逍遙散及其功效拆方對慢性鐵過載誘導的肝纖維化的影響*

周 薏，葛冰景，肖鐵剛，曹紅燕，戴彥成，闕任燁

(上海中醫(yī)藥大學附屬上海市中西醫(yī)結合醫(yī)院脾胃病科，上海 200082)

肝纖維化是一種動態(tài)可逆性的病理過程，若未采取有效措施進行干預，甚至可進展為肝硬化，嚴重危害人類的健康。肝臟鐵過載在肝纖維化發(fā)生機制中具有重要作用，它能夠誘發(fā)或加重疾病的發(fā)展，隨著鐵過載的持續(xù)，最終可導致肝硬化，甚至肝癌發(fā)生[1-2]。臨床上使用鐵螯合劑也顯示出明顯的改善肝纖維化指標作用[3]。中醫(yī)學認為鐵是體內的精微物質之一，而精微物質的轉運離不開脾之運化功能和肝之疏泄功能的正常發(fā)揮。因此，鐵代謝紊亂反映的是肝失疏泄，脾運失常。臨床上肝纖維化或肝硬化患者常常存在肝失疏泄，脾運無權等情況，以致不能將鐵轉運至血液循環(huán)中為造血器官所利用，引起貧血，并沉積于肝臟等器官，引起纖維化的發(fā)生。故肝纖維化的治療應著眼于疏肝健脾。逍遙散是中醫(yī)學疏肝健脾的經典名方，由四逆散及當歸芍藥散化裁而成。有多項臨床與實驗研究表明逍遙散具有抗肝纖維化的作用[4-6]，但其機制尚不明確。本課題組前期通過對逍遙散聯(lián)合恩替卡韋治療肝郁脾虛型乙肝后肝硬化代償期患者的隨機對照研究中發(fā)現，逍遙散具有顯著的改善纖維化作用，并能夠改善患者機體的鐵過載水平。因此，本研究擬通過右旋糖酐鐵誘導鐵過載所致大鼠肝纖維化模型，觀察逍遙散的抗肝纖維化作用是否與調節(jié)體內鐵代謝平衡有關。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

1.1.1 實驗動物 清潔級雄性SD成年大鼠，56只，體質量180～220g，購自上海市實驗動物中心，動物合格證號SCXK(滬)2013-0016，飼養(yǎng)于上海市中醫(yī)醫(yī)院無特異病原體(SPF)級動物房，恒溫(25±2)℃恒濕，人工光照12 h，黑暗12 h，自由進食飲水，本研究中的動物實驗規(guī)程遵循“實驗動物關愛和使用指南”。

1.1.2 試劑 COL-1、α-SMA免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋生物科技有限公司，蘇木素-伊紅染色液(P031IH)購于湖南艾佳生物科技股份有限公司，Masson染色液(G1340)購于北京索萊寶科技有限公司，天狼星紅染色液(DC0041)購于北京雷根生物技術有限公司，鐵標準溶液1 000 μg/mL由國家標準物質中心提供。

1.1.3 藥物配制 逍遙散準確稱取柴胡15 g，當歸15 g，白芍 15 g，白術 15 g，茯苓 15 g，甘草 7.5 g，粉碎成粗粉，加水1 500 mL煮沸，保持沸騰20 min，加入5 g煨姜和5 g薄荷，再保持沸騰煎煮10 min，煎煮液過5層紗布，濾液濃縮至2 g/mL(按生藥量計)，經冷凍干燥制成粉末，用前以蒸餾水配制成混懸液。去鐵胺配置成濃度為0.45 g/kg的去鐵胺溶液，逍遙散各拆方組按逍遙散去疏肝藥組(去柴胡、薄荷)、逍遙散去健脾藥組(去茯苓、白術、甘草)、逍遙散去養(yǎng)血藥組(去當歸、白芍)制作藥物混懸液，方法同上。

