SIRT3過(guò)表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的遷移與侵襲*

宋春麗，張 琰，周義文

南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心,廣東深圳 518100

肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，其起病隱匿、進(jìn)展迅速、惡性程度高、病死率高[1]。sirtuin蛋白家族是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依賴的組蛋白去乙?；?，包括沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT)1～SIRT7。其中，SIRT3是線粒體內(nèi)主要的去乙?；?，其在被線粒體基質(zhì)加工肽酶切割后活化，全長(zhǎng)SIRT3駐留在細(xì)胞核中，在相關(guān)因素(例如DNA損傷)影響下，SIRT3會(huì)遷移到線粒體內(nèi)。SIRT3目前已知的功能包括參與細(xì)胞凋亡、能量代謝、熱量限制、氧化應(yīng)激等[2-6]。近年來(lái)，關(guān)于SIRT3在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。本研究在肝癌細(xì)胞株Huh-7中轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1質(zhì)粒(對(duì)照)及SIRT3質(zhì)粒，用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)來(lái)探索SIRT3基因過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1材料來(lái)源 人肝癌細(xì)胞株Huh-7來(lái)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。

1.2儀器與試劑 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)電泳儀、電轉(zhuǎn)膜儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)擴(kuò)增儀均購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；高速低溫離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)艾本德股份有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Genecopoeia公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、二甲基亞砜(DMSO)、青鏈霉素雙抗購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾公司；對(duì)照pc-DNA3.1質(zhì)粒、構(gòu)建在載體pc-DNA3.1上的SIRT3質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Addgene公司；SIRT3引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；SYBR Green PCR反應(yīng)混合液購(gòu)自瑞士Roche公司；反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；SIRT3抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自美國(guó)GE公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株Huh-7培養(yǎng)于10%高糖DMEM培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清)，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿的80%后進(jìn)行傳代，接種于6孔板中，每孔約8×104個(gè)細(xì)胞;于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用對(duì)照pc-DNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞(對(duì)照組)，用SIRT3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)，24 h后換液，轉(zhuǎn)染72 h后兩組均進(jìn)行RT-qPCR和Western blot檢測(cè)。

1.3.2RT-qPCR檢測(cè)SIRT3 mRNA表達(dá)水平 提取細(xì)胞總RNA，以隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，于-20 ℃下保存。取1.0 μL cDNA，SIRT3上、下游引物各0.2 μL及 5.0 μL SYBR Green PCR反應(yīng)混合液，并補(bǔ)充去RNA酶水3.6 μL構(gòu)建成10.0 μL反應(yīng)體系，進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:95 ℃ 2 min(預(yù)變性)、94 ℃ 20 s(變性)、60 ℃ 20 s(退火)、72 ℃ 20 s(延伸)、72 ℃ 1 s，34個(gè)循環(huán)。采用RT-qPCR擴(kuò)增儀進(jìn)行SIRT3相對(duì)定量分析，SIRT3上游引物：5′-ATCGATGGGCTTGAGAGAGT-3′，下游引物：5′-AGGTTCCATGAGCTTCAACC-3′。β-actin 上游引物：5′-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTGAC-3′，下游引物:5′-GCTCGCTCCAACCGACTGC-3′ 。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算 SIRT3相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別取3管細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，每管重復(fù)檢測(cè)3次，檢測(cè)結(jié)果取平均值。

1.3.3Western blot 檢測(cè)SIRT3蛋白表達(dá)水平 收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，冰浴、搖床搖30 min充分裂解后離心，分離出待測(cè)蛋白。取30 μg待測(cè)蛋白標(biāo)本經(jīng)8% SDS-PAGE電泳，移至NC膜；5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗SIRT3抗體(1∶3 000),4 ℃搖床孵育12 h，洗膜3次，每次5 min；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)二抗(1∶3 000)，室溫孵育2 h，洗膜3次，每次5 min；混合發(fā)光底物作用1 min，將NC膜覆于保鮮膜下，暗箱中顯影曝光。用相同方法檢測(cè)β-actin作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Huh-7細(xì)胞的遷移能力 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組轉(zhuǎn)染72 h后用10 μL槍頭垂直于培養(yǎng)板中線，比著直尺劃線，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞3次，加入DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，通過(guò)在顯微鏡下觀察劃痕兩側(cè)細(xì)胞的距離來(lái)比較Huh-7細(xì)胞遷移情況。

1.3.5細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Huh-7細(xì)胞的侵襲能力 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組轉(zhuǎn)染24 h后用胰酶消化，上室(包被Matrigel碳酸酯濾膜，濾膜孔徑為8 μm)每孔分別加入含Huh-7細(xì)胞2×104個(gè)的DMEM培養(yǎng)基(無(wú)血清)500 μL，下室加入DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)700 μL，孵育條件為5% CO2、37 ℃、10 h。輕輕擦去上室濾膜未侵襲細(xì)胞，固定后用0.1%結(jié)晶紫染色40 min，清洗后晾干，20倍倒置顯微鏡下隨機(jī)選取兩組5個(gè)不同視野統(tǒng)計(jì)細(xì)胞侵襲數(shù)量，取其平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1兩組SIRT3 mRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組SIRT3 mRNA表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，實(shí)驗(yàn)組SIRT3質(zhì)粒在Huh-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染成功。見(jiàn)圖1。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.001。圖1 RT-qPCR檢測(cè)SIRT3 mRNA表達(dá)水平

