老年冠心病患者血清NOX2、NOX4 mRNA水平變化及其與預后的關系*

郝春霞，張曉光，徐錦華，賈明軒，勵 國

北京市豐臺中西醫(yī)結合醫(yī)院急診科，北京 100072

冠心病(CHD)是臨床常見的由冠狀動脈粥樣硬化造成血管腔狹窄、堵塞，進而引發(fā)心肌缺血、缺氧的心血管疾病，多發(fā)于老年人群，具有病死率高，預后差的特點，嚴重威脅患者的生命安全[1]。除了高血壓、高血糖、高血脂等易引發(fā)冠狀動脈粥樣硬化的傳統(tǒng)危險因素外，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)產(chǎn)生過量活性氧(ROS)引起的氧化應激也與冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展有關[2]。NOX2是NOX的一種亞型，在心力衰竭患者中表達異常，NOX2表達水平降低時可使ROS生成減少，從而改善心力衰竭患者的心功能[3]。NOX4在心力衰竭患者中的表達上調(diào)與氧化應激反應水平升高有關，NOX4可能通過影響心肌纖維化和氧化應激程度來影響心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展[4]。目前，NOX2、NOX4在老年CHD患者血清中的水平及與預后的關系報道較少。基于此，本研究通過檢測NOX2、NOX4 mRNA在老年CHD患者血清中的水平，并分析其與患者預后的相關性，以期為臨床及時診斷、有效評估患者預后提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年3月至2020年1月本院收治的老年CHD患者146例為CHD組，其中男91例，女55例；年齡61～79歲，平均(68.48±6.37)歲。并選取同期體檢健康老年人146例為對照組，其中男87例，女59例；年齡60～78歲，平均(68.16±6.25)歲。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準，所有受試者均自愿參與本研究并簽署知情同意書。納入標準：(1)符合CHD相關診斷標準[5]，且經(jīng)冠狀動脈造影檢查確診者；(2)年齡≥60歲；(3)臨床資料完整。排除標準：(1)合并急、慢性感染或免疫系統(tǒng)疾?。?2)近期發(fā)生過腦血管意外、外傷，近期有手術史；(3)合并嚴重肝腎功能不全、結締組織病或惡性腫瘤；(4)合并先天性心臟病、肺源性心臟病等；(5)合并脂肪肝、中毒性肝炎等肝臟疾?。?6)合并膽石癥、膽囊炎。

1.2儀器與試劑 Trizol試劑(批號：CD-102523GM)購自武漢純度生物科技有限公司；QuantiTect Reverse Transcription試劑盒(批號：205314)購自上海浩洋生物科技有限公司；Perfectstart Taqman qPCR master mix實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒(批號：TQ2301-01)購自北京智杰方遠科技有限公司；人丙二醛(MDA)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(批號：FK-R0433)購自上海樊克生物科技有限公司；人超氧化物歧化酶(SOD)ELISA試劑盒(批號：QN-PS0387)購自上海喬羽生物科技有限公司。Implen超微量紫外分光光度計(型號：NP-80)購自蘇州貝銳儀器科技有限公司；RT-qPCR儀(型號：ABI StepOnePlus)購自上海凌儀生物科技有限公司；多功能酶標儀(型號：SpectraMax i3x)購自美谷分子儀器(上海)有限公司。NOX2、NOX4 mRNA引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.3方法

1.3.1標本采集及預處理 采集CHD患者入院第2天及體檢者體檢當天空腹靜脈血約6 mL，靜置40 min，3 250 r/min離心8 min，分離上層血清，分裝，密封保存于-20 ℃冰箱，用于NOX2、NOX4 mRNA及MDA、SOD水平檢測。

1.3.2RT-qPCR檢測血清NOX2、NOX4 mRNA水平 取出凍存的分裝血清標本，無菌環(huán)境中解凍，添加適量Trizol試劑，提取總RNA，具體操作步驟參考Trizol試劑說明書。使用紫外分光光度計檢測RNA的完整性、濃度及純度。依照QuantiTect Reverse Transcription試劑盒說明書反轉錄得到cDNA，擴增cDNA，并進行RT-qPCR檢測。NOX2、NOX4 mRNA均以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參，引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算NOX2、NOX4 mRNA相對表達水平。

