兩種非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法檢測試劑在遺傳代謝病篩查中的性能比較及應(yīng)用評價*

張萬巧，韋秀娟，閆 磊，楊 曉，陳雨晗

中國人民解放軍總醫(yī)院兒科醫(yī)學(xué)部/中國人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心兒科研究所/出生缺陷防控關(guān)鍵技術(shù)國家工程實驗室/兒童器官功能衰竭北京市重點實驗室，北京 100700

遺傳代謝病(IMD)是由遺傳缺陷引起的包括生化代謝相關(guān)酶、受體及細胞膜功能異常在內(nèi)的一大類疾病的總稱[1]，其可于出生后數(shù)小時或數(shù)天內(nèi)起病，起病隱匿，臨床表現(xiàn)無特異性，常出現(xiàn)漏診、誤診[2]。在造成不可逆的神經(jīng)系統(tǒng)損害前進行新生兒篩查，實現(xiàn)及時診斷、正確干預(yù)，對降低IMD致殘率，挽救患兒生命有重要意義[3]。新生兒篩查最早實施于1960年，被證實是最成功的公共衛(wèi)生項目之一，并在全世界多個國家廣泛推行[4-5]。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)能分析干血斑中數(shù)十種氨基酸(AA)和酰基肉堿(AC)，能快速、簡便、高通量地篩查包括AA、有機酸及脂肪酸代謝異常在內(nèi)的約45種IMD，是目前常用的新生兒IMD篩查技術(shù)[6-7]。最初，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的標本前處理多運用衍生化方法，而現(xiàn)階段耗時更短、環(huán)境污染更小的非衍生化方法逐漸成為主流[8-9]。當前IMD篩查實驗室采用的非衍生化試劑種類繁多，對于這些試劑的性能特征、質(zhì)量管理尚無明確標準[10-11]。關(guān)于非衍生化篩查系統(tǒng)的性能研究多以Xevo TQD串聯(lián)質(zhì)譜儀及配套的Neobase試劑盒作為研究對象，且已有文獻證實該篩查系統(tǒng)性能穩(wěn)定，可按照常規(guī)臨床化學(xué)檢驗系統(tǒng)的相關(guān)標準進行管理[8,12]。為了對在Xevo TQD串聯(lián)質(zhì)譜儀上采用NSK試劑建立的IMD篩查系統(tǒng)進行方法學(xué)評估及臨床檢測分析，本研究在同一串聯(lián)質(zhì)譜檢測平臺上，以Neobase試劑盒為參照，同時對兩種試劑的檢測準確性、精密度、穩(wěn)定性和臨床檢測效能進行評價，以驗證NSK試劑的分析性能是否滿足臨床需求。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究所涉及標本均為濾紙干血斑，包括中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心(以下簡稱國家臨床檢驗中心)2020年全國第1次新生兒IMD串聯(lián)質(zhì)譜篩查AA和AC室間質(zhì)量評價標本，杭州寶榮科技有限公司生產(chǎn)的新生兒篩查血斑質(zhì)控品(AA、AC)及中國人民解放軍總醫(yī)院收治的住院新生兒的足底血標本和實驗室保存的患兒足底血標本。所有標本均于4 ℃保存。住院新生兒足底血標本共150份，未經(jīng)過IMD篩查，檢測結(jié)果未知。實驗室保存的患兒足底血標本20份均經(jīng)過IMD篩查，其中IMD陰性3份、陽性17份。17份陽性標本中檢出高苯丙氨酸血癥(HPA)3份、甲基丙二酸血癥5份、丙酸血癥1份、鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶缺乏癥(OTCD)2份、瓜氨酸血癥(CTLN)2份、楓糖尿癥1份、戊二酸血癥1份、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥1份及短鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥1份。

