循環(huán)腫瘤細(xì)胞在晚期乳腺癌中的應(yīng)用價(jià)值*

歐陽(yáng)航，陳德波，駱時(shí)木，楊培東，吳一波，張志珊△

福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.乳腺外科，福建泉州 362000

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，全球每年約有170萬(wàn)例乳腺癌新發(fā)病例，其發(fā)病率處于較高水平[1]。在我國(guó)，女性乳腺癌的發(fā)病率同樣處于較高水平，發(fā)病例數(shù)及死亡例數(shù)分別占全球乳腺癌總發(fā)病例數(shù)和總死亡例數(shù)的11.2%和9.2%[2]。盡管近年來(lái)通過(guò)手術(shù)、放化療及分子靶向治療等方法使晚期乳腺癌的治療效果有了較大提升，但患者5年總體生存率依然不夠理想，大多數(shù)患者死于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，在患者血液、骨髓和淋巴結(jié)中難以檢測(cè)出的微小轉(zhuǎn)移病灶是引起患者不良預(yù)后的重要因素[3]。當(dāng)乳腺癌進(jìn)展到晚期或出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移時(shí)，治療效果非常不理想。研究表明，在早期乳腺癌患者中便可發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞直接或間接通過(guò)淋巴途徑進(jìn)入到外周血中[4]，這部分由原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶播散進(jìn)入血液循環(huán)并存活下來(lái)的腫瘤細(xì)胞被稱作循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)。在治療期間對(duì)CTC數(shù)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)能夠及時(shí)反映治療效果，可為治療方案的可行性及患者的預(yù)后評(píng)估提供參考依據(jù)[5]。目前，關(guān)于利用CTC對(duì)晚期乳腺癌患者進(jìn)行治療效果評(píng)價(jià)的研究較少，且存有爭(zhēng)議，因此，有必要進(jìn)一步探究CTC動(dòng)態(tài)變化在晚期乳腺癌中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年6月至2020年1月本院乳腺外科收治的經(jīng)病理檢查確診為晚期乳腺癌的女性患者43例為研究組，平均年齡(49.6±9.3)歲；臨床分期：Ⅳ期27例，Ⅲ期16例；已絕經(jīng)28例，未絕經(jīng)15例；Ki67標(biāo)記指數(shù)≥15%的有38例，<15%的有5例；雌激素受體(ER)陽(yáng)性23例，陰性20例；孕激素受體(PR)陽(yáng)性23例，陰性20例；人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2(HER-2)陽(yáng)性19例，陰性24例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女性，年齡≥18歲，具有完整的臨床資料；(2)依從性好，ECOG評(píng)分為0、1或2分；(3)根據(jù)實(shí)體腫瘤的療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.1(RECIST 1.1)，至少有1個(gè)可測(cè)量病灶。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)不符合晚期乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)合并其他類型腫瘤及心腦血管、肝、腎和血液系統(tǒng)嚴(yán)重疾病；(3)患者在參加本研究期間接受切除轉(zhuǎn)移病灶的手術(shù)或放療。另選取健康體檢女性15例為對(duì)照組，平均年齡(38.8±8.9)歲。TNM分期采用美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)第8版標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2儀器與試劑 循環(huán)腫瘤細(xì)胞差相富集試劑盒和熒光原位雜交試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cytelligen公司，正置熒光顯微鏡購(gòu)自日本尼康公司，ThermoBrite原位雜交儀購(gòu)自美國(guó)雅培公司。血清癌胚抗原(CEA)、糖類抗原125(CA125)及糖類抗原15-3(CA15-3)檢測(cè)使用I2000SR全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑盒(美國(guó)雅培公司)。

1.3方法 采用差相富集-免疫熒光原位雜交計(jì)數(shù)法(SE-iFISH)檢測(cè)CTC。收集研究對(duì)象血液標(biāo)本時(shí)為防止上皮細(xì)胞污染，在棄掉前2 mL靜脈血后收集靜脈血7.5 mL于枸櫞酸鈉抗凝管中，混勻，4 h內(nèi)處理。通過(guò)差相富集法及試劑配套的特殊離心介質(zhì)可去除血液標(biāo)本中的紅細(xì)胞和血漿蛋白，然后利用偶聯(lián)CD45的免疫磁珠去除血液標(biāo)本中的白細(xì)胞，進(jìn)而富集得到CTC。進(jìn)一步結(jié)合免疫熒光染色與染色體原位雜交，使用CEP8探針雜交腫瘤細(xì)胞，使用抗CD31抗體結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而有效鑒定出CTC。

