血清miR-182、SP-D水平與膿毒癥患者預(yù)后的關(guān)系*

吳梅秋，邱名耀，王海曼，黎曉虹

海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院：1.創(chuàng)傷ICU；2.急診科，海南?？?570102

膿毒癥是嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克、大手術(shù)后常見(jiàn)的并發(fā)癥及患者死亡原因之一，是由各種致病微生物感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，可進(jìn)一步導(dǎo)致多器官功能衰竭，其中肺是最易發(fā)生感染的器官[1-2]。近年來(lái)，膿毒癥發(fā)病率及病死率呈逐年上升趨勢(shì)，已對(duì)人類(lèi)健康造成嚴(yán)重威脅。既往研究多以白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其分類(lèi)、C反應(yīng)蛋白等指標(biāo)來(lái)評(píng)估膿毒癥患者的預(yù)后，但上述指標(biāo)特異度較低[3-4]。因此，積極探索與膿毒癥預(yù)后有關(guān)的分子生物學(xué)指標(biāo)，制訂完善的預(yù)后評(píng)價(jià)系統(tǒng)，將有利于防止膿毒癥患者病情惡化并改善其預(yù)后。微小RNA(miRNA)是一類(lèi)高度保守的內(nèi)源性非編碼核苷酸，在細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[5]。miRNA-182是miRNA家族的一員，定位于人7號(hào)染色體(7p32.2)，與腫瘤發(fā)生發(fā)展、炎性反應(yīng)有關(guān)[6]。肺表面活性蛋白D(SP-D)屬于C型凝集素超家族成員，參與病原體的清除及免疫反應(yīng)﹑炎性反應(yīng)和過(guò)敏反應(yīng)的調(diào)節(jié)，與肺部疾病有關(guān)[7]。目前，有關(guān)血清miR-182、SP-D在膿毒癥患者中的表達(dá)情況及與預(yù)后關(guān)系的研究較少，本研究對(duì)此進(jìn)行了相關(guān)探討，以期為臨床診治工作提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6月至2020年5月本院創(chuàng)傷ICU收治的膿毒癥患者120例作為膿毒癥組，其中男59例，女61例；年齡40～83歲，平均(62.18±10.52)歲。根據(jù)膿毒癥患者28 d時(shí)的預(yù)后情況又將其分為死亡組26例，存活組94例。另選取同期非膿毒癥引起的SIRS患者120例作為SIRS組，其中男60例，女60例；年齡40～83歲，平均(62.55±10.19)歲。選取同期健康體檢者120例作為對(duì)照組，其中男63例，女57例；年齡41～83歲，平均(62.27±10.26)歲。膿毒癥組、SIRS組與對(duì)照組性別、年齡等基線資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)膿毒癥組患者均符合膿毒癥相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，即存在感染、序貫器官衰竭評(píng)分(SOFA)[9]≥2分；(2)SIRS組患者符合SIRS相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，即體溫>38 ℃或<36 ℃，心率>90次/分，呼吸頻率>20次/分或二氧化碳分壓(PaCO2)<4.6 kPa，白細(xì)胞計(jì)數(shù)>12×109/L或<4×109/L；(3)臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近期使用免疫抑制劑治療的患者；(2)不愿意配合本研究的患者。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施，所有受試對(duì)象及其家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2儀器與試劑 SP-D酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(貨號(hào)SEA480Hu-1)購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司；Trizol試劑(貨號(hào)MN562J2)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)J6547M)、SYBR Premix Ex Taq熒光定量PCR試劑盒(貨號(hào)N5643MJ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；miR-182及內(nèi)參U6引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；熒光定量PCR分析儀(型號(hào)QuantGene 9600)購(gòu)自杭州博日科技有限公司。

1.3方法

1.3.1資料收集 收集膿毒癥組患者的臨床資料，包括性別、年齡、感染部位、降鈣素原(PCT)水平。采用急性生理與慢性健康狀況Ⅱ(APACHE Ⅱ)評(píng)分對(duì)膿毒癥組患者入院時(shí)疾病嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分，以急性生理評(píng)分、年齡評(píng)分、慢性健康評(píng)分3項(xiàng)指標(biāo)為評(píng)分依據(jù)，最高分為71分，分?jǐn)?shù)越高，病情越嚴(yán)重[11]。