1.1.4 儀器 快速研磨儀JXFSTPRP-48(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)，多功能酶標儀Varioscan Flash(上海百基生物科技有限公司)，RM2016切片機(萊卡公司)，生物組織攤烤片機YT-6C(亞光醫(yī)用電子技術有限公司)，防脫載玻片P031IH(湖南艾佳生物科技股份有限公司)，鼓風干燥箱DHC-9070A(天津津立儀器設備科技發(fā)展有限公司)，光學顯微鏡AE41(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)，AU400型全自動生化分析儀(日本奧林巴斯公司)，JENA AA400型原子吸收分光光度計(德國JENA儀器公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及模型建立 將56只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、逍遙散全方組、逍遙散去疏肝藥組、逍遙散去健脾藥組、逍遙散去養(yǎng)血藥組、去鐵胺組，模型制作方法參照文獻[7]進行，每日予腹腔注射50 mg/kg右旋糖酐鐵，連續(xù)7周，對照組予腹腔注射同等劑量的生理鹽水。各藥物干預組在造模同時給予灌胃各組對應的治療藥物10 mL/(kg·d-1)灌胃，對照組及模型組按體質量給予灌胃等量生理鹽水。所有組大鼠7周后處死，取血清、肝組織標本。血清標本用蛋白酶抑制劑處理，-20℃中保存?zhèn)溆?；用全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST、SI、SF。肝組織標本用含0.01%DEPC的生理鹽水清洗后保存于-80℃中，部分標本用中性福爾馬林固定12 h后經石蠟包埋，3～5 μm厚連續(xù)切片備檢。

1.2.2 肝臟病理組織檢查 病理組織學采用HE染色、Masson染色、苦味酸-天狼星染色3種染色方法，取備檢石蠟切片經脫蠟、水化、染色、分化、透明、封片、鏡檢，分別觀察病變與纖維化程度，使用Ishak評分對HE染色切片進行量化比較，ImagePro Plus軟件進行半定量分析Masson染色、苦味酸-天狼星染色結果。

1.2.3 免疫組化檢測α-SMA及COL-1表達 石蠟切片經脫蠟、水化，抗原修復冷卻后，3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶的活性，血清封閉，孵育一抗、孵育二抗，DAB顯色，蘇木素復染、脫水、透明后封片、鏡檢，觀察α-SMA及COL-1表達，并使用ImagePro Plus軟件進行半定量分析。

1.2.4 大鼠肝臟總鐵含量檢測 按照文獻 [8]報道，采用火焰原子吸收光譜法測定。

1.3 統(tǒng)計學分析 本實驗結果采用SPSS 23.0軟件進行數據分析，實驗所涉及數據中符合正態(tài)分布的計量資料采用均數±標準差(±s)表示，不符合正態(tài)分布的計量資料或計數資料采用中位數(M)、四分位數(Q)表示；對于計量資料，符合正態(tài)分布且方差齊者，采用One-way ANOVA LSD統(tǒng)計方法處理數據，對于計數資料，采用卡方檢驗統(tǒng)計分析，最終結果以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠血清肝損傷指標檢測 與對照組比較，模型組大鼠血清ALT、AST水平顯著升高(P＜0.05)，逍遙散全方及各功效拆方組均可顯著抑制慢性鐵過載誘導的肝細胞損害，陽性對照藥與逍遙散全方組結果相仿(P＜0.05)。逍遙散去疏肝藥組、逍遙散去健脾藥組、逍遙散去養(yǎng)血藥組與逍遙散全方組相比，療效均顯著降低(P＜0.05)。見表1。

表1 逍遙散及各功效拆方對慢性鐵過載誘導的大鼠肝纖維化肝功能的影響

2.2 大鼠肝臟病理組織學檢測 HE染色顯示對照組無炎癥細胞浸潤，肝細胞多，膽管少，肝小葉結構完整，無明顯脂肪浸潤。模型組可見匯管區(qū)大量炎細胞浸潤，中央靜脈與肝血竇擴張淤血，匯管區(qū)纖維組織增生，肝小葉間膽管明顯增生，部分分割包繞形成假小葉，Ishak評分較對照組顯著升高(P＜0.05)。逍遙散全方及各功效拆方組與模型組比較均有不同程度的改善作用，Ishak評分均有不同程度的降低(P＜0.05)。陽性對照藥與逍遙散全方組結果相仿(P＜0.05)。逍遙散去疏肝藥組、逍遙散去健脾藥組、逍遙散去養(yǎng)血藥組與逍遙散全方組相比，療效均顯著降低(P＜0.05)。見圖 1、表2。

