OTUB2表達(dá)下調(diào)對胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力及PI3K/AKT信號通路的影響*

任舒婷，魏曉巍，任傳路△

1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇四醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇無錫 214044；2.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，江蘇南京 210011

胃癌是全球最常見的腫瘤之一，由于早期癥狀不明顯，大多數(shù)胃癌患者在確診時(shí)已處于晚期或出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1-3]。胃癌致病和轉(zhuǎn)移機(jī)制的復(fù)雜性和多因素性被認(rèn)為是降低該病患者生存率的主要原因。目前，迫切需要能早期識別胃癌進(jìn)展的關(guān)鍵分子標(biāo)志物，以幫助臨床早期治療，改善患者預(yù)后。含OTU結(jié)構(gòu)域的泛素醛結(jié)合蛋白2(OTUB2)是一種去泛素化酶，屬于卵巢腫瘤超家族蛋白，首次在果蠅卵巢腫瘤基因中被發(fā)現(xiàn)[4]。研究表明，OTUB2有廣泛的生物學(xué)作用,包括防止病毒誘導(dǎo)激活干擾素調(diào)節(jié)因子3 (IRF3)和核因子-κB(NF-κB)[5],促進(jìn)人類胰腺胰島β細(xì)胞生存[6],并維持DNA修復(fù)途徑，促進(jìn)乳腺癌和肺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[7-10]。然而關(guān)于OTUB2在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不清楚。本研究觀察了下調(diào)OTUB2對胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來源 人胃癌細(xì)胞系MGC-803購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。

1.2儀器與試劑 ABI Prism 7000熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑和Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，OTUB2小干擾RNA(si-OTUB2)及其對照si-NC購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，PrimeScript RT試劑盒和SYBR Premix ExTaq RT-PCR試劑盒購自日本Takara公司，TaqMan試劑盒購自美國BioVision公司，OTUB2和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，CCK-8試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司，基質(zhì)膠購自美國Thermo公司，兔多克隆抗體OTUB2、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、AKT、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)和GAPDH購自美國Abcam公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染 所有細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2的濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑根據(jù)說明書向MGC-803細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-OTUB2序列(si-OTUB2組)及陰性對照si-NC序列(si-NC組)，另設(shè)置空白對照組不做任何轉(zhuǎn)染處理。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測OTUB2的轉(zhuǎn)染情況。

1.3.2RT-qPCR檢測細(xì)胞中OTUB2 mRNA表達(dá)水平 采用Trizol試劑并按照說明書要求提取細(xì)胞中的總RNA；采用PrimeScript RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；采用SYBR Premix ExTaq RT-PCR試劑盒擴(kuò)增cDNA；采用ABI Prism 7000熒光定量PCR儀檢測mRNA水平。以GAPDH作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt法計(jì)算OTUB2 mRNA的表達(dá)水平。引物序列，OTUB2：上游引物5′-ACACTTGGAACCGGCTTGAC-3′，下游引物5′-AGCACACGGACTGTCCTGA-3′；GAPDH：上游引物5′-CAGCAAGAGCACAAGAGGAA-3′，下游引物5′-ATGGTACATGACAAGGTGCGG-3′。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3Western blot檢測細(xì)胞中OTUB2蛋白表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染后從細(xì)胞中分離出總蛋白，采用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白表達(dá)水平。蛋白標(biāo)本經(jīng)12% SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在脫脂乳中封閉后加入1∶1 000稀釋的一抗OTUB2和GAPDH，并在4 ℃孵育過夜，隨后用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗在室溫下孵育2 h。利用ECL檢測系統(tǒng)觀察蛋白質(zhì)。以O(shè)TUB2蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示OTUB2蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況 按照CCK-8試劑盒說明書，將4 000個(gè)處于對數(shù)生長期的MGC-803細(xì)胞接種到96孔板中，培養(yǎng)96 h。每隔24 h加入CCK-8試劑，然后孵育2 h。使用分光光度計(jì)檢測450 nm波長處的吸光度(A)值，用于反映細(xì)胞的增殖情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5Transwell小室檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：將具有8 mm孔徑的Transwell小室放入24孔板中檢測細(xì)胞的遷移能力。將200 μL細(xì)胞懸浮液(1 000個(gè)細(xì)胞)懸浮于不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，然后加入上室中。 隨后將500 μL含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基加入下室中。24 h后，用磷酸鹽緩沖液沖洗并用結(jié)晶紫染色，計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前將60 μL基底膠(50 μg/mL)加到上室板表面，孵育2 h,其余步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.6Western blot檢測細(xì)胞中PCNA、E-cadherin、N-cadherin、AKT和p-AKT蛋白表達(dá)水平 檢測步驟同1.3.3，不同的是在脫脂乳中封閉后，加入1∶1 000稀釋的一抗PCNA、E-cadherin、N-cadherin、AKT、p-AKT和GAPDH。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染si-OTUB2的胃癌細(xì)胞中OTUB2的表達(dá)情況 與空白對照組和si-NC組比較，si-OTUB2組OTUB2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。見圖1和表1。