2.2兩組SIRT3蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組SIRT3蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 Western blot檢測(cè)SIRT3蛋白表達(dá)水平

2.3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Huh-7細(xì)胞的遷移能力 劃痕48 h時(shí)，對(duì)照組兩側(cè)邊緣的細(xì)胞已向中間明顯遷移，兩側(cè)細(xì)胞間距離明顯縮短，邊緣參差不齊，遷移痕跡較重，而實(shí)驗(yàn)組兩側(cè)邊緣細(xì)胞也有緩慢遷移的跡象，但兩側(cè)細(xì)胞間的距離明顯寬于對(duì)照組，遷移距離較短。見(jiàn)圖3。

圖3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Huh-7細(xì)胞的遷移能力

2.4細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Huh-7細(xì)胞的侵襲能力 兩組細(xì)胞接種于上室10 h后收集，顯微鏡下計(jì)數(shù)，對(duì)照組每個(gè)視野為(45±5)個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組每個(gè)視野為(25±2)個(gè)細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Huh-7細(xì)胞的侵襲能力

3 討 論

SIRT3是一種去乙酰化酶，在肝臟、心臟和褐色脂肪組織等代謝活躍的部位高表達(dá)。鑒于目前越來(lái)越多的研究將腫瘤定義為代謝性疾病，而線粒體又與代謝密切相關(guān)，SIRT3作為線粒體內(nèi)主要的去乙?；福聹y(cè)其必然與腫瘤代謝有著一定聯(lián)系。SIRT3可以通過(guò)調(diào)控多種細(xì)胞代謝通路影響腫瘤細(xì)胞的代謝和生長(zhǎng)。SIRT3在一些腫瘤中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用，如SIRT3可以保護(hù)宮頸癌細(xì)胞免受基因毒性和氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞壞死，還可以通過(guò)去乙?；疜u70，增加Ku70與Bcl-2相關(guān)X蛋白(BAX)的結(jié)合，防止BAX在線粒體易位和應(yīng)激條件下引起細(xì)胞凋亡[7]；SIRT3還可使絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶2脫乙?；瑥亩龠M(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生[8]。SIRT3在其他一些腫瘤中則發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，如SIRT3在骨肉瘤中通過(guò)調(diào)節(jié)活性氧和缺氧誘導(dǎo)因子-1α發(fā)揮抑癌基因的作用[9]；此外，其還可以通過(guò)微小RNA-708-5p抑制胰腺癌的進(jìn)展[10]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，SIRT3在肝癌中表達(dá)水平明顯降低，其對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖起抑制作用，并且可以通過(guò)糖原合成酶激酶-3β/BAX途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[11]。此外，本課題組還發(fā)現(xiàn)，SIRT3通過(guò)調(diào)節(jié)P53途徑來(lái)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞老化[12]。

遷移和侵襲是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征。sirtuin蛋白家族中的一些成員也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)有影響腫瘤遷移和侵襲的能力，比如SIRT5通過(guò)調(diào)節(jié)乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶1促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[13]；SIRT6通過(guò)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2-基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)途徑促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[14]；SIRT7通過(guò)激活ERK/信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3信號(hào)通路促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[15]，其還可以通過(guò)抑制E-鈣黏蛋白促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲[16]。SIRT3與腫瘤侵襲、遷移的關(guān)系也有較多報(bào)道，如其通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪酸合酶促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[17]；通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子-1α/磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1/丙酮酸脫羥酶E1α亞蛋白抑制膽管癌的發(fā)生[18]。因此，sirtuin蛋白家族成員在不同的腫瘤組織中有不同的功能，而且同一成員在不同腫瘤中的功能也有明顯差異，說(shuō)明sirtuin家族成員的功能具有細(xì)胞和腫瘤特異性。

本研究初步探討了SIRT3對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組SIRT3 mRNA、蛋白的表達(dá)水平明顯升高，提示SIRT3過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞模型構(gòu)建成功，進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)分析過(guò)表達(dá)SIRT3對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，48 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組兩側(cè)細(xì)胞間的距離明顯寬于對(duì)照組，說(shuō)明SRIT3過(guò)表達(dá)抑制了肝癌細(xì)胞的遷移能力。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組，表明高表達(dá)SIRT3的肝癌細(xì)胞侵襲能力受到抑制，但目前關(guān)于高表達(dá)SIRT3抑制肝癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的具體分子機(jī)制尚不明確，這也將成為本課題組接下來(lái)的研究方向。

綜上所述，SIRT3與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，SIRT3的高表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞的遷移與侵襲，其有望為肝癌個(gè)體化治療和抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)提供新的方向。