脊髓集落刺激因子1在大鼠嗎啡鎮(zhèn)痛耐受中的作用

趙 昱，吳 軍，安 揚(yáng)，常 青

嗎啡鎮(zhèn)痛耐受是指嗎啡的鎮(zhèn)痛效能進(jìn)行性降低，只有不斷加大使用劑量才能維持同等鎮(zhèn)痛效果，其嚴(yán)重限制了嗎啡在臨床重度疼痛治療中的應(yīng)用。相關(guān)研究[1]證實(shí)，脊髓內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活導(dǎo)致的神經(jīng)炎性反應(yīng)在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的形成中發(fā)揮重要作用。集落刺激因子1(colony-stimulating factor 1,CSF1)是一種對(duì)單核細(xì)胞的增殖、分化及維持活性發(fā)揮重要作用的細(xì)胞因子。研究[2]表明，使用CSF1受體(CSF1R)拮抗劑可以阻斷小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。神經(jīng)病理性疼痛的研究[3]發(fā)現(xiàn)，感覺神經(jīng)元中CSF1缺失可以完全阻斷神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺過敏，并抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化和增殖，相反，鞘內(nèi)注射CSF1可以誘發(fā)機(jī)械性痛覺過敏和小膠質(zhì)細(xì)胞增殖。但在嗎啡耐受機(jī)制研究中對(duì)CSF1的研究仍較少，鑒于嗎啡鎮(zhèn)痛耐受和神經(jīng)病理性疼痛有著許多相同的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制，推測(cè)脊髓CSF1可能參與嗎啡耐受過程。因此，本文通過鞘內(nèi)連續(xù)注射嗎啡建立嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的在體模型[4]，旨在探討嗎啡鎮(zhèn)痛耐受形成過程中大鼠脊髓CSF1的表達(dá)變化，以及CSF1R拮抗劑是否能夠抑制嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的形成，以期為闡明脊髓CSF1在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受中的作用提供實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量(220±10)g，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。屏蔽系統(tǒng)環(huán)境：光照周期12 h，光照時(shí)間8:00-20:00，溫度(23±1)℃，所有操作和動(dòng)物處理遵循國(guó)家衛(wèi)生機(jī)構(gòu)制定的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物指南。

1.1.2 藥物與試劑 鹽酸嗎啡(沈陽(yáng)第一制藥廠，生產(chǎn)批號(hào)：120909)；CSF1R拮抗劑PLX3397(Selleck公司，美國(guó))和IBA-1兔多克隆抗體(1∶400,Wako，日本)；熒光素標(biāo)記羊抗兔二抗(1∶1 000，Millipore，美國(guó))；CSF1小鼠單克隆抗體(1∶1 000，Millipore，美國(guó))；β-Tubulin兔多克隆抗體(1∶1 000，Abcam，英國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 大鼠鞘內(nèi)置管術(shù) 腹腔注射苯巴比妥鈉(35～45 mg/kg)麻醉大鼠。以髂嵴連線確定第5腰椎間隙。切開L5背部皮膚，分離椎旁肌，鉗去L6腰椎部分脊突，暴露出第5腰椎間隙。用8號(hào)針頭傾斜60°角插入椎間隙。大鼠尾部或后肢突然抽動(dòng)表明針頭進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔。退出針頭，將事先充滿0.9%氯化鈉溶液的microspinal導(dǎo)管插入第5椎間隙，管腔中有清亮液體反流表明導(dǎo)管進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔。將導(dǎo)管朝頭端方向插入2～2.5 cm，使導(dǎo)管末端位于脊髓腰骶部。封閉導(dǎo)管外口并把皮膚外的導(dǎo)管固定于腰部的皮膚。以4-0手術(shù)線分層縫合肌肉與皮膚。大鼠術(shù)后至少恢復(fù)4 d 后開始實(shí)驗(yàn)。術(shù)后出現(xiàn)后肢或尾部癱瘓、運(yùn)動(dòng)功能障礙的動(dòng)物從實(shí)驗(yàn)中排除并立即注射過量苯巴比妥鈉注射致死。實(shí)驗(yàn)結(jié)束取材時(shí)觀察導(dǎo)管位置，確定導(dǎo)管末端位置。位置不正確的大鼠行為學(xué)數(shù)據(jù)從該組中排除。

1.2.2 分組與給藥 成功鞘內(nèi)置管SD大鼠60只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為0.9%氯化鈉溶液組(NS組)、嗎啡組(MOR組)、CSF1R抑制劑組(PLX3397組)、CSF1R抑制劑+嗎啡組(PLX3397+MOR組)，各15只。其中NS組連續(xù)7 d鞘內(nèi)及灌胃給予等容積0.9%氯化鈉溶液；MOR組連續(xù)7 d鞘內(nèi)給予15 μg嗎啡(20 μL)；PLX3397組連續(xù)7 d鞘內(nèi)給予等容積0.9%氯化鈉溶液，灌胃給予CSF1R抑制劑PLX3397(290 mg/kg)；PLX3397+MOR組連續(xù)7 d鞘內(nèi)給予15 μg嗎啡(20 μL)，并灌胃給予CSF1R抑制劑PLX3397(290 mg/kg)[5]。分別于鞘內(nèi)注射1、3、5、7 d進(jìn)行大鼠疼痛行為學(xué)測(cè)量，并于注射嗎啡7 d后斷頭處死大鼠，Western blotting法測(cè)定腰段脊髓CSF1表達(dá)，免疫熒光染色法檢測(cè)腰段脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況。