1.3.2標(biāo)本采集 收集所有患者入院后24 h內(nèi)及體檢者體檢當(dāng)日空腹肘靜脈血5 mL，靜置25～30 min，室溫條件下以4 000 r/min離心10 min，取上清液，于-80 ℃冰箱中保存，備用。

1.3.3血清SP-D水平檢測(cè) 從-80 ℃冰箱中取出血清標(biāo)本，解凍，采用ELISA檢測(cè)血清SP-D水平，操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.4血清miR-182水平檢測(cè) 從-80 ℃冰箱中取出血清標(biāo)本，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，所用引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，cDNA 1 μL，H2O 8 μL，上下游引物各0.5 μL。反應(yīng)步驟：95 ℃預(yù)處理20 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算血清miR-182相對(duì)表達(dá)水平。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1對(duì)照組、SIRS組、膿毒癥組血清miR-182、SP-D水平比較 與對(duì)照組比較，SIRS組、膿毒癥組血清miR-182、SP-D水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與SIRS組比較，膿毒癥組血清miR-182、SP-D水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 對(duì)照組、SIRS組、膿毒癥組血清miR-182、SP-D水平比較

2.2存活組與死亡組臨床資料比較 存活組與死亡組性別、年齡、感染部位比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；死亡組APACHE Ⅱ評(píng)分、血清PCT水平均明顯高于存活組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 存活組與死亡組臨床資料比較

2.3存活組與死亡組血清miR-182、SP-D水平比較 與存活組比較，死亡組血清miR-182、SP-D水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 存活組與死亡組血清miR-182、SP-D水平比較

2.4膿毒癥患者血清miR-182、SP-D、PCT水平與APACHE Ⅱ評(píng)分的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，膿毒癥患者血清miR-182、SP-D、PCT水平與APACHE Ⅱ評(píng)分均呈正相關(guān)(r=0.623、0.597、0.433，P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 血清miR-182、SP-D、PCT水平與APACHE Ⅱ評(píng)分的相關(guān)性

2.5血清miR-182、SP-D水平與膿毒癥患者28 d短期生存率的關(guān)系 根據(jù)miR-182、SP-D水平均值(3.96、172.53 ng/mL)將膿毒癥患者分為miR-182高表達(dá)組(58例)與miR-182低表達(dá)組(62例)，SP-D高表達(dá)組(60例)與SP-D低表達(dá)組(60例)。miR-182高表達(dá)組與SP-D高表達(dá)組的28 d累積生存率分別為65.52%(38/58)、70.00%(42/60)；miR-182低表達(dá)組與SP-D低表達(dá)組的28 d累積生存率分別為90.32%(56/62)、86.67%(52/60)。miR-182低表達(dá)組的28 d累積生存率明顯高于miR-182高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.742，P=0.001)；SP-D低表達(dá)組的28 d累積生存率明顯高于SP-D高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.447，P=0.020)。Kaplan-Meier生存曲線見(jiàn)圖1、2。

圖1 miR-182高、低表達(dá)組患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.6膿毒癥患者死亡的危險(xiǎn)因素分析 以膿毒癥患者是否死亡為因變量，以血清miR-182、SP-D、APACHEⅡ評(píng)分、PCT水平為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，miR-182、SP-D、APACHEⅡ評(píng)分、PCT水平升高是膿毒癥患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 膿毒癥患者死亡的危險(xiǎn)因素分析

圖2 SP-D高、低表達(dá)組患者的Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

膿毒癥作為一種SIRS，由感染引起，是ICU常見(jiàn)的危重癥，極易引發(fā)多器官功能衰竭，若不及時(shí)診斷、治療，其病死率可高達(dá)80%[12]。因此，積極探尋分子生物學(xué)指標(biāo)，及早評(píng)估膿毒癥預(yù)后并及時(shí)采取相應(yīng)措施，對(duì)降低膿毒癥患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)，改善患者預(yù)后有重大意義。