表1 NOX2、NOX4、GAPDH的引物序列

1.3.3ELISA檢測血清MDA、SOD水平 檢測所有研究對象血清MDA、SOD水平，檢測步驟嚴格參照試劑盒說明書進行。

1.4隨訪 以入院時間為起點，采用電話或門診復查的方式進行為期6個月的隨訪，以患者出現(xiàn)頑固性心絞痛、心源性猝死、心肌梗死、心力衰竭等不良心血管事件為預后不良。

2 結 果

2.1兩組血清NOX2、NOX4 mRNA及MDA、SOD水平比較 與對照組相比，CHD組血清NOX2、NOX4 mRNA及MDA水平均明顯升高(P<0.05)，血清SOD水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 兩組血清NOX2、NOX4 mRNA及MDA、SOD水平比較

2.2不同預后老年CHD患者血清NOX2、NOX4 mRNA及MDA、SOD水平比較 經(jīng)過6個月的隨訪，預后良好患者87例，預后不良患者59例。與預后良好患者相比，預后不良患者血清NOX2、NOX4 mRNA及MDA水平明顯升高(P<0.05)，血清SOD水平明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 不同預后老年CHD患者血清NOX2、NOX4 mRNA及MDA、SOD水平比較

2.3老年CHD患者血清NOX2、NOX4 mRNA水平與MDA、SOD水平的相關性 Pearson相關性分析結果顯示，老年CHD患者血清NOX2、NOX4 mRNA水平與MDA水平呈正相關(P<0.05)，與SOD水平呈負相關(P<0.05)。見表4。

表4 老年CHD患者血清NOX2、NOX4 mRNA水平與MDA、SOD水平的相關性

2.4老年CHD患者預后的影響因素分析 以老年CHD患者的預后為因變量，以血清NOX2、NOX4 mRNA及MDA、SOD水平為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，血清NOX2、NOX4 mRNA及MDA水平升高為老年CHD患者預后的獨立危險因素(P<0.05)，血清SOD水平升高為老年CHD患者預后的獨立保護因素(P<0.05)。見表5。

表5 多因素Logistic回歸分析結果

2.5血清NOX2、NOX4 mRNA水平對老年CHD患者不良預后的預測價值 ROC曲線分析結果顯示，血清NOX2 mRNA預測老年CHD患者不良預后 的曲線下面積(AUC)為0.822(95%CI:0.745～0.900)，截斷值為1.68，靈敏度、特異度分別為72.9%、86.2%。血清NOX4 mRNA水平預測老年CHD患者不良預后的AUC為0.830(95%CI:0.760～0.902)，截斷值為1.35，靈敏度、特異度分別為79.9%、74.7%。血清NOX2、NOX4 mRNA聯(lián)合預測老年CHD患者不良預后的AUC為0.943(95%CI:0.901～0.984)，靈敏度、特異度分別為85.2%、91.8%。見圖1。

圖1 血清NOX2、NOX4 mRNA預測老年CHD患者不良預后的ROC曲線

3 討 論

CHD是以動脈粥樣硬化為病理基礎的一種疾病，可導致患者死亡，對人類健康構成極大威脅[6-8]。因此，尋找有效預測老年CHD患者預后的指標，評估患者病情，對改善CHD患者預后具有重要的臨床意義。

