核仁小RNA：腫瘤及其他多種疾病的新型分子標(biāo)志物*

孫潔璇，高 卓 綜述，姜曉峰 審校

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院檢驗(yàn)科,黑龍江哈爾濱 150028

隨著新一代測序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對多種疾病致病及易感基因的了解越來越深入，而非編碼RNA(ncRNA)家族無疑是近年來分子生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，其在多水平調(diào)控著疾病進(jìn)程中關(guān)鍵基因的表達(dá)。ncRNA家族成員可分為兩種主要類型：基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)型和調(diào)控型。從表觀遺傳學(xué)的角度來看，調(diào)控型ncRNA更受關(guān)注。核仁小RNA(snoRNA)長度為60～300個(gè)核苷酸，在脊椎動(dòng)物中大多數(shù)由內(nèi)含子區(qū)編碼產(chǎn)生，每個(gè)內(nèi)含子編碼產(chǎn)生的snoRNA不超過1個(gè)[1]，因此snoRNA是ncRNA家族中最具特征的一類。snoRNA的傳統(tǒng)功能被認(rèn)為是參與核糖體RNA(rRNA)轉(zhuǎn)錄過程中假尿苷化和2′-甲基化修飾。已有研究表明，在黑色素瘤、卵巢癌、肝癌、肺癌和乳腺癌等惡性腫瘤及其他多種疾病中，snoRNA都存在異常表達(dá)，且發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[2-6]。此外，snoRNA在血清標(biāo)本中可以穩(wěn)定存在且更易于檢測[7]。因此，snoRNA有望作為腫瘤及其他多種疾病早期診斷、療效檢測、預(yù)后評估的潛在分子生物學(xué)標(biāo)志物[7]，并可能為藥物治療提供新的靶點(diǎn)。

1 snoRNA基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能

snoRNA主要定位于核仁或Cajal小體，根據(jù)保守序列的結(jié)構(gòu)不同主要分為Box C/D和Box H/ACA兩個(gè)家族[8]。Box C/D snoRNA存在兩個(gè)短的保守序列，分別位于5′和3′末端附近的C盒(UGAUGA)和D盒(CUGA)，而Box H/ACA snoRNA則是共有的發(fā)夾-鉸鏈-發(fā)夾-尾巴結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在鉸鏈區(qū)(ANANNA，其中N是任意核苷酸)中包含1個(gè)保守序列H盒，并在其中包含1個(gè)ACA盒分別形成C型和發(fā)夾型結(jié)構(gòu)。snoRNA必須與相應(yīng)蛋白復(fù)合物結(jié)合形成核仁小核糖核蛋白復(fù)合體(snoRNP)以便于開啟后期功能。Box C/D snoRNA與4個(gè)必需纖維蛋白(Nop1p、Nop56p、Nop58p和15.5-kDa/Snu13)結(jié)合形成snoRNP，指導(dǎo)其RNA靶標(biāo)的2′-O-核糖甲基化。而Box H/ACA snoRNA則可與蛋白質(zhì)Cbf5、Nop10、L7Ae和Gar1結(jié)合形成snoRNP，指導(dǎo)RNA靶標(biāo)假尿苷化[9]。最近還發(fā)現(xiàn)了不以堿基配對的方式識別靶向序列的Box C/D snoRNA，稱為孤兒snoRNA[10]。