1.2.3 疼痛行為學(xué)測(cè)試 (1)甩尾潛伏期法(tail flick latency,TFL)：于給藥30 min后，用熱水(50±0.2)℃甩尾法測(cè)定甩尾閾值。待大鼠尾巴迅速甩離水面時(shí)用秒表記錄從大鼠尾部入水到開始甩尾的時(shí)間，此時(shí)間為大鼠熱水甩尾潛伏期(s)。大鼠尾部在熱水中停留最長(zhǎng)時(shí)間為15 s(cut-off time)，以免對(duì)尾部造成損傷。給藥前為基礎(chǔ)甩尾潛伏期(basal tail flick latency，BL)，給藥后為實(shí)驗(yàn)甩尾潛伏期(test tail flick latency，TL)。按照上述方法連續(xù)測(cè)定3次，每次間隔2 min。將3次潛伏期的平均值作為痛閾值?；A(chǔ)閾值3～5 s，閾值超過5 s的動(dòng)物從實(shí)驗(yàn)中排除。(2)機(jī)械縮足反射閾值法(mechanical withdrawal threshold,MWT)：用von Frey纖維絲以u(píng)p-down法推算50%機(jī)械縮足反射閾值。將一有機(jī)玻璃箱(22 cm×12 cm×22 cm)置于金屬篩網(wǎng)上，待大鼠在有機(jī)玻璃箱中適應(yīng)15 min后，用von Frey纖維絲垂直刺激大鼠后肢足底中部，持續(xù)時(shí)間≤4 s，大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽(yáng)性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。測(cè)定首先從2 g開始，當(dāng)該力度的刺激不能引起陽(yáng)性反應(yīng)，則給予相鄰大一級(jí)力度的刺激；如出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)則給予相鄰小一級(jí)力度的刺激，如此連續(xù)進(jìn)行，直至出現(xiàn)第一次陽(yáng)性和陰性反應(yīng)的騎跨，再連續(xù)測(cè)定4次。最大力度為15 g，大于此值時(shí)記為15 g。每次刺激間隔30 s。給藥前為基礎(chǔ)縮足反射閾值(BL)，給藥后為實(shí)驗(yàn)縮足反射閾值(TL)。每次給藥前及給藥后30 min分別測(cè)定閾值，將所得的BL、TL帶入公式%MPE=(TL-BL)/(cut-off time-BL)×100%。以%MPETFL和%MPEMWT作為行為學(xué)結(jié)果。

1.2.4 Western blotting法檢測(cè)脊髓CSF1表達(dá) 戊巴比妥鈉腹腔注射深麻醉后斷頭處死大鼠(n=4)，迅速分離腰段脊髓(L4～L6節(jié)段)組織，液氮速凍后-80 ℃深低溫冰箱保存。提取蛋白時(shí)，將組織放入2 mL勻漿器中，按1 mL/100 mg比例加入預(yù)冷的蛋白提取液(KeyGEN全蛋白提取試劑盒)，充分勻漿后冰上裂解15 min，轉(zhuǎn)移至潔凈EP管后4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液即為蛋白提取液。用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Peirece，美國(guó))進(jìn)行蛋白定量。配制12% SDS-PAGE凝膠，每個(gè)泳道上樣量均為100 μg，120 V恒壓電泳70 min，待溴酚藍(lán)染料到達(dá)凝膠底部時(shí)停止電泳。80 V恒壓濕法轉(zhuǎn)膜80 min，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至0.45 μm孔徑PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜后使用封閉液室溫封閉1 h，一抗(CSF1小鼠單克隆抗體1∶1 000，β-Tubulin兔多克隆抗體1∶1 000)4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記種屬特異性二抗(山羊抗小鼠及山羊抗兔抗體1∶5 000)室溫?fù)u床孵育1 h，使用ECL化學(xué)發(fā)光液于熒光和可見光凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech)顯影并進(jìn)行條帶灰度分析，通過計(jì)算目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參照蛋白條帶灰度值的比值，半定量分析目的蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 免疫熒光染色法檢測(cè)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活 疼痛行為學(xué)測(cè)定結(jié)束后，戊巴比妥鈉腹腔注射深麻醉后斷頭處死大鼠(n=3)。用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液100 mL和4%多聚甲醛400 mL經(jīng)左心室灌注固定。將腰段脊髓(L4～L6)即腰膨大取出，4%多聚甲醛后固定2 h后置入蔗糖溶液梯度脫水。冰凍切片機(jī)(LEICA)切片(片厚12 μm)。IBA-1兔多克隆抗體(1∶400)4 °C 孵育過夜，熒光素標(biāo)記羊抗兔二抗(1∶1 000)37 °C避光孵育1 h，各步驟間用PBS沖洗3次，5分鐘/次，50%甘油封片后熒光顯微鏡拍片，并用Image pro-Plus 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CSF1R拮抗劑對(duì)嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的影響 MOR組和MOR+PLX3397組在嗎啡注射1 d時(shí)均產(chǎn)生最大鎮(zhèn)痛作用(P<0.05)，2組%MPETFL和%MPEMWT差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。注射嗎啡3 d時(shí)MOR組大鼠開始出現(xiàn)鎮(zhèn)痛耐受，至7 d時(shí)形成明顯耐受，MOR組%MPE進(jìn)行性降低(P<0.05)。MOR+PLX3397組大鼠接受嗎啡注射后3、5、7 d時(shí)，與MOR組%MPE差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PLX3397組與NS組各時(shí)點(diǎn)%MPE差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 4組大鼠鞘內(nèi)注射給藥后不同時(shí)點(diǎn)%MPETFL和%MPEMWT比較