圖1 逍遙散及各功效拆方對慢性鐵過載誘導的大鼠肝纖維化病理組織學HE染色的影響（×100）

Masson染色及苦味酸-天狼星紅染色可見對照組僅在中央靜脈壁和匯管區(qū)間有極少量膠原纖維沉積，模型組可見膠原纖維沉積顯著增加，增生的小膽管及其周圍的膠原纖維形成間隔，部分與臨近的增生間隔相互連接、包繞、分割，形成假小葉(P＜0.05)。逍遙散全方及各功效拆方組對膠原纖維增生均有不同程度的明顯減輕，纖維間隔變窄，假小葉形成減少(P＜0.05)。陽性對照藥與逍遙散全方組結果相仿(P＜0.05)。逍遙散去疏肝藥組、逍遙散去健脾藥組、逍遙散去養(yǎng)血藥組與逍遙散全方組相比，療效均顯著降低(P＜0.05)。見圖 2、圖 3，表 2。

圖2 逍遙散及各功效拆方對慢性鐵過載誘導的大鼠肝纖維化病理組織學Masson染色的影響（×100）

圖3 逍遙散及各功效拆方對慢性鐵過載誘導的大鼠肝纖維化病理組織學苦味酸-天狼星紅的影響（×100）

表2 逍遙散及各功效拆方對慢性鐵過載誘導的大鼠肝纖維化病理組織學的影響

2.3 大鼠肝臟免疫組織化學檢測 對照組僅見極少量α-SMA和COL-1表達，模型組可見在匯管區(qū)、纖維間隔區(qū)α-SMA和COL-1明顯表達(P＜0.05)。逍遙散全方及各功效拆方組α-SMA和COL-1表達均有不同程度的明顯降低(P＜0.05)。陽性對照藥與逍遙散全方組結果相仿(P＜0.05)。逍遙散去疏肝藥組、逍遙散去健脾藥組、逍遙散去養(yǎng)血藥組與逍遙散全方組相比，療效均顯著降低(P＜0.05)。見圖4、圖5、表3。

圖4 逍遙散及各功效拆方對慢性鐵過載誘導的大鼠肝纖維化免疫組化α-SMA表達的影響（×100）

圖5 逍遙散及各功效拆方對慢性鐵過載誘導的大鼠肝纖維化免疫組化COL-1表達的影響（×100）

表3 逍遙散及各功效拆方對慢性鐵過載誘導的大鼠肝纖維化免疫組化的影響

2.4 大鼠鐵代謝相關指標檢測 與對照組相比，模型組血清鐵、鐵蛋白及肝臟總鐵含量均顯著升高(P＜0.05)。逍遙散全方及各功效拆方組血清鐵、鐵蛋白及肝臟總鐵含量均有不同程度的明顯降低(P＜0.05)。陽性對照藥與逍遙散全方組結果相仿(P＜0.05)。逍遙散去疏肝藥組、逍遙散去健脾藥組、逍遙散去養(yǎng)血藥組與逍遙散全方組相比，療效均顯著降低(P＜0.05)。見表4。

表4 逍遙散及各功效拆方對慢性鐵過載誘導的大鼠肝纖維化鐵代謝指標的影響

3 討論

肝纖維化是一種動態(tài)可逆性的病理過程，若未采取有效措施進行干預，甚至可進展為肝硬化，嚴重危害人類的健康。因此，在肝纖維化階段及早采用藥物進行有效干預，是防治肝硬化的重要治療策略。西醫(yī)學對肝纖維化、肝硬化迄今沒有滿意的治療方法。所以，尋找有效的治療手段仍是防治肝硬化研究領域的難點及熱點。中醫(yī)學認為肝硬化發(fā)病早期病位常常在肝，隨著病情的不斷惡化與進展，最終使脾腎受累。肝硬化其病理因素一般為氣滯、血瘀、水濕，這三者往往互為因果，相互為病，致使疾病錯綜復雜，因此肝硬化一旦到晚期則殊難治療，預后較差。綜上所述，臨床上肝郁脾虛證在乙肝后肝硬化代償期時較為多見，而針對這一時期進行有效的規(guī)范化治療能夠取得較好的效果。

肝臟是體內主要的鐵貯存部位，在對機體鐵穩(wěn)態(tài)的調節(jié)中起著中心和樞紐的作用。鐵過載引起的肝損傷在多種急慢性肝損傷疾病或動物模型引起的肝纖維化中均可能出現，如酒精性肝病，非酒精性脂肪性肝炎，CCL4、DMN等毒性藥物引起肝纖維化，遺傳性血色病，丙型肝炎等[9-14]。有研究發(fā)現，乙型肝炎、乙肝后肝硬化患者血清中鐵含量、總鐵結合力、鐵蛋白等指標均較健康人顯著升高，且與疾病的嚴重程度成正相關[15-16]。因此，有理由相信，鐵代謝紊亂在肝纖維化、肝硬化發(fā)生發(fā)展中起著十分重要的作用。