除了基礎(chǔ)的修飾外，snoRNA可能是細(xì)胞代謝、應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)。MICHEL等[11]發(fā)現(xiàn),在棕櫚酸酯誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型中，3種snoRNA(SNORD32A、SNORD33、SNORD35A)的缺失會(huì)使細(xì)胞免受脂肪毒性，而在經(jīng)脂多糖處理的小鼠肝組織中，SNORD32A、SNORD33、SNORD35A的表達(dá)顯著上調(diào)。此外，在缺氧條件下SNORD14A和SNORD83B的表達(dá)顯著上調(diào)[12]。雖然snoRNA主要參與RNA轉(zhuǎn)錄過程的修飾，但是研究發(fā)現(xiàn)snoRNA可以像微小RNA(miRNA)一樣發(fā)揮功能，是某些miRNA的前體。ENDER等[13]發(fā)現(xiàn),snoRNA ACA45衍生出20～22個(gè)核苷酸的RNA能夠抑制靶基因CDC2L6的表達(dá)，類似于miRNA。此外，YIN等[14]發(fā)現(xiàn)，在HeLa細(xì)胞和人類胚胎干細(xì)胞中存在長鏈非編碼RNA(LncRNA)，LncRNA兩個(gè)末端各包含1個(gè)snoRNA序列。還有研究發(fā)現(xiàn)，SNORD50A過表達(dá)或缺失都會(huì)影響信使RNA(mRNA)3′端的加工效率，說明snoRNA在mRNA 3′端加工中起到重要的調(diào)節(jié)作用[15]。

2 snoRNA與腫瘤

2.1snoRNA與腫瘤的早期診斷 早期有效診斷可明顯延長腫瘤患者的生存期，腫瘤發(fā)現(xiàn)的早晚決定了患者的治療方式和預(yù)后。snoRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在血液標(biāo)本中以高豐度穩(wěn)定存在，擁有早期診斷類分子標(biāo)志物的基本特質(zhì)，具備作為大范圍體檢指標(biāo)的潛力。MEI等[16]發(fā)現(xiàn)，SNORA42在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中高表達(dá)，并可以促進(jìn)人類NSCLC細(xì)胞的增殖及小鼠體內(nèi)NSCLC組織的生長，起到癌基因的作用。LIAO[7]等對NSCLC患者NSCLC組織與正常組織的研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)于NSCLC組織的snoRNA(SNORD33、SNORD66和SNORD76)聯(lián)合診斷NSCLC的靈敏度為83.8%，特異度為96.2%。SNORD76不僅在NSCLC中高表達(dá)，還在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)。WU等[17]通過受試者工作特征曲線驗(yàn)證了SNORD76在肝細(xì)胞癌早期診斷中有較高的應(yīng)用價(jià)值(曲線下面積為0.73)。有研究發(fā)現(xiàn)，在人類前列腺癌組織中高表達(dá)SNORA55，沉默該基因的表達(dá)可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[18]。ZHU等[19]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)SNORD89可導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期的S期，使卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力增強(qiáng)?？梢?，snoRNA可以成為腫瘤診斷的一類新的分子標(biāo)志物。

2.2snoRNA與腫瘤的預(yù)后 snoRNA不僅能夠影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，其對腫瘤的不良預(yù)后也有一定提示作用。SUN等[20]發(fā)現(xiàn)，SNORA7B在乳腺癌中起到致癌基因的作用，SNORA7B的表達(dá)與癌灶大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，并且高表達(dá)SNORA7B的乳腺癌患者總體生存率明顯降低。SNORA7B可以為乳腺癌患者提供準(zhǔn)確的預(yù)后評估。HE等[21]研究發(fā)現(xiàn)，SNORD16在結(jié)腸癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)，高、低SNORD16表達(dá)組患者的5年生存率分別為56.0%和78.4%。與癌旁組織相比，肝細(xì)胞癌組織中SNORD78表達(dá)上調(diào)，并且SNORD78的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致患者總生存期及無復(fù)發(fā)生存期縮短[22]。SNORD78也與NSCLC的預(yù)后不良有關(guān)，SNORD78高表達(dá)患者的預(yù)后明顯差于低表達(dá)患者[23]。此外，多種snoRNA聯(lián)合檢測對腫瘤預(yù)后不良有更高的預(yù)測價(jià)值，例如在胃癌中高表達(dá)的8種snoRNA(ACA47、E2、ACA10、SNORA58、HBII-316、U70、U8和U66)[24]，在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)的5種snoRNA(SNORD114-17、SNORA36B、SNORD78、U3chr2及U3chr17)[25]，在腎透明細(xì)胞癌中高表達(dá)的6種snoRNA(SNORA2、SNORD12B、SNORA59B、SNORA70B、SNORD93和SNORD116-2)[26]，以及在NSCLC中高表達(dá)的6種snoRNA(SNORA47、SNORA68、SNORA78、SNORA21、SNORD28和SNORD66)[27]。