1.2儀器與試劑 Xevo TQD串聯(lián)質(zhì)譜儀、Binary HPLC Pump 1525二元高效液相泵、 2777C自動進樣器均購自美國Waters公司；MB100-4A微孔板恒溫振蕩器購自杭州奧盛科技有限公司；Neobase試劑盒(非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法多種AA、肉堿和琥珀酰丙酮測定)購自美國Perkin Elmer公司；高純氬氣和高純氮氣(99.999%，Air products)、AA同位素內(nèi)標NSK-A、游離肉堿和AC同位素內(nèi)標NSK-B均購自美國Cambridge Isotope Laboratories公司;色譜級甲醇、甲酸購自美國Fisher Scientific公司。

1.3方法

1.3.1非衍生化方法 分別取內(nèi)標NSK-A、NSK-B各1瓶，用1 mL甲醇超聲溶解45 min，然后混勻作為工作母液；工作母液用甲醇水溶液按照1∶100的比例稀釋，作為工作液。每份濾紙干血片上用打孔器取1個直徑約3.2 mm的血斑，置于96孔板中，再加入工作液100 μL；將板密封后，40 ℃振蕩孵育45 min；取上清液85 μL轉(zhuǎn)移至新的96孔板，再加入100 μL流動相，鋁箔覆蓋后上機檢測。上述前處理步驟適用于NSK試劑，Neobase試劑盒標本前處理方法參見試劑盒說明書。NSK試劑工作母液及Neobase試劑盒中的內(nèi)標均于4 ℃保存。

1.3.2質(zhì)譜方法系數(shù)校正 對NSK試劑及Neobase試劑盒在同一臺Xevo TQD串聯(lián)質(zhì)譜儀上建立數(shù)據(jù)采集的多反應(yīng)監(jiān)測方法文件。兩種試劑均采用與Neobase試劑盒批次匹配的質(zhì)控品(低、高水平)進行5次以上的重復(fù)檢測，并將各分析物的檢測結(jié)果與質(zhì)控證書上的水平賦值進行比較。按照中國醫(yī)師協(xié)會檢驗分會臨床質(zhì)譜檢驗專業(yè)委員會推薦的偏倚范圍對方法系數(shù)進行校正，保證兩種試劑的各項目檢測值都在允許范圍內(nèi)[13]。

1.3.3參考切值的確立 考慮到采用兩種試劑檢測時前處理反應(yīng)原理、分析儀器及分析標本的一致性，且各項目檢測值都溯源到Neobase試劑盒配套質(zhì)控品，因此兩種試劑均采用Neobase試劑盒說明書建議的各項目切值作為參考切值[14]。