中醫(yī)學未有對鐵的直接描述，而可以認為鐵是體內的水谷精微物質之一，而精微物質的轉運離不開脾之運化功能及肝之疏泄功能的正常發(fā)揮。正如羅梅宏等[17-18]發(fā)現脾運無力在缺鐵性貧血的發(fā)病過程中的具有重要作用，通過臨床與實驗皆證實了通過運脾法能夠顯著調節(jié)機體的鐵代謝平衡。因此可以理解為中焦脾胃在精微物質鐵的吸收轉運及最終參與生成血液的過程中有著十分重要的作用，故而有“脾胃是氣血生化之源”之說。而肝臟主疏泄而藏血，在血液形成過程中亦有舉足輕重的作用。水谷精微源于脾胃，脾胃納化水谷，輸布精微，賴肝氣為之疏泄。故《血證論》說：“食氣入胃，全賴肝木之氣以疏泄之而水谷乃化。”因此，鐵代謝紊亂反映的是肝失疏泄和脾運失常。臨床上肝纖維化或肝硬化患者常常存在肝失疏泄和脾運無權等情況，以致不能將鐵轉運至血液循環(huán)中為造血器官所利用，引起貧血，并沉積于肝臟等器官，引起纖維化的發(fā)生，故在治療上應著眼于疏肝健脾。

逍遙散是中醫(yī)學疏肝健脾的經典名方，在臨床上廣泛應用于慢性肝炎、肝硬化、膽石癥、胃及十二指腸潰瘍、慢性胃炎、胃腸神經官能癥、經前期緊張癥、乳腺小葉增生。課題組前期通過對逍遙散聯(lián)合恩替卡韋治療肝郁脾虛型乙肝后肝硬化代償期患者的隨機對照研究中發(fā)現，逍遙散具有顯著的改善纖維化作用，并能夠改善患者機體的鐵過載水平[19]?；诖宋覀兲岢隽酥笇нM一步研究的假說：逍遙散通過疏肝健脾之法調節(jié)機體鐵轉運，又通過其養(yǎng)血之能，促進鐵利用?？偠灾?，其疏肝、健脾、養(yǎng)血之功效均參與了對機體鐵穩(wěn)態(tài)的調節(jié)進而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。為此我們開展了實驗驗證工作，結果表明，逍遙散能顯著改善慢性鐵過載誘導的大鼠肝纖維化，主要表現在降低血清ALT、AST水平，改善纖維化病理表現及抑制肝星狀細胞活化指標如α-SMA和COL-1表達。而逍遙散的這些作用也已在其他肝纖維化模型中所證實[20-21]。而我們進一步檢測了各組大鼠血清中鐵及鐵蛋白含量及肝臟總鐵含量的變化，發(fā)現逍遙散可顯著減大鼠體內鐵過載水平。隨后我們又通過功效拆方，將逍遙散全方中疏肝藥(柴胡、薄荷)、健脾藥(茯苓、白術、甘草、生姜)、養(yǎng)血藥(當歸、白芍)進行拆解研究，結果表明逍遙散去疏肝藥組、逍遙散去健脾藥組、逍遙散去養(yǎng)血藥組與逍遙散全方組在改善肝細胞損傷、纖維化及鐵過載方面均有顯著差異，提示整方無論去除疏肝藥、健脾藥或養(yǎng)血藥均對整方療效有顯著影響，換而言之，逍遙散中疏肝、健脾、養(yǎng)血之功效都參與了機體鐵穩(wěn)態(tài)的調節(jié)進而發(fā)揮了抗肝纖維化的作用。

綜上所述，中藥復方逍遙散是臨床上疏肝健脾的代表方劑，其疏肝、健脾、養(yǎng)血功效均與維持機體鐵穩(wěn)態(tài)相關，因此有理由相信，其能夠重塑肝臟鐵穩(wěn)態(tài)進而發(fā)揮其抗纖維化作用，但具體調控鐵代謝的機制仍需進一步研究。本課題的設計完成，不僅對完善中醫(yī)學鐵代謝的理論認知起到促進作用，更關鍵的是對傳統(tǒng)方藥逍遙散的組方功效進行了創(chuàng)新性的解釋，為逍遙散調節(jié)機體鐵穩(wěn)態(tài)提供了理論及實驗基礎，為中藥復方研究的快速發(fā)展提供了新的思路。