1.3.1CEA、CA125及CA15-3檢測(cè) 使用促凝真空采血管采集研究對(duì)象靜脈血3 mL，2 100×g離心10 min分離血清，置于I2000SR全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀中進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2結(jié)果判定 (1)CTC鑒定標(biāo)準(zhǔn)：將DAPI+、CD45-、CD31-且CEP8≠2鑒定為CTC,以CTC≥1個(gè)/7.5 mL為外周血CTC陽(yáng)性。鑒定CTC需排除白細(xì)胞及異倍體循環(huán)血管內(nèi)皮細(xì)胞(CEC)的干擾，白細(xì)胞鑒定標(biāo)準(zhǔn):DAPI+、CD45+、CD31-且CEP8=2；CEC鑒定標(biāo)準(zhǔn):DAPI+、CD45-、CD31+且CEP8≠2。(2)CEA、CA125及CA15-3陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：CEA>3.0 ng/mL為陽(yáng)性；CA125>35 U/mL為陽(yáng)性；CA15-3>14 U/mL為陽(yáng)性。

1.4乳腺癌患者療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 影像學(xué)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：患者治療2個(gè)周期后通過(guò)超聲或者CT 等影像學(xué)檢查測(cè)量實(shí)體腫瘤的最大經(jīng)，比較治療前后差異。治療效果分為4類，疾病進(jìn)展：基線病灶最大徑總和增加≥20%或者出現(xiàn)新的病灶；疾病穩(wěn)定：基線病灶最大徑總和有縮小但未達(dá)到部分緩解,或者有增加但未達(dá)到疾病進(jìn)展；部分緩解:基線病灶最大徑總和縮小≥30%；完全緩解:所有目標(biāo)病灶消失。以部分緩解、完全緩解為治療有效，疾病進(jìn)展、疾病穩(wěn)定為治療無(wú)效。

2 結(jié) 果

2.1CTC檢測(cè)結(jié)果 熒光顯微鏡下可見(jiàn)白細(xì)胞、CEC及CTC，見(jiàn)圖1。

2.2治療前晚期乳腺癌患者CTC檢測(cè)結(jié)果 研究組43例晚期乳腺癌患者中，CTC陽(yáng)性的有37例，陽(yáng)性率為86.05%。陽(yáng)性患者CTC的個(gè)數(shù)為(1～23)個(gè)/7.5 mL，檢出的CTC總數(shù)為147個(gè)，平均值為4(1，5)個(gè)/7.5 mL。對(duì)照組15例健康體檢女性中僅發(fā)現(xiàn)1例三倍體CTC，陽(yáng)性率為6.67%。研究組與對(duì)照組CTC陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=31.017，P<0.05)。

2.3治療前CTC與常用腫瘤標(biāo)志物診斷晚期乳腺癌的效能比較 ROC曲線分析結(jié)果顯示，與CEA、CA15-3、CA125相比，CTC診斷晚期乳腺癌的曲線下面積(AUC)最大，為0.897，特異度、靈敏度、準(zhǔn)確度分別為93.33%、86.05%、87.93%，見(jiàn)表1、圖2。

表1 治療前CTC與常用腫瘤標(biāo)志物診斷晚期乳腺癌的效能比較

2.4治療前CTC陽(yáng)性率與晚期乳腺癌患者臨床特征的關(guān)系 治療前CTC陽(yáng)性率與晚期乳腺癌患者的年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、臨床分期、ER、PR、Ki67標(biāo)記指數(shù)、HER-2均無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 治療前CTC陽(yáng)性率與晚期乳腺癌患者臨床特征的關(guān)系(n)