注：1為空白對照組；2為si-NC組；3為si-OTUB2組。圖1 Western blot檢測3組細(xì)胞中OTUB2蛋白的表達(dá)情況

表1 3組細(xì)胞中OTUB2 mRNA、蛋白表達(dá)水平比較

2.2轉(zhuǎn)染si-OTUB2的胃癌細(xì)胞增殖能力的變化 與空白對照組和si-NC組比較，si-OTUB2組細(xì)胞增殖能力減弱(P<0.05)。見圖2。

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與si-NC組比較，#P<0.05。圖2 3組細(xì)胞的生長曲線

2.3轉(zhuǎn)染si-OTUB2的胃癌MGC-803細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化 與空白對照組和si-NC組比較，si-OTUB2組細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)均減少(P<0.05)。見圖3和表2。

圖3 3組細(xì)胞遷移和侵襲情況

表2 3組細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)比較個(gè))

2.4轉(zhuǎn)染si-OTUB2的胃癌細(xì)胞中PCNA、E-cadherin、N-cadherin、AKT和p-AKT蛋白表達(dá)情況 與空白對照組和si-NC組比較，si-OTUB2組細(xì)胞中PCNA、N-cadherin和p-AKT蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。見圖4和表3。

注：1為空白對照組；2為si-NC組；3為si-OTUB2組。圖4 3組細(xì)胞中PCNA、E-cadherin、N-cadherin、p-AKT和AKT蛋白的表達(dá)情況

表3 3組細(xì)胞中PCNA、E-cadherin、N-cadherin、p-AKT和AKT蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

OTUB2在調(diào)控DNA修復(fù)通路、病毒觸發(fā)信號、胰腺細(xì)胞活性和腫瘤進(jìn)展等方面發(fā)揮著重要作用。其中，OTUB2決定DNA修復(fù)途徑的選擇，在DNA雙鏈斷裂反應(yīng)的早期調(diào)節(jié)環(huán)指蛋白8(RNF8)介導(dǎo)的致死因子惡性腦瘤樣蛋白1抗體(L3MBTL1)泛素化[7]。LI等[5]研究發(fā)現(xiàn)，OTUB2可通過直接介導(dǎo)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)3和TRAF6(TRAF3和TRAF6是NF-κB所需的兩種E3泛素連接酶)的去泛素化來抑制病毒引發(fā)的Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)。此外，OTUB2在腫瘤進(jìn)展中也發(fā)揮了重要作用。MA等[11]的研究表明，OTUB2可以通過NF-κB信號通路促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。ZHANG等[9]發(fā)現(xiàn)，OTUB2通過激活不依賴于Hippo的Yes相關(guān)蛋白(YAP)和具有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子(TAZ)，促進(jìn)乳腺癌的體內(nèi)轉(zhuǎn)移。LI等[10]的研究顯示，OTUB2通過AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路穩(wěn)定U2小核RNA輔助因子2(U2AF2)，促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的瓦爾堡效應(yīng)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，OTUB2在胃癌中發(fā)揮癌基因的作用，敲減OTUB2可以顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

PCNA是一種重要的真核復(fù)制輔助因子，在DNA復(fù)制和修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著重要作用，與細(xì)胞增殖、DNA合成、腫瘤細(xì)胞的生長密切相關(guān)，是反映細(xì)胞增殖活性的重要指標(biāo)[12-14]。E-cadherin和N-cadherin是參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的相關(guān)蛋白，分別是上皮細(xì)胞標(biāo)志物和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物[15]。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的細(xì)胞生物學(xué)過程，包括一個(gè)關(guān)鍵事件EMT，EMT通過促進(jìn)上皮細(xì)胞去極性，減少上皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，從而促使良性腫瘤發(fā)展為惡性轉(zhuǎn)移性腫瘤[16]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)OTUB2的表達(dá)后，胃癌細(xì)胞中PCNA和N-cadherin蛋白的表達(dá)水平均明顯降低，E-cadherin蛋白的表達(dá)水平升高，進(jìn)一步驗(yàn)證了下調(diào)OTUB2可以抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的結(jié)論。

PI3K/AKT通路的改變廣泛存在于包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤中，對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起著至關(guān)重要的作用，其中AKT在被PI3K磷酸化后激活，可促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[17-18]。此外，PI3K/AKT通路參與細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和EMT等多種生物學(xué)過程[19-20]。本研究在胃癌細(xì)胞中敲減OTUB2基因，從而顯著抑制了PI3K/AKT信號通路中p-AKT的表達(dá)，說明下調(diào)OTUB2的表達(dá)可能是通過抑制PI3K/AKT信號通路活化來抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述，在胃癌細(xì)胞中，下調(diào)OTUB2的表達(dá)能顯著抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，其作用機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT信號通路有關(guān)。OTUB2有望成為胃癌的潛在預(yù)后評估指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。