2.3snoRNA作為腫瘤的治療靶點(diǎn) 沉默snoRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄途徑是腫瘤的治療靶點(diǎn)。XU等[28]發(fā)現(xiàn)，SNORD47在體內(nèi)和體外都可以顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長和增殖。雖然替莫唑胺作為治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的一線化療藥物，但其耐藥性限制了治療效果，而SNORD47在抑制體內(nèi)腫瘤生長方面與替莫唑胺具有協(xié)同作用。此外，SNORD76在肝細(xì)胞癌中表達(dá)水平明顯增高，其通過誘導(dǎo)G0/G1期細(xì)胞而發(fā)揮作用，為治療肝細(xì)胞癌提供了潛在的靶點(diǎn)[17]。SNORA21在結(jié)直腸癌中過表達(dá)，其通過調(diào)控S期細(xì)胞促進(jìn)腫瘤浸潤，這可能成為結(jié)直腸癌的潛在治療靶點(diǎn)[29]。CUI等[30]發(fā)現(xiàn)，SNORA23僅在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中表達(dá)，在非胰腺導(dǎo)管腺癌組織中未檢測到，并且在胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞中SNORA23的表達(dá)水平與侵襲能力呈正相關(guān)，與患者無病生存期呈負(fù)相關(guān)；在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)抑制SNORA23的表達(dá)可抑制腫瘤的形成，為胰腺導(dǎo)管腺癌提供了一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

2.4snoRNA參與腫瘤的病理過程 隨著對snoRNA研究的不斷深入，QIN等[31]發(fā)現(xiàn)，沉默SNORA74B可通過誘導(dǎo)PH域富含亮氨酸重復(fù)蛋白磷酸酶(PHLPP)基因表達(dá)及抑制蛋白激酶B(AKT)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路來抑制膽囊癌細(xì)胞的增殖。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號通路異常激活是引起肺癌的機(jī)制之一[32]。TANG等[33]發(fā)現(xiàn),抑制SNORA71A表達(dá)后，MAPK/ERK信號通路中的ERK1/2磷酸化水平也會(huì)被抑制。此外，胞內(nèi)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信號通路的異常激活也是引起腫瘤的機(jī)制之一，在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)的snoRNA ACA11和SNORD126都是通過激活PI3K/AKT信號通路來促進(jìn)肝細(xì)胞癌增殖、遷移和侵襲[34-35]。WANG等[36]發(fā)現(xiàn)，敲除在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)的SNOU2-19可以誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-連環(huán)蛋白(β-catenin)易位，抑制Wnt/β-catenin信號通路，從而影響癌細(xì)胞的增殖。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志，也是浸潤性癌的特征之一[37]，SNORD76通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)肝細(xì)胞癌的侵襲[17]，SNORD47通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生[38]。

3 snoRNA與其他疾病

3.1遺傳性疾病 普拉德-威利綜合征(PWS)是一種父源染色體15q11.2-q13區(qū)域印記基因功能缺陷所導(dǎo)致的遺傳性疾病，其臨床表現(xiàn)主要為認(rèn)知障礙、發(fā)育遲緩、睡眠異常和導(dǎo)致肥胖的暴飲、暴食。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠PWS模型中SNORD116的缺失更容易出現(xiàn)出生后體質(zhì)量低、身材矮小、骨量減少、貪食和能量消耗改變[6]，而SNORD115則與各種心理和行為變化(如自閉癥)有關(guān)[5]。