2.5治療前后CTC陽(yáng)性率與患者療效的關(guān)系 43例晚期乳腺癌患者中，有38例患者在治療后根據(jù)影像學(xué)檢查結(jié)果評(píng)估了療效。33例治療前CTC陽(yáng)性患者中，治療有效的有20例，治療有效率為60.61%(20/33)，5例治療前CTC陰性患者中，治療有效的有2例，治療有效率為40.00%(2/5)。治療前CTC陽(yáng)性與陰性患者的治療有效率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。19例治療后CTC陽(yáng)性患者的治療有效率為36.84%(7/19)，低于19例治療后CTC陰性患者的治療有效率[78.95%(15/19)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.6治療前后CTC數(shù)量變化與患者療效的關(guān)系 在38例可隨訪的患者中，治療前CTC陽(yáng)性率為86.84%(33/38)，治療后CTC陽(yáng)性率為50.00%(19/38)，治療后CTC陽(yáng)性率較治療前明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

治療后，57.89%(22/38)的患者治療有效，42.11%(16/38)的患者治療無(wú)效。與治療前相比，治療后CTC數(shù)量減少的有25例，治療有效率為72.00%(18/25)；治療后CTC數(shù)量未發(fā)生改變的有6例，治療有效率為50.00%(3/6)；治療后CTC數(shù)量增加的有7例，治療有效率為14.29%(1/7)。治療后CTC數(shù)量減少患者的治療有效率明顯高于CTC數(shù)量增加的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

乳腺癌作為女性最常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，因其死亡的患者占所有因腫瘤死亡患者的14%[6]。在每年新發(fā)的乳腺癌患者中，3%～10%確診時(shí)就已經(jīng)屬于晚期，短期內(nèi)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致晚期乳腺癌患者預(yù)后差及死亡的主要原因，而影像學(xué)和傳統(tǒng)的血清學(xué)標(biāo)志物難以及時(shí)有效地監(jiān)測(cè)到腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移情況，從而影響臨床的及時(shí)治療。近年來(lái)，CTC作為“液體活檢”的良好指標(biāo)，已成為乳腺癌及其他惡性腫瘤診療和預(yù)后評(píng)估的一個(gè)研究熱點(diǎn)，其在外周血中的水平變化與患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外，在人體的骨髓中也發(fā)現(xiàn)存在腫瘤細(xì)胞，這些細(xì)胞被稱為彌散腫瘤細(xì)胞(DTC)[7]。雖然有研究表明，DTC對(duì)乳腺癌患者具有獨(dú)立的預(yù)后評(píng)估價(jià)值，存在DTC的乳腺癌患者中有30%～50%可能在10年內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移[8-9]，但DTC的檢測(cè)標(biāo)本需要通過(guò)骨髓穿刺獲得，這對(duì)患者來(lái)說(shuō)接受度較低。而外周血標(biāo)本更容易獲得且可反復(fù)采集，因此，外周血中的CTC更適用于臨床常規(guī)檢測(cè)。已有研究表明，CTC用于預(yù)測(cè)早期乳腺癌及轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的預(yù)后時(shí)具有較高的臨床價(jià)值[5]。CRISTOFANILLI等[10]通過(guò)多中心的前瞻性研究證明了外周血CTC≥5個(gè)/7.5 mL可提示轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者預(yù)后不良，且無(wú)論是在治療前后CTC都是乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。檢測(cè)CTC不僅對(duì)患者預(yù)后有提示意義，還可以輔助乳腺癌早期診斷、預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展、評(píng)估療效，并且對(duì)臨床治療方案的選擇也具有重要的指導(dǎo)意義[11]。