1.3.4性能驗證 在實驗前對檢測系統(tǒng)進行維護，確認各設(shè)備處于良好的運行狀態(tài)，用同一批NSK試劑和Neobase試劑盒進行性能驗證。(1)準確性驗證：對國家臨床檢驗中心2020年全國第1次新生兒IMD串聯(lián)質(zhì)譜篩查AA和AC室間質(zhì)量評價標本進行檢測，依據(jù)該質(zhì)量評價計劃的分組及評價方法[15-16]對所得結(jié)果進行分析和對比。(2)精密度驗證：檢測低、中、高3個水平的質(zhì)控品，計算AA各項目[丙氨酸(ALA)、精氨酸(ARG)、瓜氨酸(CIT)、甘氨酸(GLY)、亮氨酸(LEU)、蛋氨酸(MET)、鳥氨酸(ORN)、苯丙氨酸(PHE)、脯氨酸(PRO)、酪氨酸(TYR)、纈氨酸(VAL)]和AC各項目[游離肉堿(C0)、乙酰肉堿(C2)、丙酰肉堿(C3)、丁酰肉堿(C4)、羥基異戊酰肉堿(C5OH)、異戊酰肉堿(C5)、戊二酰肉堿(C5DC)、己酰肉堿(C6)、辛酰肉堿(C8)、癸酰肉堿(C10)、十二酰肉堿(C12)、十四酰肉堿(C14)、十六酰肉堿(C16)、十八酰肉堿(C18)]的批內(nèi)精密度；在3個工作日內(nèi)重復(fù)上述實驗3次，計算AA、AC各項目的批間精密度。(3)穩(wěn)定性驗證：在NSK試劑及Neobase試劑盒啟用第1天、第15天、第28天，分別對低、中、高3個水平質(zhì)控品各打孔3個血斑進行檢測，計算AA、AC各項目檢測當天檢測值的均值，并進行比較。(4)臨床標本檢測性能驗證：將住院新生兒足底血標本150份及實驗室保存的患兒足底血標本20份分批在NSK試劑及Neobase試劑盒啟用第3天、第15天和第28天進行檢測；標本IMD篩查結(jié)果根據(jù)已確立的參考切值進行判斷，比較所有標本經(jīng)兩種試劑檢測后的結(jié)果。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1NSK試劑和Neobase試劑盒的差異比較 NSK試劑和Neobase試劑盒的主要差異見表1。NSK試劑中包含12種AA的同位素內(nèi)標，而Neobase試劑盒中包含11種，兩種試劑10種內(nèi)標的AA種類相同。NSK試劑特有的AA內(nèi)標為氘代天冬氨酸(2H3-ASP)和氘代谷氨酸(2H3-GLU)，Neobase試劑盒特有的AA內(nèi)標為碳十三代脯氨酸(13C5-PRO)。對于AC類內(nèi)標，NSK試劑包含8種，而Neobase試劑盒包含13種，其相較NSK試劑增加了氘代戊二酰肉堿(2H6-C5DC)、氘代己酰肉堿(2H3-C6)、氘代癸酰肉堿(2H3-C10)、氘代十二酰肉堿(2H3-C12)、氘代十八酰肉堿(2H3-C18)。雖然二者涉及的AC檢測項目相同(都是31種)，但是在13種中鏈和長鏈項目[戊二酰肉堿+羥基己酰肉堿(C5DC+C6OH)、C6、己二酰肉堿(C6DC)、C10、癸烯酰肉堿(C10∶1)、癸二烯酰肉堿(C10∶2)、C12、十二烯酰肉堿(C12∶1)、C18、十八烯酰肉堿(C18∶1)、羥基十八烯酰肉堿(C18∶1OH)、十八碳二烯酰肉堿(C18∶2)、羥基十八酰肉堿(C18OH)]的檢測中使用的內(nèi)標不同。另外，Neobase試劑盒還包含檢測琥珀酰丙酮(SA)的內(nèi)標。

表1 NSK試劑和Neobase試劑盒的主要差異

2.2準確性驗證結(jié)果 國家臨床檢驗中心2020年全國第1次新生兒IMD串聯(lián)質(zhì)譜篩查AA和AC室間質(zhì)量評價計劃包括8種AA和15種AC，共23項，每項有5個批號的質(zhì)控標本。按照國家臨床檢驗中心設(shè)定的分組原則、各項目靶值及評價方法，本研究NSK試劑檢測的23個項目中，質(zhì)控合格的(測定成績≥80%)有21項，不合格的項目為TYR(測定成績?yōu)?0%)和C10(測定成績?yōu)?5%)，測定成績達100%的項目占82.6%(19/23)。Neobase試劑盒檢測的23個項目全部合格，測定成績達100%的項目占78.3%(18/23)。

2.3精密度驗證結(jié)果 對于AA各項目，NSK試劑檢測的批內(nèi)精密度為0.22%～13.02%(均值為5.82%)，批間精密度為6.83%～14.35%(均值為10.19%)；Neobase試劑盒檢測的批內(nèi)精密度為0.11%～8.63%(均值為3.88%)，批間精密度為3.45%～7.29%(均值為5.45%)。對于AC各項目，NSK試劑檢測的批內(nèi)精密度為0.84%～18.90%(均值為8.33%)，批間精密度為8.37%～28.78%(均值為15.17%)；Neobase試劑盒檢測的批內(nèi)精密度為0.57%～12.88%(均值為5.73%)，批間精密度為4.39%～18.49%(均值為9.10%)。Neobase試劑盒檢測C5OH、C5DC、C6低水平標本和C14高水平標本的批內(nèi)精密度>10.00%，而檢測其余項目低、中、高水平標本的批內(nèi)和批間精密度均優(yōu)于NSK試劑。NSK試劑檢測AA 6個項目(ALA、LEU、ORN、PHE、PRO、VAL)中水平標本的批內(nèi)精密度存在較大偏差，而檢測AC時有7個中、長鏈項目(C5OH、C5、C5DC、C6、C10、C16、C18)多于兩個水平的精密度存在較大偏差(批內(nèi)精密度>10.00%，批間精密度>15.00%)，精密度驗證結(jié)果差于Neobase試劑盒。