3.2自身免疫性疾病 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種以細(xì)胞免疫和體液免疫功能障礙為特征，并介導(dǎo)組織器官損傷的自身免疫性疾病，其主要發(fā)病機(jī)制是T和B淋巴細(xì)胞的高度活化和功能異常。LAI等[4]發(fā)現(xiàn)，SLE患者T淋巴細(xì)胞中SNORA12的表達(dá)水平降低，并且其表達(dá)水平與SLE疾病活動(dòng)度評分呈負(fù)相關(guān)。SNORA12表達(dá)水平的升高明顯抑制了干擾素(IFN)-γ的分泌，而IFN-γ是一種關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子，其在SLE患者的血清中水平升高，提示SNORA12表達(dá)水平降低可能通過使SLE患者T淋巴細(xì)胞和IFN-γ分泌增加，促進(jìn)SLE的發(fā)病。

3.3血液系統(tǒng)疾病 在原發(fā)性急性髓細(xì)胞白血病(AML)中最常見的染色體易位是t(8;21)，而這種易位產(chǎn)生的融合基因AML1-ETO可發(fā)揮特異性癌基因的作用，增強(qiáng)造血干細(xì)胞的自我更新能力。ZHOU等[3]發(fā)現(xiàn)，AML1-ETO誘導(dǎo)自我更新的關(guān)鍵機(jī)制就是使rRNA 2′-O-甲基化的Box C/D snoRNP增加，而該途徑也可能成為AML潛在的治療靶點(diǎn)。

4 snoRNA檢測方法

snoRNA具有作為腫瘤及其他多種疾病早期診斷、預(yù)后評估的生物標(biāo)志物的潛力，如何準(zhǔn)確檢測snoRNA的表達(dá)水平也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)是目前應(yīng)用最廣泛也是最便捷的snoRNA檢測方法之一，主要包括TaqMan探針法和熒光染料法。TaqMan探針法的優(yōu)點(diǎn)在于減少工作量，但需要根據(jù)序列合成不同的探針，成本也相對較高。熒光染料法雖然成本較低，但可能會(huì)產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物，出現(xiàn)假陽性信號，影響檢測結(jié)果。數(shù)字PCR(dPCR)是一種不需要依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線的核酸絕對定量技術(shù)。有研究發(fā)現(xiàn)，dPCR對抑制物(乙二胺四乙酸、肝素等)的耐受程度比RT-qPCR高，出現(xiàn)假陰性的概率相對較低、靈敏度較高[39]。高通量測序在snoRNA檢測方面具有數(shù)據(jù)量大、拓展性強(qiáng)的優(yōu)勢，但同時(shí)也存在局限性。由于高度同源區(qū)域的存在會(huì)使高通量測序的覆蓋范圍不足而出現(xiàn)假陰性結(jié)果，也會(huì)產(chǎn)生交叉反應(yīng)導(dǎo)致假陽性結(jié)果，而致病性突變基因的捕獲效率也會(huì)受GC含量的影響，可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。此外，測序能力取決于同時(shí)包含過濾陰性基因和標(biāo)注陽性基因的全面性數(shù)據(jù)庫，而目前也亟需具有國際性標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)庫[40]。

5 snoRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫

為了更方便快捷地研究snoRNA，目前已建立了多個(gè)相關(guān)數(shù)據(jù)庫。有主要針對snoRNA基本結(jié)構(gòu)、序列的數(shù)據(jù)庫，例如：snoRNA-LBME-db、sno/scaRNAbase數(shù)據(jù)庫等；還有為了方便查詢snoRNA基因座中核苷酸變異位點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫snoLOVD；還有更傾向于snoRNA在腫瘤方面相關(guān)研究的數(shù)據(jù)庫SNORic，其可以查詢snoRNA在腫瘤中的表達(dá)情況、生存曲線分析，以及基因的相關(guān)性分析等信息。而數(shù)據(jù)庫snoDB則整合了上述幾個(gè)數(shù)據(jù)庫的基因相關(guān)信息和多種功能，可以查詢到更全面的信息。

6 小結(jié)與展望

綜上所述，snoRNA與腫瘤及其他多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目前可以在血清、腫瘤組織等臨床標(biāo)本中檢測snoRNA，適于臨床開展。snoRNA在腫瘤的早期診斷、預(yù)后判斷等方面具有較大的潛力，甚至可以通過沉默其表達(dá)作為惡性腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)，從而有效提高腫瘤患者的生存率。