本研究采用的SE-iFISH是利用免疫磁珠篩除非腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而達(dá)到富集CTC的目的。此外，該法無(wú)須裂解去除紅細(xì)胞，從而避免了低滲對(duì)CTC的損傷，其相比陽(yáng)性富集法擁有更高的檢出率[12]，且特殊制備的免疫磁珠對(duì)非目標(biāo)細(xì)胞具有極低的非特異吸附性，可提高檢測(cè)的特異性。本研究發(fā)現(xiàn)，在43例晚期乳腺癌患者外周血中，治療前已有37例檢測(cè)到CTC陽(yáng)性，證明在大部分晚期乳腺癌患者中存在CTC。治療前CTC診斷晚期乳腺癌的靈敏度為86.05%，特異度為93.33%，AUC為0.897，均高于其他常用的腫瘤標(biāo)志物(CEA、CA125、CA15-3)，提示CTC對(duì)晚期乳腺癌具有較高的診斷價(jià)值。相對(duì)于LI等[13]采用CellSearch技術(shù)檢測(cè)出的進(jìn)展期胃癌患者CTC 陽(yáng)性率為54.8%，以及李健斌等[14]采用CellCollector技術(shù)檢測(cè)出的治療前轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者CTC陽(yáng)性率為74.8%，本研究中CTC的陽(yáng)性率較高。這一方面可能與所采用的SE-iFISH檢出率較高有關(guān)。GE等[15]采用SE-iFISH對(duì)肺癌和食管癌患者外周血中的CTC 進(jìn)行檢測(cè)，分別有92%和87%的檢出率。GAO等[16]采用SE-iFISH檢測(cè)胰腺癌患者的CTC時(shí)，檢測(cè)靈敏度和特異度分別為88%和90%。另一方面可能與本研究納入的研究對(duì)象均為病情較重的晚期乳腺癌患者有一定關(guān)系。

CTC與乳腺癌患者的預(yù)后密切相關(guān),然而CTC與患者治療療效及臨床特征之間的關(guān)系目前仍存在較大爭(zhēng)議。本研究進(jìn)一步分析了43例晚期乳腺癌患者的CTC陽(yáng)性率與臨床特征間的關(guān)系，結(jié)果顯示，治療前CTC陽(yáng)性率與患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、臨床分期、ER、PR、Ki67標(biāo)記指數(shù)、HER-2均無(wú)關(guān)(P>0.05)，與LUCCI等[17]發(fā)現(xiàn)的CTC陽(yáng)性率與HER-2及Ki67標(biāo)記指數(shù)有關(guān)的結(jié)果存在差異。RACK等[18]研究表明，乳腺癌患者的分子分型與CTC陽(yáng)性率無(wú)關(guān)。但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Lum A型和Lum B型乳腺癌患者中HER-2陰性患者的CTC數(shù)量更多[19]。

有研究認(rèn)為，CTC可監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的治療效果，在患者接受有效治療后，外周血中的CTC數(shù)量將減少[20]。JIANG等[21]的研究表明，CTC可用于乳腺癌的療效監(jiān)測(cè)，CTC數(shù)量增加與乳腺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。但也有研究發(fā)現(xiàn)，晚期乳腺癌患者在治療過(guò)程中CTC數(shù)量的變化與患者的療效無(wú)關(guān)，盡管治療后患者CTC數(shù)量下降，但這并不代表患者的治療是有效的[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，治療后患者CTC陽(yáng)性率明顯低于治療前(P<0.05)，治療后CTC陰性患者的治療有效率高于治療后CTC陽(yáng)性患者(P<0.05)，且治療后CTC數(shù)量減少患者的治療有效率明顯高于CTC數(shù)量增加的患者(P<0.05)，提示CTC可用于監(jiān)測(cè)晚期乳腺癌患者的治療效果。當(dāng)出現(xiàn)通過(guò)影像學(xué)或僅存在非可測(cè)量病變而難以判斷患者療效的情況時(shí)，CTC監(jiān)測(cè)可用于患者的療效評(píng)估。有研究發(fā)現(xiàn)，治療前CTC陰性的乳腺癌患者治療有效率高于治療前CTC陽(yáng)性的患者[23]，而本研究治療前CTC陽(yáng)性與陰性患者的治療有效率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，推測(cè)出現(xiàn)結(jié)果不一致的原因可能與本研究入組患者均為晚期乳腺癌患者，治療前具有較高的CTC陽(yáng)性率，導(dǎo)致結(jié)果可能存在偏倚有關(guān)。

綜上所述，CTC在晚期乳腺癌的診斷及療效評(píng)估方面具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。但本研究納入的樣本量較少，該結(jié)論還需大樣本、多中心的臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。