2.4穩(wěn)定性驗證結(jié)果 在11個AA項目中，啟用第15天，兩種試劑在中、高水平質(zhì)控品檢測中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性[啟用第1天與第15天的檢測結(jié)果比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)]；而在低水平質(zhì)控品檢測中，兩種試劑都有項目出現(xiàn)檢測結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Neobase試劑盒啟用第1天和第28天，檢測中水平ALA、ARG、ORN、VAL，高水平ALA的結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；NSK試劑啟用第1天和第28天，檢測高水平ALA、CIT、PRO、TYR的結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。在14個AC項目中，啟用第15天，兩種試劑在中、高水平質(zhì)控品檢測中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性[啟用第1天與第15天的檢測結(jié)果比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)]；而在低水平質(zhì)控品檢測中，兩種試劑都有項目出現(xiàn)檢測結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Neobase試劑盒啟用第1天和第28天，檢測中水平C0、C2、C5OH、C5、C12、C14，高水平C2、C5DC、C6、C14的結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；NSK試劑啟用第1天和第28天，檢測高水平C2、C5DC、C14的結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表2 AA各項目穩(wěn)定性驗證結(jié)果(P)

表3 AC各項目穩(wěn)定性驗證結(jié)果(P)

2.5臨床標本檢測性能驗證結(jié)果 針對篩查結(jié)果未知的150份住院新生兒足底血標本，NSK試劑和Neobase試劑盒在啟用第3天、第15天、第28天均對同一份標本檢出HPA陽性，對其余149份標本檢測結(jié)果為陰性。在20份實驗室保存的患兒足底血標本中，針對已確證IMD陰性的3份標本，兩種試劑在啟用第3天、第15天、第28天均檢測出陰性結(jié)果；針對已確證為IMD陽性的17份標本，兩種試劑在啟用第3天、第15天、第28天的檢測結(jié)果與確證結(jié)果相符。

3 討 論

本研究在同一串聯(lián)質(zhì)譜檢測平臺上，同時對用NSK試劑構(gòu)建的篩查系統(tǒng)和配套的Neobase試劑盒篩查系統(tǒng)從準確性、精密度、穩(wěn)定性和臨床標本檢測性能4個方面進行對比和評價，以期為臨床應(yīng)用提供參考。

本研究對NSK試劑和Neobase試劑盒的主要成分進行分析發(fā)現(xiàn)，NSK試劑特有的AA內(nèi)標2H3-ASP和2H3-GLU，分別對應(yīng)檢測項目ASP和GLU。ASP是篩查CTLN Ⅰ型的一級指標，GLU是篩查N-乙酰谷氨酸合成酶缺乏癥的一級指標以及篩查OTCD和氨甲?；姿岷铣擅溉狈ΠY的二級指標。Neobase試劑盒特有的AA內(nèi)標13C5-PRO對應(yīng)檢測項目PRO，是篩查高脯氨酸血癥的一級指標；其還可額外檢測SA，SA是篩查酪氨酸血癥Ⅰ型的二級指標。因此，對于AA代謝異常類IMD的篩查，兩種試劑在檢測范圍上各有所長。對于AC類項目，相較于NSK試劑，Neobase試劑盒增加了內(nèi)標2H6-C5DC、2H3-C6、2H3-C10、2H3-C12、2H3-C18，因此，在13種中、長鏈項目的檢測上，Neobase試劑盒使用的內(nèi)標理化性質(zhì)(碳鏈長度)更接近被檢測物，理論上具有更準確的定量檢測結(jié)果。