miRNA是一類(lèi)非編碼短鏈RNA，長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞早期發(fā)育，參與組織細(xì)胞分化與成熟，調(diào)控基因表達(dá)[13]。研究證實(shí)，miRNA可通過(guò)影響多種靶基因的表達(dá)及生物合成來(lái)調(diào)控炎性反應(yīng)的發(fā)生[14]。miR-182的表達(dá)水平受基因轉(zhuǎn)錄和miRNA加工等調(diào)控，與免疫炎性反應(yīng)關(guān)系密切。既往研究顯示，膿毒癥大鼠血清miR-182水平明顯高于健康大鼠[15]。也有研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照者比較，早期膿毒癥患者血清miR-182水平明顯升高，可作為早期膿毒癥的診斷標(biāo)志物[16]。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥組血清miR-182水平明顯高于對(duì)照組和SIRS組，死亡組血清miR-182水平明顯高于存活組，提示血清miR-182高表達(dá)可能與膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切，原因可能是膿毒癥發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中存在著明顯的免疫功能紊亂，Toll樣受體(TLR)信號(hào)通路是發(fā)揮抗炎及修復(fù)作用的重要調(diào)節(jié)通路，涉及多種炎癥因子，而miR-182是TLR信號(hào)通路的調(diào)控因子，其與白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α等炎癥因子的產(chǎn)生有關(guān)[17]。SP-D屬于肺表面活性物質(zhì)，能降低肺表面張力，維持肺泡腔內(nèi)肺表面活性物質(zhì)磷脂的正常結(jié)構(gòu)及功能，促進(jìn)免疫系統(tǒng)對(duì)病原菌的清除，進(jìn)一步抑制炎癥因子的釋放及淋巴細(xì)胞的增生[18]。當(dāng)肺部受到感染后，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞抗凝血酶-2的完整性受損，肺血管通透性增加，促使肺泡中的SP-D向血管內(nèi)滲透，進(jìn)入血液循環(huán)，使血清中SP-D水平升高[19]。因此，血清SP-D水平變化可用于判斷膿毒癥患者病情變化及指導(dǎo)臨床治療。周江等[20]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組比較，膿毒癥組血清SP-D水平明顯升高，且SP-D水平對(duì)膿毒癥所致靶器官損傷的病情評(píng)估有一定指導(dǎo)意義。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥組血清SP-D水平明顯高于SIRS組及對(duì)照組，死亡組血清SP-D水平明顯高于存活組，提示血清SP-D高表達(dá)可能與膿毒癥發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切，原因可能是膿毒癥患者極易出現(xiàn)肺損傷，使肺血管通透性增加，促使肺泡中的SP-D向血管內(nèi)滲透，進(jìn)入血液循環(huán)，從而使血清SP-D水平異常升高。APACHEⅡ評(píng)分是根據(jù)患者年齡和既往健康狀況對(duì)生命體征進(jìn)行的評(píng)分，能夠反映疾病嚴(yán)重程度[21]。PCT與細(xì)菌感染有關(guān)，對(duì)炎性反應(yīng)有較高的敏感性及特異性[22]。本研究中，死亡組APACHE Ⅱ評(píng)分、PCT水平明顯高于存活組，提示APACHE Ⅱ評(píng)分及PCT水平與膿毒癥患者的預(yù)后有關(guān)。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，死亡組血清miR-182、SP-D、PCT水平與APACHE Ⅱ評(píng)分均呈正相關(guān)，提示miR-182、SP-D、PCT也可用于反映膿毒癥患者的病情嚴(yán)重程度。

對(duì)膿毒癥患者28 d短期預(yù)后進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)死亡的高危患者進(jìn)行甄別，并早期給予適當(dāng)干預(yù)，能夠減緩或逆轉(zhuǎn)病情惡化、減少病死率。宋中海等[23]研究顯示，血清PCT、中性粒細(xì)胞CD64百分比等指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用可評(píng)價(jià)膿毒癥患者28 d病情轉(zhuǎn)歸情況，對(duì)于制訂最佳治療方案，改善患者預(yù)后有重要意義。本研究中，miR-182低表達(dá)組28 d累積生存率明顯高于miR-182高表達(dá)組，SP-D低表達(dá)組28 d累積生存率明顯高于SP-D高表達(dá)組；且進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-182、SP-D、APACHEⅡ評(píng)分、PCT水平升高均是膿毒癥患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。說(shuō)明監(jiān)測(cè)血清miR-182、SP-D、PCT水平并及時(shí)進(jìn)行APACHEⅡ評(píng)分對(duì)臨床評(píng)估膿毒癥患者的預(yù)后有重要意義，APACHEⅡ評(píng)分、miR-182、SP-D、PCT水平升高的膿毒癥患者短期死亡風(fēng)險(xiǎn)較大，對(duì)該部分患者在治療中應(yīng)予以重點(diǎn)關(guān)注。

綜上所述，膿毒癥患者血清miR-182、SP-D水平異常升高，是患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可為膿毒癥患者臨床預(yù)后評(píng)估提供一定參考。