NOX是一類具有生成ROS功能的蛋白質，分布于細胞膜上，其產(chǎn)生的ROS在自噬、細胞增殖、凋亡、衰老、抗炎、抗菌及氧化還原信號轉導等生物學過程中均起重要作用，已成為抗纖維化、炎癥、氧化應激的靶標[9-10]。NOX主要功能是產(chǎn)生過量ROS，而過量的ROS可引起心力衰竭、心律失常、心肌梗死等心血管疾病[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，NOX2在CHD患者中表達上調(diào)，經(jīng)血府逐瘀湯治療后，NOX2和ROS表達下調(diào)，提示NOX2表達異常可通過影響氧化應激，進而影響CHD的發(fā)展過程[12]。還有研究發(fā)現(xiàn)，NOX2在高血壓患者中呈高表達，α-硫辛酸可降低NOX2的表達水平，抑制氧化應激反應，抑制高血壓的發(fā)生、發(fā)展進程[13]。此外，NOX2在心力衰竭患者中表達異常，經(jīng)丹參酮ⅡA治療后，NOX2表達下調(diào)，心肌纖維化進程延緩，提示NOX2在心力衰竭患者的心肌纖維化發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[14]。以上研究均表明，NOX2表達失調(diào)與氧化應激參與的心血管疾病密切相關。本研究中CHD組血清NOX2 mRNA水平明顯高于對照組，提示NOX2可能在老年CHD的發(fā)病過程中發(fā)揮一定作用。有研究發(fā)現(xiàn)，NOX4在心肌缺血-再灌注時表達上調(diào)，經(jīng)右美托咪定作用后，其表達下調(diào)，提示NOX4可能參與并影響心肌缺血-再灌注的發(fā)生、發(fā)展過程[15]。NOX4在CHD患者外周血中呈高表達，經(jīng)有氧運動配合放松訓練后患者NOX4表達下調(diào)，且氧化應激損傷程度有所減輕，NOX4可能在CHD患者發(fā)病過程中通過影響氧化應激反應而發(fā)揮作用[16]。以上研究表明，NOX4異常表達與CHD發(fā)生、發(fā)展有關。本研究中CHD組血清NOX4 mRNA水平明顯高于對照組，提示NOX4可能參與了CHD的發(fā)生。

機體產(chǎn)生過多ROS或清除ROS的能力降低是導致氧化應激反應的主要原因，ROS可引發(fā)MDA蓄積，可作為動脈粥樣硬化及CHD的標志物[17-18]。MDA在CHD患者血清中水平較高，可能影響CHD的發(fā)生、發(fā)展過程[19]。SOD可清除體內(nèi)的ROS，在氧化應激反應中發(fā)揮重要作用，且其在CHD患者中水平下降，與CHD發(fā)生、發(fā)展關系密切[20]。本研究中，CHD組血清MDA水平明顯高于對照組，血清SOD水平明顯低于對照組，提示MDA、SOD可能參與并影響CHD的發(fā)病過程。

本研究發(fā)現(xiàn)，預后不良的老年CHD患者血清NOX2、NOX4 mRNA及MDA水平均明顯高于預后良好患者，血清SOD水平明顯低于預后良好患者，進一步提示CHD的發(fā)生、發(fā)展與氧化應激反應有關，及時監(jiān)控血清NOX2、NOX4 mRNA及MDA、SOD水平，對評估老年CHD患者的預后有一定的臨床參考價值。本研究中，老年CHD患者血清NOX2、NOX4 mRNA水平與MDA水平呈正相關，與SOD水平呈負相關，考慮其具體機制如下：NOX2、NOX4生成ROS，引起氧化應激反應，并與MDA、SOD相互作用，從而共同影響CHD的發(fā)生、發(fā)展。進一步研究顯示，NOX2、NOX4 mRNA及MDA水平升高為老年CHD患者預后的獨立危險因素，SOD水平升高為老年CHD患者預后的獨立保護因素，提示對NOX2、NOX4 mRNA及MDA、SOD水平進行及時監(jiān)控，將有助于早期評估老年CHD患者的病情發(fā)展情況。血清NOX2、NOX4 mRNA預測老年CHD患者不良預后的AUC分別為0.822、0.830，提示血清NOX2、NOX4 mRNA對老年CHD患者的預后均有一定的預測價值；血清NOX2、NOX4 mRNA聯(lián)合預測老年CHD患者預后的AUC為0.943，靈敏度為85.2%，特異度為91.8%，提示NOX2、NOX4 mRNA聯(lián)合預測老年CHD患者預后的價值高于兩項單獨預測。

綜上所述，老年CHD患者血清NOX2、NOX4 mRNA表達上調(diào)，二者均可能參與并影響CHD的發(fā)生、發(fā)展，二者聯(lián)合檢測對老年CHD患者的預后具有較高的預測價值。