(fā)提供思路。