2.2 CSF1R拮抗劑對(duì)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響 注射嗎啡7 d后，MOR組小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物IBA-1在大鼠腰段脊髓背角表達(dá)較NS組增加(P<0.05)，MOR+PLX3397組大鼠IBA-1表達(dá)較MOR組減少(P<0.05)，NS組與PLX3397組大鼠腰段脊髓背角IBA-1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 4組大鼠IBA-1陽(yáng)性細(xì)胞比較

2.3 CSF1R拮抗劑對(duì)脊髓CSF1表達(dá)的影響 注射嗎啡7 d后，MOR組和MOR+PLX3397組大鼠腰段脊髓CSF1表達(dá)均較NS組增加(P<0.05)，MOR組和MOR+PLX3397組CSF1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，NS組與PLX3397組CSF1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。

表3 4組大鼠脊髓CSF1蛋白表達(dá)比較

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，慢性嗎啡處理能激活大鼠脊髓CSF1的表達(dá)，而給予CSF1R拮抗劑，不僅可以明顯抑制嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的形成，還可以抑制脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。提示脊髓CSF1參與嗎啡鎮(zhèn)痛耐受形成。

嗎啡等阿片類藥物用于治療疼痛已有數(shù)千年歷史。嗎啡耐受是慢性嗎啡誘導(dǎo)的一種適應(yīng)性過程，表現(xiàn)為μ阿片受體在分子水平以及突觸和細(xì)胞水平上的復(fù)雜變化。現(xiàn)已證實(shí)，嗎啡可以引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)炎性反應(yīng)[6]，這與嗎啡鎮(zhèn)痛的抑制以及嗎啡誘導(dǎo)的耐受性、依賴性和藥物濫用直接相關(guān)[7]。有研究[8]表明，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受中發(fā)揮重要作用，而抑制膠質(zhì)細(xì)胞激活可以降低嗎啡耐受發(fā)生。

有研究[9]發(fā)現(xiàn)，阻斷CSF-1R信號(hào)通路可以有效減輕坐骨神經(jīng)部分結(jié)扎引起的神經(jīng)病理性疼痛，并能夠抑制脊髓內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活。CSF-1R是一種受體酪氨酸激酶，在巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、非造血細(xì)胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞上均有表達(dá)，CSF-1R具有兩種同源配體，即CSF-1和IL-34，它們?cè)谥袠猩窠?jīng)系統(tǒng)表達(dá)區(qū)域呈現(xiàn)出不重疊性，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖和存活。CSF-1R的表達(dá)隨腦發(fā)育而顯著下降，而IL-34和CSF-1的表達(dá)則維持在較高水平。CSF-1又稱巨噬細(xì)胞集落刺激因子，是調(diào)控組織巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞的主要生長(zhǎng)因子。小膠質(zhì)細(xì)胞是廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞，是免疫防御的第一道防線，在炎癥反應(yīng)中被激活。本研究選用的PLX3397是一種口服有效的CSF1R抑制劑，具有高度選擇性及能透過血腦屏障的特點(diǎn)，可用于特異性的小膠質(zhì)細(xì)胞的消除[5]。

鑒于嗎啡鎮(zhèn)痛耐受和神經(jīng)病理性疼痛有著許多相同的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制，本研究發(fā)現(xiàn)，慢性嗎啡處理可以上調(diào)脊髓內(nèi)CSF1表達(dá)，以及激活脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞，而CSF1R抑制劑PLX3397可以抑制嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的形成，及抑制脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，這些結(jié)果表明CSF1可能介導(dǎo)了嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的形成。在神經(jīng)病理性痛模型中，脊髓CSF1來源于受損感覺神經(jīng)元分泌已有報(bào)道[3]，但在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受模型中，導(dǎo)致脊髓內(nèi)CSF1表達(dá)增加的細(xì)胞來源還有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，CSF1介導(dǎo)了嗎啡耐受的形成。本文為深入闡明嗎啡耐受機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)資料，為防治嗎啡耐受提供了新的研究方向。