本研究的準確性驗證中，檢測C10時Neobase試劑盒達標而NSK試劑未達標，可能與Neobase試劑盒使用2H3-C10內(nèi)標而NSK試劑使用的是氘代十四酰肉堿(2H3-C14)內(nèi)標相關(guān)。而檢測TYR時兩種試劑所用內(nèi)標相同，都是碳十三代酪氨酸(13C6-TYR)，但NSK試劑檢測時未達標，考慮與前處理操作方法有關(guān)，使用NSK試劑時，血片提取液經(jīng)流動相稀釋后再上樣，省去了V型底96孔板的使用；而使用Neobase試劑盒則是將血片提取液移入V型底96孔板中直接進樣。本研究中，NSK試劑的前處理方法雖然節(jié)省了對V型底96孔板的使用，但稀釋血片提取液可造成內(nèi)標及待測物水平降低、上樣不均一，從而導(dǎo)致檢測準確度、精密度下降。在精密度驗證中，不同檢測項目的精密度偏倚范圍相差較大，即使同一檢測項目其低、中、高水平的檢測偏倚程度也無規(guī)律可循，與已有報道類似[8,12]，推測與各檢測項目所對應(yīng)的同位素內(nèi)標的穩(wěn)定性各不相同有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，在AC 7個中、長鏈項目的檢測精密度上，Neobase試劑盒的表現(xiàn)普遍優(yōu)于NSK試劑，這可能與前面提到的內(nèi)標選擇相關(guān)。在穩(wěn)定性驗證中，啟用第1天與第15天的檢測結(jié)果比較顯示，兩種試劑對各項目低水平質(zhì)控品的檢測穩(wěn)定性低于中、高水平，考慮可能與低水平質(zhì)控品易降解及其檢測易受基質(zhì)干擾有關(guān)。兩種試劑在啟用第15天時，對各項目中、高水平質(zhì)控品的檢測均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，而在啟用第28天時有部分項目出現(xiàn)檢測穩(wěn)定性不佳的情況，特別是ALA、C2、C5DC、C14，考慮與上述項目所對應(yīng)內(nèi)標降解的快慢程度相關(guān)。后續(xù)研究為提高NSK試劑篩查的準確性和精密度，可考慮增加其內(nèi)標種類，并采取血片提取液直接上樣的方式。在臨床標本檢測性能驗證中，針對篩查結(jié)果未知的150例新生兒足底血標本及已確證篩查結(jié)果的20份患兒足底血標本，兩種試劑所得篩查結(jié)果完全一致，且與已確證結(jié)果相符，證明本實驗室構(gòu)建的NSK試劑篩查系統(tǒng)具有與Neobase試劑盒篩查系統(tǒng)一致的臨床標本檢測性能。

本研究首次對利用NSK試劑構(gòu)建的非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法IMD篩查系統(tǒng)進行臨床性能驗證和評價。對比配套的Neobase試劑盒，NSK試劑雖在檢測準確性、精密度上稍有不足，但在穩(wěn)定性上與Neobase試劑盒表現(xiàn)類似，且二者在臨床應(yīng)用中檢測結(jié)果一致。在改進非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法IMD篩查系統(tǒng)的檢測質(zhì)量上，本研究結(jié)果提示：(1)選取穩(wěn)定性更高、理化性質(zhì)更接近被測物(目標檢測物的同位素)的內(nèi)標可提高檢測精密度和準確性；(2)通過增加內(nèi)標種類來增加檢測項目，從而增加系統(tǒng)的篩查病種，提高疾病檢出率；(3)前處理后上機的血片提取液應(yīng)控制合適的體積范圍，避免因內(nèi)標或被測物過度稀釋導(dǎo)致檢測精密度、準確性下降。